Although the protein synthesis inhibitor cycloheximide (CHX) has been known for decades, its precise mechanism of action remains incompletely understood. The glutarimide portion of CHX is seen in a family of structurally related natural products including migrastatin, isomigrastatin and lactimidomycin (LTM). We found that LTM, isomigrastatin and analogs have a potent antiproliferative effect on tumor cell lines and selectively inhibit translation. A systematic comparative study of the effects of CHX and LTM on protein synthesis revealed both similarities and differences between the two inhibitors. Both LTM and CHX were found to block the translocation step in elongation. Footprinting experiments revealed protection of a single cytidine nucleotide (C3993) in the E-site of the 60S ribosomal subunit, thus defining a common binding pocket for the two inhibitors in the ribosome. These results shed new light on the molecular mechanism of inhibition of translation elongation by both CHX and LTM.

The mechanism of ribosome binding to eucaryotic mRNAs is not well understood, but it requires the participation of eucaryotic initiation factors eIF-4A, eIF-4B, and eIF-4F and the hydrolysis of ATP. Evidence has accumulated in support of a model in which these initiation factors function to unwind the 5'-proximal secondary structure in mRNA to facilitate ribosome binding. To obtain direct evidence for initiation factor-mediated RNA unwinding, we developed a simple assay to determine RNA helicase activity, and we show that eIF-4A or eIF-4F, in combination with eIF-4B, exhibits helicase activity. A striking and unprecedented feature of this activity is that it functions in a bidirectional manner. Thus, unwinding can occur either in the 5'-to-3' or 3'-to-5' direction. Unwinding in the 5'-to-3' direction by eIF-4F (the cap-binding protein complex), in conjunction with eIF-4B, was stimulated by the presence of the RNA 5' cap structure, whereas unwinding in the 3'-to-5' direction was completely cap independent. These results are discussed with respect to cap-dependent versus cap-independent mechanisms of ribosome binding to eucaryotic mRNAs.

A sequence comparison of nine functionally different GTP-binding protein families has yielded further information on the general characterization of the conservation and importance of amino acid sequences in the GTP-binding domain, including a consensus sequence composed of three consensus elements GXXXXGK, DXXG, and NKXD with consensus spacings of either 40-80 or approximately equal to 130-170 amino acid residues between the first and second elements and approximately 40-80 amino acid residues between the second and third sequence elements; the sequence NKXW in place of NKXD in the sequence element responsible for base specificity allows the use of ITP as well as GTP; dGTP can be used with essentially the same efficiency as GTP; signal transducing proteins and enzymes have been identified in the nine families; and family conservations allow the identification of the most probable consensus sequence element when more than one is present. Employing these features we have screened the protein sequence data base of the Protein Identification Resource and have identified only known GTP-binding proteins with the exception of protein 2C from foot-and-mouth disease virus as matching the consensus sequence. Based on this finding we predict that foot-and-mouth disease virus protein 2C binds GTP and, by analogy, that protein 2C from several related viruses (polio, rhino, encephalomyocarditis, and cowpea mosaic) will bind a nucleotide as part of its biologic activity.

MicroRNAs (miRNAs) play an important role in gene regulatory networks in animals. Yet, the mechanistic details of their function in translation inhibition or messenger RNA (mRNA) destabilization remain controversial. To directly examine the earliest events in this process, we have developed an in vitro translation system using mouse Krebs-2 ascites cell–free extract that exhibits an authentic miRNA response. We show here that translation initiation, specifically the 5′ cap recognition process, is repressed by endogenous let-7 miRNAs within the first 15 minutes of mRNA exposure to the extract when no destabilization of the transcript is observed. Our results indicate that inhibition of translation initiation is the earliest molecular event effected by miRNAs. Other mechanisms, such as mRNA degradation, may subsequently consolidate mRNA silencing.

Pdcd4 is a novel transformation suppressor that inhibits tumor promoter-induced neoplastic transformation and the activation of AP-1-dependent transcription required for transformation. A yeast two-hybrid analysis revealed that Pdcd4 associates with the eukaryotic translation initiation factors eIF4AI and eIF4AII. Immunofluorescent confocal microscopy showed that Pdcd4 colocalizes with eIF4A in the cytoplasm. eIF4A is an ATP-dependent RNA helicase needed to unwind 5′ mRNA secondary structure. Recombinant Pdcd4 specifically inhibited the helicase activity of eIF4A and eIF4F. In vivo translation assays showed that Pdcd4 inhibited cap-dependent but not internal ribosome entry site (IRES)-dependent translation. In contrast, Pdcd4D418A, a mutant inactivated for binding to eIF4A, failed to inhibit cap-dependent or IRES-dependent translation or AP-1 transactivation. Recombinant Pdcd4 prevented eIF4A from binding to the C-terminal region of eIF4G (amino acids 1040 to 1560) but not to the middle region of eIF4G(amino acids 635 to 1039). In addition, both Pdcd4 and Pdcd4D418A bound to the middle region of eIF4G. The mechanism by which Pdcd4 inhibits translation thus appears to involve inhibition of eIF4A helicase, interference with eIF4A association-dissociation from eIF4G, and inhibition of eIF4A binding to the C-terminal domain of eIF4G. Pdcd4 binding to eIF4A is linked to its transformation-suppressing activity, as Pdcd4-eIF4A binding and consequent inhibition of translation are required for Pdcd4 transrepression of AP-1.

The abbreviations used are: eIF, eukaryotic initiation factor; &pes, 4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazineethanesulfonic acid; Na-DodSO,, sodium dodecyl sulfate; CBP I, cap binding protein of -24,@3?CBP 11, cap binding protein complex containing CBP I and other polypeptides as described.

Interaction of protein synthesis initiation factors with mRNA has been studied in order to characterize early events in the eukaryotic translation pathway. Individual reovirus mRNAs labeled with 32P in the alpha position relative to the m7G cap and eukaryotic initiation factor (eIF)-4A, -4B, and -4F purified from rabbit reticulocytes were employed. It was found that eIF-4A causes a structural change in mRNA, as evidenced by a nuclease sensitivity test: addition of high concentrations of eIF-4A greatly increase the nuclease sensitivity of the mRNA, suggesting that this factor can melt or unwind mRNA structure. ATP is required for this reaction. At low concentrations of eIF-4A, addition of eIF-4B is required for maximal unwinding activity. Thus eIF-4B enhances eIF-4A activity. Addition of eIF-4F also makes the mRNA sensitive to nuclease indicating a similar unwinding role to that of eIF-4A. Stoichiometric comparisons indicate that eIF-4F is more than 20-fold more efficient than eIF-4A in catalyzing this reaction. The unwinding activity of eIF-4F is inhibited by m7GDP, while that of eIF-4A is not. This suggests that eIF-4A functions independent of the 5' cap structure. Our results also suggest that the unwinding activity of eIF-4F is located in the 46,000-dalton polypeptide of this complex, which has shown by others to be similar or identical to eIF-4A.

Research Article1 March 1994free access Dominant negative mutants of mammalian translation initiation factor eIF-4A define a critical role for eIF-4F in cap-dependent and cap-independent initiation of translation. A. Pause A. Pause Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author N. Méthot N. Méthot Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author Y. Svitkin Y. Svitkin Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author W.C. Merrick W.C. Merrick Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author N. Sonenberg N. Sonenberg Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author A. Pause A. Pause Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author N. Méthot N. Méthot Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author Y. Svitkin Y. Svitkin Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author W.C. Merrick W.C. Merrick Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author N. Sonenberg N. Sonenberg Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. Search for more papers by this author Author Information A. Pause1, N. Méthot1, Y. Svitkin1, W.C. Merrick1 and N. Sonenberg1 1Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada. The EMBO Journal (1994)13:1205-1215https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1994.tb06370.x PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Eukaryotic translation initiation factor-4A (eIF-4A) plays a critical role in binding of eukaryotic mRNAs to ribosomes. It has been biochemically characterized as an RNA-dependent ATPase and RNA helicase and is a prototype for a growing family of putative RNA helicases termed the DEAD box family. It is required for mRNA-ribosome binding both in its free form and as a subunit of the cap binding protein complex, eIF-4F. To gain further understanding into the mechanism of action of eIF-4A in mRNA-ribosome binding, defective eIF-4A mutants were tested for their abilities to function in a dominant negative manner in a rabbit reticulocyte translation system. Several mutants were demonstrated to be potent inhibitors of translation. Addition of mutant eIF-4A to a rabbit reticulocyte translation system strongly inhibited translation of all mRNAs studied including those translated by a cap-independent internal initiation mechanism. Addition of eIF-4A or eIF-4F relieved inhibition of translation, but eIF-4F was six times more effective than eIF-4A, whereas eIF-4B or other translation factors failed to relieve the inhibition. Kinetic experiments demonstrated that mutant eIF-4A is defective in recycling through eIF-4F, thus explaining the dramatic inhibition of translation. Mutant eIF-4A proteins also inhibited eIF-4F-dependent, but not eIF-4A-dependent RNA helicase activity. Taken together these results suggest that eIF-4A functions primarily as a subunit of eIF-4F, and that singular eIF-4A is required to recycle through the complex during translation. Surprisingly, eIF-4F, which binds to the cap structure, appears to be also required for the translation of naturally uncapped mRNAs. Previous ArticleNext Article Volume 13Issue 51 March 1994In this issue RelatedDetailsLoading ...

Protein synthesis initiation factors prepared from rabbit reticulocyte and mouse ascites ribosomes were tested for the ability to crosslink to the 5' cap of mRNA. Crosslinking of one polypeptide of apparent molecular weight 24,000 was inhibited by the cap analogs, m7GMP and m7GDP, indicating a specific interaction with the cap. Although specific crosslinking of the 24,000 molecular weight polypeptide was found with eukaryotic initiation factor 3 and to a lesser extent with initiation factor 4B, both of these factors contained less than stoichiometric amounts of this polypeptide. The crosslinking method provides a highly sensitive and specific assay for cap-binding proteins and should facilitate their purification for functional studies.

Summary Mammalian cells have to adapt to environmental challenges that range from mild to severe stress. While the cellular response to mild stress has been widely studied, how cells respond to severe stress remains unclear. We show here that under severe stress conditions, cells induce a transient hibernation-like mechanism that anticipates recovery. We demonstrate that this A daptive P ausing R esponse (APR) is a coordinated cellular response that limits ATP supply and consumption though mitochondrial fragmentation and widespread pausing of mRNA translation. This pausing is accomplished by ribosome stalling at translation initiation codons, which keeps mRNAs poised to resume translation upon recovery from severe stress. We further show that recovery from severe stress involves adaptive ISR (Integrated Stress Response) signaling that in turn permits cell cycle progression, resumption of growth, and reversal of mitochondria fragmentation. Our findings indicate that cells can respond to severe stress through the APR, a mechanism that preserves vital elements of cellular function under harsh environmental conditions.