Background

 Clinical success with chimeric antigen receptor (CAR)- based immunotherapy for leukemia has been accompanied by the associated finding that antigen-escape variants of the disease are responsible for relapse. To target hematologic malignancies with a chimeric antigen receptor (CAR) that targets two antigens with a single vector, and thus potentially lessen the chance of leukemic escape mutations, a tandem-CAR approach was investigated. 

Methods

 Antigen binding domains from the FMC63 (anti-CD19) and Leu16 (anti-CD20) antibodies were linked in differing configurations to transmembrane and T cell signaling domains to create tandem-CARs. Expression on the surface of primary human T cells was induced by transduction with a single lentiviral vector (LV) encoding the tandem-CAR. Tandem-CARs were compared to single antigen targeting CARs in vitro and in vivo, and to an admixture of transduced cells expressing each CAR in vivo in immunodeficient (NSG) disease-bearing mice. 

Results

 Tandem constructs efficient killed the Raji leukemia cell line both in vitro and in vivo. Tandem CARs generated less cytokine than the CD20 CAR, but similar to CD19 CARs, on their own. In co-culture experiments at low effector to target ratios with both single- and tandem- CAR-T cells, a rapid down-modulation of full-length CD19 expression was seen on leukemia targets. There also was a partial down-modulation of CD22, and to a lesser degree, of CD20. Our data also highlight the extreme sensitivity of the NALM-6 cell line to general lymphocyte-mediated cytotoxicity. While single and tandem constructs were effective in vivo in a standard setting, in a high-disease burden setting, the tandem CAR proved both effective and less toxic than an admixture of transduced T cell populations expressing single CARs. 

Conclusion

 Tandem CARs are equally effective in standard disease models to single antigen specificity CARs, and may be both more effective and less toxic in a higher disease burden setting. This may be due to optimized cell killing with more moderate cytokine production. The rapid co-modulation of CD19, CD20, and CD22 may account for the ability to rapidly evolve escape mutants by selecting for leukemic clones that not require these target antigens for continued expansion.

An increasing number of clinical studies have begun to explore combination strategies with immune checkpoint inhibitors, aiming to present new opportunities for overcoming anti-PD-1 treatment resistance in gastric cancer. Unfortunately, the exploration of certain immune checkpoint inhibitor combination strategies has yielded suboptimal results. Therefore, it is necessary to comprehensively analyze the expression patterns of immune checkpoints and identify optimal combination regimens of anti-PD-1 inhibitors with other immune checkpoint inhibitors.

Abstract Background Chromosomal 1q gains and amplifications (+1q21) are frequently observed in patients with newly diagnosed multiple myeloma (NDMM). However, the interpretation of the high‐risk (HR) prognostic implications stemming from 1q21 abnormalities remain challenging to implement effectively. Methods In a comprehensive analysis of 367 consecutive patients with symptomatic MM, we assessed the prognostic significance of +1q21 using FISH with a threshold of 7.4%. The patient cohort was randomly divided into a training set (66.5%, n = 244) and a validation set (33.5%, n = 133). A multivariate Cox regression analysis was conducted to identify significant prognostic factors associated with PFS. Weight scores were assigned to each risk factor based on the β‐value of the corresponding regression coefficient. A predictive risk‐scoring model involving +1q21 was then developed, utilizing the total score derived from these weight scores. The model's discriminative ability was evaluated using the AUC in both the training and validation sets. Finally, we compared the performance of the +1q21‐involved risk with the established R‐ISS and R2‐ISS models. Results Upon initial diagnosis, 159 patients (43.32%) exhibited +1q21, with 94 (59.11%) having three copies, referred to as Gain(1q21), and 65 (40.89%) possessing four or more copies, referred to as Amp (1q21). Both were significantly linked to a reduced PFS in myeloma ( p < 0.05), which could be effectively mitigated by ASCT. The +1q21‐involved risk model, with an AUC of 0.697 in the training set and 0.725 in the validation set, was constructed including Gain(1q21), Amp(1q21), no‐ASCT, and TP53 deletion. This model, termed the ultra‐high‐risk (UHR) model, demonstrated superior performance in predicting shorter PFS compared to the R‐ISS stage 3 and R2‐ISS stage 4. Conclusion The UHR model, which integrates the presence of +1q21 with no‐ASCT and TP53 deletion, is designed to identify the early relapse subgroup among patients with +1q21 in NDMM.

Background KRAS is one of the most frequently mutated oncogenes in human cancers, but its activating mutations have remained undruggable due to its picomolar affinity for GTP/GDP and its smooth protein structure resulting in the absence of known allosteric regulatory sites.Results With the goal of treating mutated KRAS -driven cancers, two CRISPR systems, CRISPR-SpCas9 genome-editing system and transcription-regulating system dCas9-KRAB, were developed to directly deplete KRAS mutant allele or to repress its transcription in cancer cells, respectively, through guide RNA specifically targeting the mutant but not wild-type allele. The effect of in vitro proliferation and cell cycle on cancer cells as well as in vivo tumor growth was examined after delivery of Cas9 system. SpCas9 and dCas9-KRAB systems with sgRNA targeting the mutant allele both blocked the expression of mutant KRAS gene, leading to an inhibition of cancer cell proliferation. Local adenoviral injections using SpCas9 and dCas9-KRAB systems both suppressed tumor growth in vivo . The gene-depletion system (SpCas9) performed more effectively than the transcription-suppressing system (dCas9-KRAB) on tumor inhibition. Application of both Cas9 systems to wild-type KRAS tumor cells did not affect cell proliferation in vitro and in vivo . Furthermore, through bioinformatic analysis of 31555 SNP mutations of the top 20 cancer driver genes, we showed that our mutant-specific editing strategy could be extended to a list of oncogenic mutations with high editing potentials, and this pipeline can be applied to analyze the distribution of PAM sequence in the genome to survey the best targets for other editing purpose.Conclusions We successfully developed both gene-depletion and transcription-suppressing systems to specifically target an oncogenic mutant allele of KRAS which led to significant tumor regression. It provides a promising strategy for the treatment of tumors with driver gene mutations.* PDACs : pancreatic ductal adenocarcinomas CRCs : colorectal adenocarcinomas LACs : lung adenocarcinomas CRISPR : Clustered regularly interspaced short palindromic repeats SpCas9 : S.pyogenes CRISPR associated protein 9 EGFR : epidermal growth factor receptor dCas9 : dead Cas9 KRAB : Krüppel associated box PAM : protospacer adjacent motif NGS : next generation sequencing CFA : colony formation assay DSB : double stand break IHC : immunohistochemical WB : western blot SNV : single nucleotide variation S : sense AS : anti-sense SNP : single-nucleotide polymorphism AAV : adeno-associated viral ATCC : American Type Culture Collection DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s medium GAPDH : glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase H&E : hematoxylin and eosin