ABSTRACT The development of non-invasive live ocular imaging and electrophysiological test systems for rodent eyes provides new tools for not only averaged analysis of the entire retina but also the ability to see, test, and compare different subregions of the same retina. These new capabilities provide the possibility for more detailed examinations of local structural and functional relationships within a single eye and the ability to also follow changes longitudinally over time. We have developed protocols based around the Micron-III/IV retinal imaging camera system for combining fluorescent imaging of the neural retinal micro-vasculature by FA (fluorescein angiography), imaging of all neural retinal layers by SD-OCT (Spectral-Domain Ocular Coherence Tomography), and focal “spot” light-targeted electroretinography (Focal-ERG) to relate the local neurovascular unit structure to the inner (photoreceptor) and outer-retinal electrical response to light stimulation. For demonstration purposes we have used the popular mouse oxygen induced retinopathy (OIR) model, which causes radial central patches of retinal neuron loss mostly in zones away from and between the primary retinal arteries and veins. In this model, the loss of central microvasculature is induced developmentally in mouse litters exposed to 75% oxygen from age P7 to P11. Return to room air on P12, causes several days of retinal ischemia during which neurons, mostly of the inner retina, perish. Bipolar and ganglion cell death ends as neovascular growth revascularizes the central retina. This model provides for non-uniform retinal damage as well as gradual progression and resolution over time. The OIR model was used to generate regions of inner retinal neuron loss in B6.Cg-Tg Thy1-YFP mice. Using image-guided focal-ERG, the dark-adapted mixed rod-cone light response was compared using stimulation of small circular (0.27 mm diameter) target areas located in the central retinas of the same eyes (OIR and control). The same areas of the same retinas were followed over three ages after revascularization (P21, P28 and P42). Conclusions Combined FA and SD-OCT imaging can provide local geographic specific information on retinal structural changes and be used to select different retinal areas within the same eye for testing of local light response. This analysis strategy can be employed for studies with rodent disease models that do not uniformly impact the entire retinal area. Combining these techniques would also be useful for testing gene and cell replacement therapies in retinal degeneration models where typically a small zone of the retina is treated. Both treated and untreated retinal zones within the eye can be followed non-invasively over many weeks. SUMMARY Mouse models utilized for retinal disease research including retinal vascular models can display nonuniform changes over the entire retina. Damage or loss of retinal layers and retinal neurons due to hypoxia can impact some retinal areas while leaving adjacent regions unaltered. Combining vascular imaging by fluoresceine angiography, vascular imaging and retinal layer imaging by SD-OCT, and focal-ERG provides us with new tools to examine retinal structure-function relationships within a single retina.

Abstract Mutations in PRPH2 are a relatively common cause of sight-robbing inherited retinal degenerations (IRDs). Peripherin-2 (PRPH2) is a photoreceptor-specific tetraspanin protein that structures the disk rim membranes of rod and cone outer segment (OS) organelles, and is required for OS morphogenesis. PRPH2 is noteworthy for its broad spectrum of disease phenotypes; both inter- and intra-familial heterogeneity have been widely observed and this variability in disease expression and penetrance confounds efforts to understand genotype–phenotype correlations and pathophysiology. Here we report the generation and initial characterization of a gene-edited animal model for PRPH2 disease associated with a nonsense mutation (c.1095:C>A, p.Y285X), which is predicted to truncate the peripherin-2 C-terminal domain. Young (P21) Prph2Y285X/WT mice developed near-normal photoreceptor numbers; however, OS membrane architecture was disrupted, OS protein levels were reduced, and in vivo and ex vivo electroretinography (ERG) analyses found that rod and cone photoreceptor function were each severely reduced. Interestingly, ERG studies also revealed that rod-mediated downstream signaling (b-waves) were functionally compensated in the young animals. This resiliency in retinal function was retained at P90, by which time substantial IRD-related photoreceptor loss had occurred. Altogether, the current studies validate a new mouse model for investigating PRPH2 disease pathophysiology, and demonstrate that rod and cone photoreceptor function and structure are each directly and substantially impaired by the Y285X mutation. They also reveal that Prph2 mutations can induce a functional compensation that resembles homeostatic plasticity, which can stabilize rod-derived signaling, and potentially dampen retinal dysfunction during some PRPH2-associated IRDs.

Purpose Studies show that the b-isoform of Vascular Endothelial Growth Factor-A-165 (VEGFA165b) is predominant in normal human vitreous, switching to the a-isoform (VEGFA165a) in the vitreous of eyes with active diabetic retinopathy or ROP. The potential of this isoform-switching to impact the retinal vasculature is not clear, particularly in primary human retinal endothelial cells, which are important targets of VEGFA. We do not know how these two isoforms compare in their ability to activate key intracellular signalling pathways (MAPK, AKT) or alter VEGFA-target gene expression in primary human endothelial cells from the neural retina.Methods Effects of saturating amounts of both VEGFA165 isoforms (a/b) on the rat retinal vasculature were compared using intravitreal injection, fluorescein-angiography and Optical Coherence Tomography to monitor primary vein dilation and retinal edema. Full dose-response curves for the activation of MAPK (ERK1/2), AKT and VEGFR2 were determined using direct in-cell western assays of primary Human Retinal Microvascular Endothelial Cells (HRMECs). Differences in dose-response effects on gene expression markers related to endothelial cell / leukocyte adhesion ( ICAM1 , VCAM1 and SELE ) and tight-junctions ( CLDN5 and OCLN) were tested by quantitative-PCR.Results In rats, dilation of primary retinal veins and edema could be induced within 24 hours by intravitreal injection of a saturating dose of either isoform. In HRMECs, activation dose-response analysis revealed much stronger activation of MAPK, AKT and VEGFR2 by the a-isoform at lower doses. While similar maximum activation of VEGFR2 and MAPK could be achieved by both isoforms at higher doses, maximum activation of AKT by the b-isoform was only half that observed for the a-isoform. At the level of gene expression, VEGFA165a was also more effective at increasing expression of ICAM1 , VCAM1 and SELE and decreasing expression of CLDN5 and OCLN at intermediate and high doses in primary HRMECs.Conclusions VEGFA165a maximally activated MAPK and AKT in HRMECs at lower concentrations where VEGFA165b had little effect. The timing for maximal activation of MAPK was similar for both isoforms in HRMECs, which is different from non-retinal endothelial cells. While the dose-responses for VEGFR2 and MAPK activation had similar maximums with both isoforms, there were large differences between the isoforms in their effects on endothelial cell gene expression even at a high dose. The shifts of VEGFA165 expression from mostly b-isoform to mostly a-isoform, as reported in some human retinal vascular diseases, could potentially impact the activation of intracellular signalling and VEGFA target gene expression in endothelial cells of the human neural retina.