We subjected purified plasma cells from the bone marrow of patients with newly diagnosed multiple myeloma and control subjects to oligonucleotide microarray profiling and biochemical and immunohistochemical analyses to identify molecular determinants of osteolytic lesions.

To better define the molecular basis of multiple myeloma (MM), we performed unsupervised hierarchic clustering of mRNA expression profiles in CD138-enriched plasma cells from 414 newly diagnosed patients who went on to receive high-dose therapy and tandem stem cell transplants. Seven disease subtypes were validated that were strongly influenced by known genetic lesions, such as c-MAF- and MAFB-, CCND1- and CCND3-, and MMSET-activating translocations and hyperdiploidy. Indicative of the deregulation of common pathways by gene orthologs, common gene signatures were observed in cases with c-MAF and MAFB activation and CCND1 and CCND3 activation, the latter consisting of 2 subgroups, one characterized by expression of the early B-cell markers CD20 and PAX5. A low incidence of focal bone disease distinguished one and increased expression of proliferation-associated genes of another novel subgroup. Comprising varying fractions of each of the other 6 subgroups, the proliferation subgroup dominated at relapse, suggesting that this signature is linked to disease progression. Proliferation and MMSET-spike groups were characterized by significant overexpression of genes mapping to chromosome 1q, and both exhibited a poor prognosis relative to the other groups. A subset of cases with a predominating myeloid gene expression signature, excluded from the profiling analyses, had more favorable baseline characteristics and superior prognosis to those lacking this signature.

Mechanisms of constitutive NF-kappaB signaling in multiple myeloma are unknown. An inhibitor of IkappaB kinase beta (IKKbeta) targeting the classical NF-kappaB pathway was lethal to many myeloma cell lines. Several cell lines had elevated expression of NIK due to genomic alterations or protein stabilization, while others had inactivating mutations of TRAF3; both kinds of abnormality triggered the classical and alternative NF-kappaB pathways. A majority of primary myeloma patient samples and cell lines had elevated NF-kappaB target gene expression, often associated with genetic or epigenetic alteration of NIK, TRAF3, CYLD, BIRC2/BIRC3, CD40, NFKB1, or NFKB2. These data demonstrate that addiction to the NF-kappaB pathway is frequent in myeloma and suggest that IKKbeta inhibitors hold promise for the treatment of this disease.

Abstract To molecularly define high-risk disease, we performed microarray analysis on tumor cells from 532 newly diagnosed patients with multiple myeloma (MM) treated on 2 separate protocols. Using log-rank tests of expression quartiles, 70 genes, 30% mapping to chromosome 1 (P < .001), were linked to early disease-related death. Importantly, most up-regulated genes mapped to chromosome 1q, and down-regulated genes mapped to chromosome 1p. The ratio of mean expression levels of up-regulated to down-regulated genes defined a high-risk score present in 13% of patients with shorter durations of complete remission, event-free survival, and overall survival (training set: hazard ratio [HR], 5.16; P < .001; test cohort: HR, 4.75; P < .001). The high-risk score also was an independent predictor of outcome endpoints in multivariate analysis (P < .001) that included the International Staging System and high-risk translocations. In a comparison of paired baseline and relapse samples, the high-risk score frequency rose to 76% at relapse and predicted short postrelapse survival (P < .05). Multivariate discriminant analysis revealed that a 17-gene subset could predict outcome as well as the 70-gene model. Our data suggest that altered transcriptional regulation of genes mapping to chromosome 1 may contribute to disease progression, and that expression profiling can be used to identify high-risk disease and guide therapeutic interventions.

Two oncogenic pathways have been hypothesized for multiple myeloma (MM) and premalignant monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS) tumors: a nonhyperdiploid pathway associated with a high prevalence of IgH translocations and a hyperdiploid pathway associated with multiple trisomies of 8 chromosomes. Cyclin D1, D2, or D3 expression appears to be increased and/or dysregulated in virtually all MM tumors despite their low proliferative capacity. Translocations can directly dysregulate CCND1 (11q13) or CCND3 (6p21), or MAF (16q23) or MAFB (20q11) transcription factors that target CCND2. Biallelic dysregulation of CCND1 occurs in nearly 40% of tumors, most of which are hyperdiploid. Other tumors express increased CCND2, either with or without a t(4;14) translocation. Using gene expression profiling to identify 5 recurrent translocations, specific trisomies, and expression of cyclin D genes, MM tumors can be divided into 8 TC (translocation/cyclin D) groups (11q13, 6p21, 4p16, maf, D1, D1+D2, D2, and none) that appear to be defined by early, and perhaps initiating, oncogenic events. However, despite subsequent progression events, these groups have differing gene expression profiles and also significant differences in the prevalence of bone disease, frequency at relapse, and progression to extramedullary tumor.

Bone marrow plasma cells (PCs) from 74 patients with newly diagnosed multiple myeloma (MM), 5 with monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS), and 31 healthy volunteers (normal PCs) were purified by CD138+ selection. Gene expression of purified PCs and 7 MM cell lines were profiled using high-density oligonucleotide microarrays interrogating about 6800 genes. On hierarchical clustering analysis, normal and MM PCs were differentiated and 4 distinct subgroups of MM (MM1, MM2, MM3, and MM4) were identified. The expression pattern of MM1 was similar to normal PCs and MGUS, whereas MM4 was similar to MM cell lines. Clinical parameters linked to poor prognosis, abnormal karyotype (P = .002) and high serum β2-microglobulin levels (P = .0005), were most prevalent in MM4. Also, genes involved in DNA metabolism and cell cycle control were overexpressed in a comparison of MM1 and MM4. In addition, using χ2 and Wilcoxon rank sum tests, 120 novel candidate disease genes were identified that discriminate normal and malignant PCs (P &lt; .0001); many are involved in adhesion, apoptosis, cell cycle, drug resistance, growth arrest, oncogenesis, signaling, and transcription. A total of 156 genes, including FGFR3 andCCND1, exhibited highly elevated (“spiked”) expression in at least 4 of the 74 MM cases (range, 4-25 spikes). Elevated expression of these 2 genes was caused by the translocation t(4;14)(p16;q32) or t(11;14)(q13;q32). Thus, novel candidate MM disease genes have been identified using gene expression profiling and this profiling has led to the development of a gene-based classification system for MM.

Abstract Purpose: We generated a humanized antibody, HuLuc63, which specifically targets CS1 (CCND3 subset 1, CRACC, and SLAMF7), a cell surface glycoprotein not previously associated with multiple myeloma. To explore the therapeutic potential of HuLuc63 in multiple myeloma, we examined in detail the expression profile of CS1, the binding properties of HuLuc63 to normal and malignant cells, and the antimyeloma activity of HuLuc63 in preclinical models. Experimental Design: CS1 was analyzed by gene expression profiling and immunohistochemistry of multiple myeloma samples and numerous normal tissues. HuLuc63-mediated antimyeloma activity was tested in vitro in antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) assays and in vivo using the human OPM2 xenograft model in mice. Results: CS1 mRNA was expressed in &gt;90% of 532 multiple myeloma cases, regardless of cytogenetic abnormalities. Anti-CS1 antibody staining of tissues showed strong staining of myeloma cells in all plasmacytomas and bone marrow biopsies. Flow cytometric analysis of patient samples using HuLuc63 showed specific staining of CD138+ myeloma cells, natural killer (NK), NK-like T cells, and CD8+ T cells, with no binding detected on hematopoietic CD34+ stem cells. HuLuc63 exhibited significant in vitro ADCC using primary myeloma cells as targets and both allogeneic and autologous NK cells as effectors. HuLuc63 exerted significant in vivo antitumor activity, which depended on efficient Fc-CD16 interaction as well as the presence of NK cells in the mice. Conclusions: These results suggest that HuLuc63 eliminates myeloma cells, at least in part, via NK-mediated ADCC and shows the therapeutic potential of targeting CS1 with HuLuc63 for the treatment of multiple myeloma.

Using fluorescence in situ hybridization we investigated amplification of chromosome band 1q21 (Amp1q21) in more than 500 untreated patients with monoclonal gammopathy of undetermined significance (MGUS; n = 14), smoldering multiple myeloma (SMM; n = 31), and newly diagnosed MM (n = 479) as well as 45 with relapsed MM. The frequency of Amp1q21 was 0% in MGUS, 45% in SMM, 43% in newly diagnosed MM, and 72% in relapsed MM (newly diagnosed versus relapsed MM, P < .001). Amp1q21 was detected in 10 of 12 patients whose disease evolved to active MM compared with 4 of 19 who remained with SMM (P < .001). Patients with newly diagnosed MM with Amp1q21 had inferior 5-year event-free/overall survival compared with those lacking Amp1q21 (38%/52% versus 62%/78%, both P < .001). Thalidomide improved 5-year EFS in patients lacking Amp1q21 but not in those with Amp1q21 (P = .004). Multivariate analysis including other major predictors revealed that Amp1q21 was an independent poor prognostic factor. Relapsed patients who had Amp1q21 at relapse had inferior 5-year postrelapse survival compared with those lacking Amp1q21 at relapse (15% versus 53%, P = .027). The proportion of cells with Amp1q21 and the copy number of 1q21 tended to increase at relapse compared with diagnosis. Our data suggest that Amp1q21 is associated with both disease progression and poor prognosis.

Dickkopf-1 (DKK1), a soluble inhibitor of Wnt signaling secreted by multiple myeloma (MM) cells contributes to osteolytic bone disease by inhibiting the differentiation of osteoblasts. In this study, we tested the effect of anti-DKK1 therapy on bone metabolism and tumor growth in a SCID-rab system. SCID-rab mice were engrafted with primary MM cells expressing varying levels of DKK1 from 11 patients and treated with control and DKK1-neutralizing antibodies for 4 to 6 weeks. Whereas bone mineral density (BMD) of the implanted myelomatous bone in control mice was reduced during the experimental period, the BMD in mice treated with anti-DKK1 increased from pretreatment levels (P < .001). Histologic examination revealed that myelomatous bones of anti-DKK1-treated mice had increased numbers of osteocalcin-expressing osteoblasts and reduced number of multinucleated TRAP-expressing osteoclasts. The bone anabolic effect of anti-DKK1 was associated with reduced MM burden (P < .04). Anti-DKK1 also significantly increased BMD of the implanted bone and murine femur in nonmyelomatous SCID-rab mice, suggesting that DKK1 is physiologically an important regulator of bone remodeling in adults. We conclude that DKK1 is a key player in MM bone disease and that blocking DKK1 activity in myelomatous bones reduces osteolytic bone resorption, increases bone formation, and helps control MM growth.

To identify genetic events underlying the genesis and progression of multiple myeloma (MM), we conducted a high-resolution analysis of recurrent copy number alterations (CNAs) and expression profiles in a collection of MM cell lines and outcome-annotated clinical specimens. Attesting to the molecular heterogeneity of MM, unsupervised classification using nonnegative matrix factorization (NMF) designed for array comparative genomic hybridization (aCGH) analysis uncovered distinct genomic subtypes. Additionally, we defined 87 discrete minimal common regions (MCRs) within recurrent and highly focal CNAs. Further integration with expression data generated a refined list of MM gene candidates residing within these MCRs, thereby providing a genomic framework for dissection of disease pathogenesis, improved clinical management, and initiation of targeted drug discovery for specific MM patients.