Erythropoietin (EPO) is both hematopoietic and tissue protective, putatively through interaction with different receptors. We generated receptor subtype–selective ligands allowing the separation of EPO's bioactivities at the cellular level and in animals. Carbamylated EPO (CEPO) or certain EPO mutants did not bind to the classical EPO receptor (EPOR) and did not show any hematopoietic activity in human cell signaling assays or upon chronic dosing in different animal species. Nevertheless, CEPO and various nonhematopoietic mutants were cytoprotective in vitro and conferred neuroprotection against stroke, spinal cord compression, diabetic neuropathy, and experimental autoimmune encephalomyelitis at a potency and efficacy comparable to EPO.

Cdc2 is the cyclin-dependent kinase that controls entry of cells into mitosis. Phosphorylation of Cdc2 on threonine-14 and tyrosine-15 inhibits the activity of the enzyme and prevents premature initiation of mitosis. Although Wee1 has been identified as the kinase that phosphorylates tyrosine-15 in various organisms, the threonine-14-specific kinase has not been isolated. A complementary DNA was cloned from Xenopus that encodes Myt1, a member of the Wee1 family that was discovered to phosphorylate Cdc2 efficiently on both threonine-14 and tyrosine-15. Myt1 is a membrane-associated protein that contains a putative transmembrane segment. Immunodepletion studies suggested that Myt1 is the predominant threonine-14-specific kinase in Xenopus egg extracts. Myt1 activity is highly regulated during the cell cycle, suggesting that this relative of Wee1 plays a role in mitotic control.

The cytokine erythropoietin (Epo) is tissue-protective in preclinical models of ischemic, traumatic, toxic, and inflammatory injuries. We have recently characterized Epo derivatives that do not bind to the Epo receptor (EpoR) yet are tissue-protective. For example, carbamylated Epo (CEpo) does not stimulate erythropoiesis, yet it prevents tissue injury in a wide variety of in vivo and in vitro models. These observations suggest that another receptor is responsible for the tissue-protective actions of Epo. Notably, prior investigation suggests that EpoR physically interacts with the common β receptor (βcR), the signal-transducing subunit shared by the granulocyte-macrophage colony stimulating factor, and the IL-3 and IL-5 receptors. However, because βcR knockout mice exhibit normal erythrocyte maturation, βcR is not required for erythropoiesis. We hypothesized that βcR in combination with the EpoR expressed by nonhematopoietic cells constitutes a tissue-protective receptor. In support of this hypothesis, membrane proteins prepared from rat brain, heart, liver, or kidney were greatly enriched in EpoR after passage over either Epo or CEpo columns but covalently bound in a complex with βcR. Further, antibodies against EpoR coimmunoprecipitated βcR from membranes prepared from neuronal-like P-19 cells that respond to Epo-induced tissue protection. Immunocytochemical studies of spinal cord neurons and cardiomyocytes protected by Epo demonstrated cellular colocalization of Epo βcR and EpoR. Finally, as predicted by the hypothesis, neither Epo nor CEpo was active in cardiomyocyte or spinal cord injury models performed in the βcR knockout mouse. These data support the concept that EpoR and βcR comprise a tissue-protective heteroreceptor.

Ischemic brain injury resulting from stroke arises from primary neuronal losses and by inflammatory responses. Previous studies suggest that erythropoietin (EPO) attenuates both processes. Although EPO is clearly antiapoptotic for neurons after experimental stroke, it is unknown whether EPO also directly modulates EPO receptor (EPO-R)–expressing glia, microglia, and other inflammatory cells. In these experiments, we show that recombinant human EPO (rhEPO; 5,000 U/kg body weight, i.p.) markedly reduces astrocyte activation and the recruitment of leukocytes and microglia into an infarction produced by middle cerebral artery occlusion in rats. In addition, ischemia-induced production of the proinflammatory cytokines tumor necrosis factor, interleukin 6, and monocyte chemoattractant protein 1 concentration is reduced by >50% after rhEPO administration. Similar results were also observed in mixed neuronal-glial cocultures exposed to the neuronal-selective toxin trimethyl tin. In contrast, rhEPO did not inhibit cytokine production by astrocyte cultures exposed to neuronal homogenates or modulate the response of human peripheral blood mononuclear cells, rat glial cells, or the brain to lipopolysaccharide. These findings suggest that rhEPO attenuates ischemia-induced inflammation by reducing neuronal death rather than by direct effects upon EPO-R–expressing inflammatory cells.

Erythropoietin (EPO) is a tissue-protective cytokine preventing vascular spasm, apoptosis, and inflammatory responses. Although best known for its role in hematopoietic lineages, EPO also affects other tissues, including those of the nervous system. Enthusiasm for recombinant human erythropoietin (rhEPO) as a potential neuroprotective therapeutic must be tempered, however, by the knowledge it also enlarges circulating red cell mass and increases platelet aggregability. Here we examined whether erythropoietic and tissue-protective activities of rhEPO might be dissociated by a variation of the molecule. We demonstrate that asialoerythropoietin (asialoEPO), generated by total enzymatic desialylation of rhEPO, possesses a very short plasma half-life and is fully neuroprotective. In marked contrast with rhEPO, this molecule at doses and frequencies at which rhEPO exhibited erythropoiesis, did not increase the hematocrit of mice or rats. AsialoEPO appeared promptly within the cerebrospinal fluid after i.v. administration; intravenously administered radioiodine-labeled asialoEPO bound to neurons within the hippocampus and cortex in a pattern corresponding to the distribution of the EPO receptor. Most importantly, asialoEPO exhibits a broad spectrum of neuroprotective activities, as demonstrated in models of cerebral ischemia, spinal cord compression, and sciatic nerve crush. These data suggest that nonerythropoietic variants of rhEPO can cross the blood–brain barrier and provide neuroprotection.

We have cloned a Xenopus Cdc6 homolog (Xcdc6) and characterized its role in DNA replication with Xenopus egg extracts. Immunodepletion of Xcdc6 abolishes chromosomal replication but not elongation on single-stranded DNA templates. Xcdc6 binds to chromatin at the beginning of interphase but disappears from chromatin upon initiation of replication. Immunodepletion studies indicate that binding of Xcdc6 to chromatin requires Xorc2, a component of the origin recognition complex. Moreover, Xmcm3 cannot bind to chromatin lacking Xcdc6, suggesting that Xorc2, Xcdc6, and Xmcm3 associate with the DNA sequentially. In postreplicative nuclei, Xcdc6 is associated with the nuclear envelope. These studies indicate that Xcdc6, is essential for initiation of replication in vertebrates and that interaction with the nuclear envelope may regulate its function.

Erythropoietin (EPO), a member of the type 1 cytokine superfamily, plays a critical hormonal role regulating erythrocyte production as well as a paracrine/autocrine role in which locally produced EPO protects a wide variety of tissues from diverse injuries. Significantly, these functions are mediated by distinct receptors: hematopoiesis via the EPO receptor homodimer and tissue protection via a heterocomplex composed of the EPO receptor and CD131, the β common receptor. In the present work, we have delimited tissue-protective domains within EPO to short peptide sequences. We demonstrate that helix B (amino acid residues 58–82) of EPO, which faces the aqueous medium when EPO is bound to the receptor homodimer, is both neuroprotective in vitro and tissue protective in vivo in a variety of models, including ischemic stroke, diabetes-induced retinal edema, and peripheral nerve trauma. Remarkably, an 11-aa peptide composed of adjacent amino acids forming the aqueous face of helix B is also tissue protective, as confirmed by its therapeutic benefit in models of ischemic stroke and renal ischemia–reperfusion. Further, this peptide simulating the aqueous surface of helix B also exhibits EPO's trophic effects by accelerating wound healing and augmenting cognitive function in rodents. As anticipated, neither helix B nor the 11-aa peptide is erythropoietic in vitro or in vivo . Thus, the tissue-protective activities of EPO are mimicked by small, nonerythropoietic peptides that simulate a portion of EPO's three-dimensional structure.

While peripheral glucose sensors are known to relay signals of substrate availability to integrative nuclei in the brain, the importance of these pathways in maintaining energy homeostasis and their contribution to disease remain unknown. Herein, we demonstrate that selective activation of the hepatoportal neural plexus via transient peripheral focused ultrasound (pFUS) induces glucose homeostasis in models of well-established insulin resistant diabetes. pFUS modulates sensory projections to the hindbrain and alters hypothalamic concentrations of neurotransmitters that regulate metabolism, resulting in potentiation of hypothalamic insulin signaling, leptin-independent inhibition of the orexigenic neuropeptide Y system, and therapeutic alteration in autonomic output to peripheral effector organs. Multiomic profiling confirms pFUS-induced modifications of key metabolic functions in liver, pancreas, muscle, adipose, kidney, and intestines. Activation of the hepatic nutrient sensing pathway not only restores nervous system coordination of peripheral metabolism in three different species but does so across these organ systems; several of which are current targets of antidiabetic drug classes. These results demonstrate the potential of hepatic pFUS as a novel/non-pharmacologic therapeutic modality to restore glucose homeostasis in metabolic diseases, including type II diabetes. One Sentence Summary We utilize a non-invasive ultrasound technique to activate a liver-brain sensory pathway and demonstrate its potential to induce durable normalization of glucose homeostasis in models of well-established insulin resistant diabetes.