When C2C12 pluripotent mesenchymal precursor cells are treated with transforming growth factor β1 (TGF-β1), terminal differentiation into myotubes is blocked. Treatment with bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) not only blocks myogenic differentiation of C2C12 cells but also induces osteoblast differentiation. The molecular mechanisms governing the ability of TGF-β1 and BMP-2 to both induce ligand-specific responses and inhibit myogenic differentiation are not known. We identified Runx2/PEBP2αA/Cbfa1, a global regulator of osteogenesis, as a major TGF-β1-responsive element binding protein induced by TGF-β1 and BMP-2 in C2C12 cells. Consistent with the observation that Runx2 can be induced by either TGF-β1 or BMP-2, the exogenous expression of Runx2 mediated some of the effects of TGF-β1 and BMP-2 but not osteoblast-specific gene expression. Runx2 mimicked common effects of TGF-β1 and BMP-2 by inducing expression of matrix gene products (for example, collagen and fibronectin), suppressing MyoD expression, and inhibiting myotube formation of C2C12 cells. For osteoblast differentiation, an additional effector, BMP-specific Smad protein, was required. Our results indicate that Runx2 is a major target gene shared by TGF-β and BMP signaling pathways and that the coordinated action of Runx2 and BMP-activated Smads leads to the induction of osteoblast-specific gene expression in C2C12 cells.

The differentiation of mesenchymal cells into chondrocytes and chondrocyte proliferation and maturation are fundamental steps in skeletal development. Runx2 is essential for osteoblast differentiation and is involved in chondrocyte maturation. Although chondrocyte maturation is delayed in Runx2-deficient (Runx2(-/-)) mice, terminal differentiation of chondrocytes does occur, indicating that additional factors are involved in chondrocyte maturation. We investigated the involvement of Runx3 in chondrocyte differentiation by generating Runx2-and-Runx3-deficient (Runx2(-/-)3(-/-)) mice. We found that chondrocyte differentiation was inhibited depending on the dosages of Runx2 and Runx3, and Runx2(-/-)3(-/-) mice showed a complete absence of chondrocyte maturation. Further, the length of the limbs was reduced depending on the dosages of Runx2 and Runx3, due to reduced and disorganized chondrocyte proliferation and reduced cell size in the diaphyses. Runx2(-/-)3(-/-) mice did not express Ihh, which regulates chondrocyte proliferation and maturation. Adenoviral introduction of Runx2 in Runx2(-/-) chondrocyte cultures strongly induced Ihh expression. Moreover, Runx2 directly bound to the promoter region of the Ihh gene and strongly induced expression of the reporter gene driven by the Ihh promoter. These findings demonstrate that Runx2 and Runx3 are essential for chondrocyte maturation and that Runx2 regulates limb growth by organizing chondrocyte maturation and proliferation through the induction of Ihh expression.

Cbfa1, a transcription factor that belongs to the runt-domain gene family, plays an essential role in osteogenesis. Cbfa1-deficient mice completely lacked both intramembranous and endochondral ossification, owing to the maturational arrest of osteoblasts, indicating that Cbfa1 has a fundamental role in osteoblast differentiation. However, Cbfa1 was also expressed in chondrocytes, and its expression was increased according to the maturation of chondrocytes. Terminal hypertrophic chondrocytes expressed Cbfa1 extensively. The significant expression of Cbfa1 in hypertrophic chondrocytes was first detected at embryonic day 13.5 (E13.5), and its expression in hypertrophic chondrocytes was most prominent at E14.5-16.5. In Cbfa1-deficient mice, whose entire skeleton was composed of cartilage, the chondrocyte differentiation was disturbed. Calcification of cartilage occurred in the restricted parts of skeletons, including tibia, fibula, radius, and ulna. Type X collagen, BMP6, and Indian hedgehog were expressed in their hypertrophic chondrocytes. However, osteopontin, bone sialoprotein, and collagenase 3 were not expressed at all, indicating that they are directly regulated by Cbfa1 in the terminal hypertrophic chondrocytes. Chondrocyte differentiation was severely disturbed in the rest of the skeleton. The expression of PTH/PTHrP receptor, Indian hedgehog, type X collagen, and BMP6 was not detected in humerus and femur, indicating that chondrocyte differentiation was blocked before prehypertrophic chondrocytes. These findings demonstrate that Cbfa1 is an important factor for chondrocyte differentiation.

During the assembly of immunoglobulin and T cell receptor variable region genes from variable (V), diversity (D), and joining (J) segments, the germline-encoded repertoire is further diversified by processes that include the template-independent addition of nucleotides (N regions) at gene segment junctions. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-deficient lymphocytes had no N regions in their variable region genes, which shows that TdT is responsible for N region addition. In addition, certain variable region genes appeared at increased frequency in TdT-deficient thymocytes, which indicates that N region addition also influences repertoire development by alleviating sequence-specific constraints imposed on the joining of particular V, D, and J segments.

Cbfa1 is an essential transcription factor for osteoblast differentiation and bone formation. We investigated functional differences among three isoforms of Cbfa1: Type I (originally reported as Pebp2αA by Ogawa et al. (Ogawa, E., Maruyama, M., Kagoshima, H., Inuzuka, M., Lu, J., Satake, M., Shigesada, K., and Ito, Y. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6859–6863), Type II (originally reported astil-1 by Stewart et al. (Stewart, M., Terry, A., Hu, M., O'Hara, M., Blyth, K., Baxter, E., Cameron, E., Onions, D. E., and Neil, J. C. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 8646–8651), and Type III (originally reported asOsf2/Cbfa1 by Ducy et al. (Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., and Karsenty, G. (1997)Cell 89, 747–754). A reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis demonstrated that these isoforms were expressed in adult mouse bones. The transient transfection of Type I or Type IICbfa1 in a mouse fibroblastic cell line, C3H10T1/2, induced the expression of alkaline phosphatase (ALP) activity. This induction was synergistically enhanced by the co-introduction ofXenopus BMP-4 cDNA. In contrast, the transient transfection of Type III cDNA induced no ALP activity. In C3H10T1/2 cells stably transfected with each isoform ofCbfa1, the gene expression of ALP was also strongly induced in cells transfected with Type I and Type IICbfa1 but not in cells with Type III Cbfa1. Osteocalcin, osteopontin,and type I collagen gene expressions were induced or up-regulated in all of the cells stably transfected with each isoform of Cbfa1, and Type II transfected cells exhibited the highest expression level ofosteocalcin gene. A luciferase reporter gene assay using a 6XOSE2-SV40 promoter (6 tandem binding elements for Cbfa1 ligated in front of the SV40 promoter sequence), a mouse osteocalcinpromoter, and a mouse osteopontin promoter revealed the differences in the transcriptional induction of target genes by eachCbfa1 isoform with or without its β-subunit. These results suggest that all three of the Cbfa1 isoforms used in the present study are involved in the stimulatory action of osteoblast differentiation, but they exert different functions in the process of osteoblast differentiation. Cbfa1 is an essential transcription factor for osteoblast differentiation and bone formation. We investigated functional differences among three isoforms of Cbfa1: Type I (originally reported as Pebp2αA by Ogawa et al. (Ogawa, E., Maruyama, M., Kagoshima, H., Inuzuka, M., Lu, J., Satake, M., Shigesada, K., and Ito, Y. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6859–6863), Type II (originally reported astil-1 by Stewart et al. (Stewart, M., Terry, A., Hu, M., O'Hara, M., Blyth, K., Baxter, E., Cameron, E., Onions, D. E., and Neil, J. C. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 94, 8646–8651), and Type III (originally reported asOsf2/Cbfa1 by Ducy et al. (Ducy, P., Zhang, R., Geoffroy, V., Ridall, A. L., and Karsenty, G. (1997)Cell 89, 747–754). A reverse transcriptase-polymerase chain reaction analysis demonstrated that these isoforms were expressed in adult mouse bones. The transient transfection of Type I or Type IICbfa1 in a mouse fibroblastic cell line, C3H10T1/2, induced the expression of alkaline phosphatase (ALP) activity. This induction was synergistically enhanced by the co-introduction ofXenopus BMP-4 cDNA. In contrast, the transient transfection of Type III cDNA induced no ALP activity. In C3H10T1/2 cells stably transfected with each isoform ofCbfa1, the gene expression of ALP was also strongly induced in cells transfected with Type I and Type IICbfa1 but not in cells with Type III Cbfa1. Osteocalcin, osteopontin,and type I collagen gene expressions were induced or up-regulated in all of the cells stably transfected with each isoform of Cbfa1, and Type II transfected cells exhibited the highest expression level ofosteocalcin gene. A luciferase reporter gene assay using a 6XOSE2-SV40 promoter (6 tandem binding elements for Cbfa1 ligated in front of the SV40 promoter sequence), a mouse osteocalcinpromoter, and a mouse osteopontin promoter revealed the differences in the transcriptional induction of target genes by eachCbfa1 isoform with or without its β-subunit. These results suggest that all three of the Cbfa1 isoforms used in the present study are involved in the stimulatory action of osteoblast differentiation, but they exert different functions in the process of osteoblast differentiation. The gene targeting in mice of Cbfa1(core-binding factor), originally identified as a T-cell differentiation regulator (1Ogawa E. Maruyama M. Kagoshima H. Inuzuka M. Lu J. Satake M. Shigesada K. Ito Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 6859-6863Crossref PubMed Scopus (564) Google Scholar, 2Satake M. Nomura S. Yamaguchi-Iwai Y. Takahama Y. Hashimoto Y. Niki M. Kitamura Y. Ito Y. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 1662-1670Crossref PubMed Google Scholar), resulted in a complete lack of bone formation due to a maturational arrest of osteoblasts (3Komori T. Yagi H. Nomura S. Yamaguchi A. Sasaki K. Deguchi K. Shimizu Y. Bronson R.T. Gao Y.H. Inada M. Sato M. Okamoto R. Kitamura Y. Yoshiki S. Kishimoto T. Cell. 1997; 89: 755-764Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3735) Google Scholar, 4Otto F. Thornell A.P. Crompton T. Denzel A. Gilmour K.C. Rosewell I.R. Stamp G.W. Beddington R.S. Mundlos S. Olsen B.R. Selby P.B. Owen M.J. Cell. 1997; 89: 765-771Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2458) Google Scholar). Cbfa1 is also the responsible gene for the human genetic disease of cleidocranial dysplasia (5Mundlos S. Otto F. Mundlos C. Mulliken J.B. Aylsworth A.S. Albright S. Lindhout D. Cole W.G. Henn W. Knoll J.H. Owen M.J. Mertelsmann R. Zabel B.U. Olsen B.R. Cell. 1997; 89: 773-779Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1294) Google Scholar, 6Lee B. Thirunavukkarasu K. Zhou L. Pastore L. Baldini A. Hecht J. Geoffroy V. Ducy P. Karsenty G. Nat. Genet. 1997; 16: 307-310Crossref PubMed Scopus (500) Google Scholar). The promoter region of the genes related to osteoblast differentiation such as osteopontin (OPN), 1The abbreviations used are: OPN, osteopontin; Cbf, core binding factor; OSC, osteocalcin; ALP, alkaline phosphatase; BMP, bone morphogenetic protein; Pebp, polyoma enhancer binding protein; Osf, osteoblast-specific factor; OSE, osteocalcin-specific element; RT, reverse transcriptase; PCR, polymerase chain reaction; CRE, cAMP-responsive element; CREB, CRE-binding protein; GR, glucocorticoid receptor; GRE, glucocorticoid-responsive element; AML, acute myeloid leukemia factor; SREBP, sterol regulatory element binding protein; C/EBP, CCAAT/enhancer binding protein; ALY, ally of AML-1 and LEF-1; bp, base pair(s); kb, kilobase(s) osteocalcin (OSC), and bone sialoprotein contains binding sequences of Cbfa1 (7Craig A.M. Denhardt D.T. Gene. 1991; 100: 163-171Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar, 8Geoffroy V. Ducy P. Karsenty G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 30973-30979Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (159) Google Scholar, 9Sodek J. Li J.J. Kim R.H. Ogata Y. Yamauchi M. Connect. Tissue Res. 1996; 35: 23-31Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar). The transfection of Cbfa1gene into non-osteogenic cells such as C3H10T1/2 cells and primary skin fibroblasts directed the differentiation pathway of these cells toward the osteoblast lineage (10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar). These results indicated that Cbfa1 is one of the essential transcription factors that regulate osteoblast differentiation and bone formation (11Komori T. Kishimoto T. Curr. Opin. Genet. Dev. 1998; 8: 494-499Crossref PubMed Scopus (102) Google Scholar). In addition, bone morphogenetic proteins (BMPs), one of the most potent stimulatory factors for osteoblast differentiation, induced or stimulated the expression of Cbfa1 mRNA (10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar, 12Tsuji K. Ito Y. Noda M. Bone. 1998; 22: 87-92Crossref PubMed Scopus (115) Google Scholar). This suggests that Cbfa1 is involved in the signaling pathway of BMP action. Three subtypes of the α-subunit of Cbf (Cbfa1, Cbfa2, and Cbfa3) and one subtype of the β-subunit (Cbfβ) have been reported (13Bae S.C. Takahashi E. Zhang Y.W. Ogawa E. Shigesada K. Namba Y. Satake M. Ito Y. Gene (Amst.). 1995; 159: 245-248Crossref PubMed Scopus (152) Google Scholar, 14Ogawa E. Inuzuka M. Maruyama M. Satake M. Naito-Fujimoto M. Ito Y. Shigesada K. Virology. 1993; 194: 314-331Crossref PubMed Scopus (455) Google Scholar). The α-subunits of Cbf family transcription factors acquire enhanced DNA binding activity when they heterodimerize with the β-subunit (1Ogawa E. Maruyama M. Kagoshima H. Inuzuka M. Lu J. Satake M. Shigesada K. Ito Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 6859-6863Crossref PubMed Scopus (564) Google Scholar,15Kanno T. Kanno Y. Chen L.F. Ogawa E. Kim W.Y. Ito Y. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 2444-2454Crossref PubMed Google Scholar). In addition, several isoforms of Cbfa1 have been identified by differential promoter usage or differential splicing (16Stewart M. Terry A. Hu M. O'Hara M. Blyth K. Baxter E. Cameron E. Onions D.E. Neil J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 8646-8651Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar,17Geoffroy V. Corral D.A. Zhou L. Lee B. Karsenty G. Mamm. Genome. 1998; 9: 54-57Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). One isoform, originally cloned from ras-transformed NIH3T3 cells, was named Pebp2αA (referred to as Type ICbfa1 hereafter). Recently, three groups of investigators independently identified two other isoforms of Cbfa1, from osteoblasts and lymphoblasts (5Mundlos S. Otto F. Mundlos C. Mulliken J.B. Aylsworth A.S. Albright S. Lindhout D. Cole W.G. Henn W. Knoll J.H. Owen M.J. Mertelsmann R. Zabel B.U. Olsen B.R. Cell. 1997; 89: 773-779Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1294) Google Scholar, 10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar, 16Stewart M. Terry A. Hu M. O'Hara M. Blyth K. Baxter E. Cameron E. Onions D.E. Neil J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 8646-8651Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar); in these isoforms, two translational start sites are suggested: the shorter isoform (referred to as Type II isoform hereafter) and the longer isoform (referred to hereafter as Type III isoform). Although Ducy et al. (10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar) demonstrated that the transfection of Type III Cbfa1 into non-osteogenic cells induced gene expression related to osteoblast differentiation, functional differences among the isoforms ofCbfa1 have not been clarified. We investigated the functional differences among three isoforms ofCbfa1 (Type I, II, and III) by the generation of stably transfected cells with each Cbfa1 isoform and a transient transcriptional assay using Cbfa1 target gene promoter-driven luciferase reporter genes. We demonstrate here that these three isoforms of Cbfa1 have different functions in osteoblast differentiation. The mouse embryonic fibroblast cell line, C3H10T1/2, was purchased from Riken Cellbank (Saitama, Japan). This cell line was maintained in BME medium (Life Technologies, Inc.) containing 10% fetal calf serum (Life Technologies, Inc.) and antibiotics. Alkaline phosphatase (ALP) activity was detected histochemically using an Alkaline Phosphatase Substrate Kit IV (Vector Laboratories, Burlingame, CA). The ALP activity of the cell lysates was determined usingp-nitrophenyl phosphate as a substrate as described previously (29Xiao Z.S. Thomas R. Hinson T.K. Quarles L.D. Gene (Amst .). 1998; 214: 187-197Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar, 30Yamaguchi A. Katagiri T. Ikeda T. Wozney J.M. Rosen V. Wang E.A. Kahn A.J. Suda T. Yoshiki S. J. Cell Biol. 1991; 113: 681-687Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar, 31Katagiri T. Yamaguchi A. Komaki M. Abe E. Takahashi N. Ikeda T. Rosen V. Wozney J.M. Fujisawa-Sehara A. Suda T. J. Cell Biol. 1994; 127: 1755-1766Crossref PubMed Scopus (1314) Google Scholar, 32Yamaguchi A. Ishizuya T. Kintou N. Wada Y. Katagiri T. Wozney J.M. Rosen V. Yoshiki S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 220: 366-371Crossref PubMed Scopus (308) Google Scholar). The poly(A+) RNA purification, first-strand cDNA synthesis, and PCR were performed as described (18Harada H. Kuboi Y. Miki R. Honda C. Masushige S. Nakatsuka M. Koga Y. Kato S. Endocrinology. 1998; 139: 204-212Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar). The PCR conditions were as follows. After 1 min of preincubation at 94 °C, amplification was performed for 35 cycles consisting of 20 s of denaturing at 94 °C, 1 min of annealing, and extension at 66 °C. The primers used for each isoform were as follows (small letters; restriction enzyme site and Kozak sequence). Mouse Type I Cbfa1 (Pebp2αA (1Ogawa E. Maruyama M. Kagoshima H. Inuzuka M. Lu J. Satake M. Shigesada K. Ito Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 6859-6863Crossref PubMed Scopus (564) Google Scholar)): sense, 5′-ggatc caccA TGCGT ATTCC TGTAG ATCCG AG-3′ (nucleotides +1016/1038); antisense, 5′-CATCA TTCCC GGCCA TGACG GTAAC-3′ (nucleotides +1475/1451). Mouse Type II/III Cbfa1 (Osf2/Cbfa1(10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar)): sense, 5′-ggatc caccA TGCTT CATTC GCCTC ACAAA CAACC-3′ (nucleotides +1/26); antisense, 5′-TGGTG CGGTT GTCGT GCGGC-3′ (nucleotides +529/510). For the detection of ALP mRNA by RT-PCR in the transient transfection assay, 1 μg of total RNA purified from transfected cells (6 days after transfection) was used. The PCR conditions were as follows. After 1 min of preincubation at 94 °C, amplification was performed for 30 cycles consisting of 20 s of denaturing at 94 °C, 30 s of annealing at 56 °C, and 30 s of extension at 72 °C. The primers used were as follows. Sense, 5′-GCAGG ATTGA CCACG GACAC TATG-3′ (+1183/1206); antisense, 5′-TTCTG CTCAT GGACG CCGTG AAGC (+1615/1592) (19Terao M. Mintz B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987; 84: 7051-7055Crossref PubMed Scopus (84) Google Scholar). As an internal control, a PCR analysis was also performed with β-actin specific primers for 25 cycles (sense, 5′-CATCA CTATT GGCAA CGAGC-3′ (+821/840); antisense, 5′-ACTCA TCGTA CTCCT GCTTG-3′ (+1154/1173)) (20Tokunaga K. Taniguchi H. Yoda K. Shimizu M. Sakiyama S. Nucleic Acids Res. 1986; 14: 2829Crossref PubMed Scopus (590) Google Scholar). A reporter plasmid containing 6 repeats of the consensus Cbfa1 binding site (6XOSE2) was constructed to insert a blunt-ended PCR fragment containing AACCACA-based direct repeats (21Ducy P. Karsenty G. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 1858-1869Crossref PubMed Scopus (530) Google Scholar) into the SmaI site of the pGL3 promoter vector (Promega, Madison, WI). A reporter plasmid containing a mouse OSCpromoter (−147/+13) (21Ducy P. Karsenty G. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 1858-1869Crossref PubMed Scopus (530) Google Scholar) was constructed to insert a PCR fragment with the NheI-HindIII sites into the cognate site of the pGL3 basic vector (Promega). A reporter plasmid containing a mouseOPN promoter (−253/+28) (7Craig A.M. Denhardt D.T. Gene. 1991; 100: 163-171Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar) was constructed to insert a PCR fragment with the BamHI-HindIII sites into the BglII-HindIII sites of the pGL3 basic vector. A reporter plasmid for a mouse ALP promoter (−1838/+81) (22Terao M. Studer M. Gianni M. Garattini E. Biochem. J. 1990; 268: 641-648Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar) was constructed to insert a PCR fragment with the HindIII sites into the cognate site of the pGL3 basic vector. An expression plasmid of each Cbfa1 isoform was generated to insert the entire coding sequence with the Kozak sequence into the BamHI (Type I) or BglII (Type II and III) site of the mammalian expression vector pSG5 (Stratagene, La Jolla, CA), respectively. Since our expression plasmids for Type II and IIICbfa1 were constructed using Type I as the template, they have one glutamine deletion in the Q-stretch region compared with the originally reported Osf2/Cbfa1 (1Ogawa E. Maruyama M. Kagoshima H. Inuzuka M. Lu J. Satake M. Shigesada K. Ito Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 6859-6863Crossref PubMed Scopus (564) Google Scholar, 10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar), but we verified the sequence of the Q-stretch region in our genomic clone (3Komori T. Yagi H. Nomura S. Yamaguchi A. Sasaki K. Deguchi K. Shimizu Y. Bronson R.T. Gao Y.H. Inada M. Sato M. Okamoto R. Kitamura Y. Yoshiki S. Kishimoto T. Cell. 1997; 89: 755-764Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3735) Google Scholar). An expression plasmid of mouse Cbfβ/Pebp2β cDNA (14Ogawa E. Inuzuka M. Maruyama M. Satake M. Naito-Fujimoto M. Ito Y. Shigesada K. Virology. 1993; 194: 314-331Crossref PubMed Scopus (455) Google Scholar) was generated to insert the entire coding sequence with the Kozak sequence into the EcoRI site of the pcDNA3.1(+) vector (Invitrogen, Carlsbad, CA). Xenopus BMP-4 (xBMP-4) cDNA was a kind gift from Dr. N. Ueno (National Institute for Basic Biology, Okazaki, Japan), and the expression plasmid of xBMP-4 cDNA was generated to insert the entire coding sequence with the Kozak sequence into the EcoRI site of pSG5. C3H10T1/2 cells grown to 40–60% confluence in a 9-cm Petri dish were transfected with a total of 25 μg of DNA by calcium phosphate co-precipitation (23Sasaki H. Harada H. Handa Y. Morino H. Suzawa M. Shimpo E. Katsumata T. Masuhiro Y. Matsuda K. Ebihara K. Ono T. Masushige S. Kato S. Biochemistry. 1995; 34: 370-377Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar). Each Cbfa1 expression plasmid or mock pSG5 (24 μg/dish) was co-transfected with 1 μg of pSV2neo (Life Technologies, Inc.), and the cells were treated with 450–500 μg/ml G418 (Life Technologies, Inc.) from 2 days after the transfection. C3H10T1/2 cells grown to 40–60% confluence in a 12-well multiplate were transfected with a total of 1 μg of DNA, using the transfection reagent LT-1 (Panvera Corp., Madison, WI). The reporter plasmid (0.2 μg/well) was co-transfected with the indicated amount of each expression vector for each type of Cbfa1, with or without its β-subunit (0.1 or 0.2 μg), and 0.3 μg of the reference plasmid pCH110 (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden). Bluescribe M13+ (Stratagene) was used as the carrier to adjust the DNA amount to 1 μg. After 48 h, the luciferase activity was measured using a luminometer (ML-3000, Dynatec Laboratories Inc., Chantilly, VA). Relative luciferase activity was calculated after normalizing the transfection efficiency by β-galactosidase activity expressed by pCH110 (23Sasaki H. Harada H. Handa Y. Morino H. Suzawa M. Shimpo E. Katsumata T. Masuhiro Y. Matsuda K. Ebihara K. Ono T. Masushige S. Kato S. Biochemistry. 1995; 34: 370-377Crossref PubMed Scopus (52) Google Scholar). RNA isolation and Northern hybridization were performed as described (18Harada H. Kuboi Y. Miki R. Honda C. Masushige S. Nakatsuka M. Koga Y. Kato S. Endocrinology. 1998; 139: 204-212Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar). After final washing, the membrane was exposed to a BAS imaging plate (Fuji Film, Tokyo, Japan), and the relative signal intensity was calculated. The partial-length cDNAs of rat ALP (24Thiede M.A. Yoon K. Golub E.E. Noda M. Rodan G.A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1988; 85: 319-323Crossref PubMed Scopus (116) Google Scholar) and rat type I collagen (ColI) (25Genovese C. Rowe D. Kream B. Biochemistry. 1984; 23: 6210-6216Crossref PubMed Scopus (576) Google Scholar) were cloned by PCR. Mouse OPNand OSC cDNA were kind gifts from Dr. S. Nomura (Osaka University Medical School, Osaka, Japan) (26Nomura S. Wills A.J. Edwards D.R. Heath J.K. Hogan B.L. J. Cell Biol. 1988; 106: 441-450Crossref PubMed Scopus (485) Google Scholar, 27Nakase T. Takaoka K. Hirakawa K. Hirota S. Takemura T. Onoue H. Takebayashi K. Kitamura Y. Nomura S. Bone Miner. 1994; 26: 109-122Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (104) Google Scholar). We first examined whether Cbfa1isoforms (Type I and Type II/III) are expressed in bone by RT-PCR analysis using specific primers for each isoform (Fig. 1a) because both Type II and Type III Cbfa1 isoforms are suggested to be translated from the same mRNA (28Thirunavukkarasu K. Mahajan M. McLarren K.W. Stifani S. Karsenty G. Mol. Cell. Biol. 1998; 18: 4197-4208Crossref PubMed Google Scholar). As shown in Fig. 1b, both types of transcripts were expressed in adult mouse bone. Note that the duplicate signals were detected by Type II/III-specific primers because of alternative splicing in this region, as reported by Xiao et al. (29Xiao Z.S. Thomas R. Hinson T.K. Quarles L.D. Gene (Amst .). 1998; 214: 187-197Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar) (insertion of 33 bp compared with the reportedOsf2/Cbfa1 sequence, data not shown). Since ALP is one of the early differentiation markers for osteoblasts (30Yamaguchi A. Katagiri T. Ikeda T. Wozney J.M. Rosen V. Wang E.A. Kahn A.J. Suda T. Yoshiki S. J. Cell Biol. 1991; 113: 681-687Crossref PubMed Scopus (662) Google Scholar, 31Katagiri T. Yamaguchi A. Komaki M. Abe E. Takahashi N. Ikeda T. Rosen V. Wozney J.M. Fujisawa-Sehara A. Suda T. J. Cell Biol. 1994; 127: 1755-1766Crossref PubMed Scopus (1314) Google Scholar, 32Yamaguchi A. Ishizuya T. Kintou N. Wada Y. Katagiri T. Wozney J.M. Rosen V. Yoshiki S. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996; 220: 366-371Crossref PubMed Scopus (308) Google Scholar, 33Katagiri T. Yamaguchi A. Ikeda T. Yoshiki S. Wozney J.M. Rosen V. Wang E.A. Tanaka H. Omura S. Suda T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990; 172: 295-299Crossref PubMed Scopus (466) Google Scholar), we investigated ALP activity in C3H10T1/2 cells transiently transfected with each isoform of Cbfa1 and/or xBMP-4. No ALP-positive cells were found in C3H10T1/2 cells without transfection. Six days after transfection with Cbfa1 isoforms, many ALP-positive cells appeared in the cells transfected with Type I or Type II Cbfa1 (Fig. 2,a-1). Transfection with xBMP-4 also induced ALP activity in C3H10T1/2 cells. The co-introduction of Type ICbfa1 and xBMP-4 synergistically increased the number of ALP-positive cells and activity (Fig. 2, b-1 and b-2), suggesting some functional linkage between Cbfa1 and BMP-4. No ALP-positive cells were induced by transfection with Type IIICbfa1 or by transfection with mock pSG5 (Fig. 2,a-1 and b-1). The effect of the transient transfection of Cbfa1 and/or xBMP4 onALP mRNA expression was also verified by RT-PCR (Fig. 2,a-2 and b-2). To further investigate functional differences in the effects of Cbfa1isoforms on osteoblast differentiation, we examined gene expressions related to osteoblast differentiation using stably transfected C3H10T1/2 cells with the three isoforms (Type I, II, and III) ofCbfa1. The expression of each exogenous Cbfa1isoform was ensured by Northern hybridization (Fig. 3a). C3H10T1/2 cells transfected with Type I or Type II Cbfa1 exhibited the expression of ALP mRNA, but no ALP mRNA was detected in the cells transfected with Type III Cbfa1(Fig. 3a). These results were consistent with those observed in the transient transfection experiments. OSC,OPN, and ColI gene expressions were induced or up-regulated in all cell types transfected with respective isoforms ofCbfa1. The highest induction of ALP gene expression was observed in Type I Cbfa1-transfected cells, and the highest induction of OSC gene expression was observed in the Type II Cbfa1-transfected cells, when each expression level was normalized by that of the corresponding transfected isoform of Cbfa1 (Fig. 3b). There were no apparent changes in the expression levels of OPN and ColI among isoforms of Cbfa1 (Fig. 3,a and b). Cbfa1 has the ability to enhance the expression of target genes by binding to its target sequence in the promoter and/or enhancer region (7Craig A.M. Denhardt D.T. Gene. 1991; 100: 163-171Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar, 8Geoffroy V. Ducy P. Karsenty G. J. Biol. Chem. 1995; 270: 30973-30979Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (159) Google Scholar, 9Sodek J. Li J.J. Kim R.H. Ogata Y. Yamauchi M. Connect. Tissue Res. 1996; 35: 23-31Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar, 34Zhang D.E. Hetherington C.J. Meyers S. Rhoades K.L. Larson C.J. Chen H.M. Hiebert S.W. Tenen D.G. Mol. Cell. Biol. 1996; 16: 1231-1240Crossref PubMed Google Scholar, 35Giese K. Kingsley C. Kirshner J.R. Grosschedl R. Genes Dev. 1995; 9: 995-1008Crossref PubMed Scopus (489) Google Scholar, 36Bruhn L. Munnerlyn A. Grosschedl R. Genes Dev. 1997; 11: 640-653Crossref PubMed Scopus (257) Google Scholar, 37Hernandez-Munain C. Krangel M.S. Mol. Cell. Biol. 1994; 14: 473-483Crossref PubMed Google Scholar). Thus, we next examined whether the difference of the ability to enhance target gene expression (Figs. 2 and 3) is caused at the transcriptional level, using a luciferase reporter gene assay system. When p6XOSE2-luc was used as a reporter plasmid (10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar, 21Ducy P. Karsenty G. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 1858-1869Crossref PubMed Scopus (530) Google Scholar), the transfection of expression vector for each Cbfa1 isoform efficiently induced reporter gene activity (Fig. 4a). The dose-response analysis of Cbfa1 plasmid revealed that Type II Cbfa1 induced the highest luciferase activity among the Cbfa1 isoforms (Fig. 5a). The co-introduction of each Cbfa1 isoform and its β-subunit induced no synergistic increase in the reporter gene activity, even in the presence of different amounts of their β-subunits (Figs.4a and 5a). When the reporter plasmid used was pOSC(−147/+13)-luc (10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar, 21Ducy P. Karsenty G. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 1858-1869Crossref PubMed Scopus (530) Google Scholar), which includes the mouse OSCpromoter region with one functional Cbfa1 binding site, each isoform ofCbfa1 induced luciferase activity when co-transfected with its β-subunit expression plasmid (Fig. 4b). The dose-response analysis of Cbfa1 revealed that Type ICbfa1 induced the highest luciferase activity with no exogenous β-subunit, and that each isoform induced luciferase activity similarly except for that at the highest amount of Type IIICbfa1 expression plasmid with the co-introduction of its β-subunit (Fig. 5b). When pOPN(−253/+28)-luc (which includes the mouse OPN promoter region having one functional Cbfa1 binding site near the Ets-1 binding site (7Craig A.M. Denhardt D.T. Gene. 1991; 100: 163-171Crossref PubMed Scopus (162) Google Scholar, 38Sato M. Morii E. Komori T. Kawahata H. Sugimoto M. Terai K. Shimizu H. Yasui T. Ogihara H. Yasui N. Ochi T. Kitamura Y. Ito Y. Nomura S. Oncogene. 1998; 17: 1517-1525Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar)) was used as a reporter plasmid, each isoform induced luciferase activity similarly, when no exogenous β-subunit was expressed (Figs. 4c and 5c). With the β-subunit expression plasmid, Type IIICbfa1 effectively induced luciferase activity especially with the highest amount of Cbfa1 expression plasmid, as was observed with pOSC(−147/+13)-luc (Fig. 5c). With the use of pALP(−1838/+81)-luc, which includes the bone/liver/kidney (B/L/K)-typeALP gene promoter region (22Terao M. Studer M. Gianni M. Garattini E. Biochem. J. 1990; 268: 641-648Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 39Kobayashi T. Sugimoto T. Kanzawa M. Chihara K. Biochem. Mol. Biol. Int. 1998; 44: 683-691PubMed Google Scholar) and one putative Cbfa1 binding site, no apparent enhancement of luciferase activity was observed by the transfection of each Cbfa1 expression plasmid alone or in combination with its β-subunit (Figs.4d and 5d). A dose-response analysis of Cbfa1 also revealed no obvious enhancement of luciferase activity (Fig. 5d).Figure 5Dose-response analysis of eachCbfa1 isoform on the transcription of various Cbfa1 target genes. 0.2 μg of various Cbfa1 target gene reporter plasmids were co-transfected with the indicated amount of the expression vectors for each Cbfa1 isoform in the absence or presence of its β-subunit (β) (0.2 μg) and 0.3 μg of the reference plasmid pCH110. Relative luciferase activity was calculated as described in Fig. 4. Values are the means of duplicate wells, and representative results of at least four independent experiments are shown. a, p6XOSE2-luc; b, pOSC(−147/+13)-luc;c, pOPN(−253/+28)-luc; d, pALP(−1838/+81)-luc.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) As noted earlier, there are several isoforms of Cbfa1(1Ogawa E. Maruyama M. Kagoshima H. Inuzuka M. Lu J. Satake M. Shigesada K. Ito Y. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 6859-6863Crossref PubMed Scopus (564) Google Scholar, 10Ducy P. Zhang R. Geoffroy V. Ridall A.L. Karsenty G. Cell. 1997; 89: 747-754Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3711) Google Scholar, 16Stewart M. Terry A. Hu M. O'Hara M. Blyth K. Baxter E. Cameron E. Onions D.E. Neil J.C. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 8646-8651Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar), but the function of each isoform has n

Runx2 protein is first detected in preosteoblasts, and the expression is upregulated in immature osteoblasts, but downregulated in mature osteoblasts. Runx2 is the first transcription factor required for determination of the osteoblast lineage, while Sp7 and canonical Wnt-signaling further direct the fate of mesenchymal cells to osteoblasts, blocking their differentiation into chondrocytes. Runx2 induces the differentiation of multipotent mesenchymal cells into immature osteoblasts, directing the formation of immature bone, but Runx2 inhibits osteoblast maturation and mature bone formation. Normally, the protein level of Runx2 in osteoblasts reduces during bone development, and osteoblasts acquire mature phenotypes, which are required for mature bone formation. Furthermore, Runx2 triggers the expression of major bone matrix genes during the early stages of osteoblast differentiation, but Runx2 is not essential for the maintenance of these gene expressions in mature osteoblasts.

Targeted disruption of core binding factor α1 (Cbfa1) showed that Cbfa1 is an essential transcription factor in osteoblast differentiation and bone formation. Furthermore, both in vitro and in vivo studies showed that Cbfa1 plays important roles in matrix production and mineralization. However, it remains to be clarified how Cbfa1 controls osteoblast differentiation, bone formation, and bone remodelling. To understand fully the physiological functions of Cbfa1, we generated transgenic mice that overexpressed Cbfa1 in osteoblasts using type I collagen promoter. Unexpectedly, Cbfa1 transgenic mice showed osteopenia with multiple fractures. Cortical bone, which was thin, porous, and enriched with osteopontin, was invaded by osteoclasts, despite the absence of acceleration of osteoclastogenesis. Although the number of neonatal osteoblasts was increased, their function was impaired in matrix production and mineralization. Furthermore, terminally differentiated osteoblasts, which strongly express osteocalcin, and osteocytes were diminished greatly, whereas less mature osteoblasts expressing osteopontin accumulated in adult bone. These data indicate that immature organization of cortical bone, which was caused by the maturational blockage of osteoblasts, led to osteopenia and fragility in transgenic mice, demonstrating that Cbfa1 inhibits osteoblast differentiation at a late stage.

Runx2 and phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)–Akt signaling play important roles in osteoblast and chondrocyte differentiation. We investigated the relationship between Runx2 and PI3K-Akt signaling. Forced expression of Runx2 enhanced osteoblastic differentiation of C3H10T1/2 and MC3T3-E1 cells and enhanced chondrogenic differentiation of ATDC5 cells, whereas these effects were blocked by treatment with IGF-I antibody or LY294002 or adenoviral introduction of dominant-negative (dn)–Akt. Forced expression of Runx2 or dn-Runx2 enhanced or inhibited cell migration, respectively, whereas the enhancement by Runx2 was abolished by treatment with LY294002 or adenoviral introduction of dn-Akt. Runx2 up-regulated PI3K subunits (p85 and p110β) and Akt, and their expression patterns were similar to that of Runx2 in growth plates. Treatment with LY294002 or introduction of dn-Akt severely diminished DNA binding of Runx2 and Runx2-dependent transcription, whereas forced expression of myrAkt enhanced them. These findings demonstrate that Runx2 and PI3K-Akt signaling are mutually dependent on each other in the regulation of osteoblast and chondrocyte differentiation and their migration.