// Miao Zhao 1 , Matthias Spiess 1 , Henrik J. Johansson 2 , Helene Olofsson 1 , Jianjiang Hu 1 , Janne Lehtiö 2 and Staffan Strömblad 1 1 Department of Biosciences and Nutrition, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden 2 Cancer Proteomics Mass Spectrometry, Department of Oncology-Pathology, Science for Life Laboratory, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden Correspondence to: Staffan Strömblad, email: Staffan.Stromblad@ki.se Keywords: p21-activated kinase 4, actin cytoskeleton, protein-protein interaction, mass spectrometry, VCA domain Received: May 13, 2017     Accepted: July 25, 2017     Published: August 18, 2017 ABSTRACT p21-activated kinase 4 (PAK4) regulates cell proliferation, apoptosis, cell motility and F-actin remodeling, but the PAK4 interactome has not been systematically analyzed. Here, we comprehensively characterized the human PAK4 interactome by iTRAQ quantitative mass spectrometry of PAK4-immunoprecipitations. Consistent with its multiple reported functions, the PAK4 interactome was enriched in diverse protein networks, including the 14-3-3, proteasome, replication fork, CCT and Arp2/3 complexes. Because PAK4 co-immunoprecipitated most subunits of the Arp2/3 complex, we hypothesized that PAK4 may play a role in Arp2/3 dependent actin regulation. Indeed, we found that PAK4 interacts with and phosphorylates the nucleation promoting factor N-WASP at Ser484/Ser485 and promotes Arp2/3-dependent actin polymerization in vitro. Also, PAK4 ablation in vivo reduced N-WASP Ser484/Ser485 phosphorylation and altered the cellular balance between G- and F-actin as well as the actin organization. By presenting the PAK4 interactome, we here provide a powerful resource for further investigations and as proof of principle, we also indicate a novel mechanism by which PAK4 regulates actin cytoskeleton remodeling.

A farnesylated and methylated form of prelamin A called progerin causes Hutchinson-Gilford progeria syndrome (HGPS). Inhibiting progerin methylation by inactivating the isoprenylcysteine carboxylmethyltransferase (ICMT) gene stimulates proliferation of HGPS cells and improves survival of Zmpste24-deficient mice. However, we don't know whether Icmt inactivation improves phenotypes in an authentic HGPS mouse model. Moreover, it is unknown whether pharmacologic targeting of ICMT would be tolerated by cells and produce similar cellular effects as genetic inactivation. Here, we show that knockout of Icmt improves survival of HGPS mice and restores vascular smooth muscle cell numbers in the aorta. We also synthesized a potent ICMT inhibitor called C75 and found that it delays senescence and stimulates proliferation of late-passage HGPS cells and Zmpste24-deficient mouse fibroblasts. Importantly, C75 did not influence proliferation of wild-type human cells or Zmpste24-deficient mouse cells lacking Icmt, indicating drug specificity. These results raise hopes that ICMT inhibitors could be useful for treating children with HGPS.

Lung cancer progression relies on angiogenesis, which is a response to hypoxia typically coordinated by hypoxia-inducible transcription factors (HIFs), but growing evidence indicates that transcriptional programs beyond HIFs control tumor angiogenesis. Here, we show that the redox-sensitive transcription factor BTB and CNC homology 1 (BACH1) controls the transcription of a broad range of angiogenesis genes. BACH1 is stabilized by lowering ROS levels; consequently, angiogenesis gene expression in lung cancer cells, tumor organoids, and xenograft tumors increased substantially following administration of vitamins C and E and N-acetylcysteine in a BACH1-dependent fashion under normoxia. Moreover, angiogenesis gene expression increased in endogenous BACH1-overexpressing cells and decreased in BACH1-knockout cells in the absence of antioxidants. BACH1 levels also increased upon hypoxia and following administration of prolyl hydroxylase inhibitors in both HIF1A-knockout and WT cells. BACH1 was found to be a transcriptional target of HIF1α, but BACH1's ability to stimulate angiogenesis gene expression was HIF1α independent. Antioxidants increased tumor vascularity in vivo in a BACH1-dependent fashion, and overexpressing BACH1 rendered tumors sensitive to antiangiogenesis therapy. BACH1 expression in tumor sections from patients with lung cancer correlated with angiogenesis gene and protein expression. We conclude that BACH1 is an oxygen- and redox-sensitive angiogenesis transcription factor.

The low reproducibility of scientific data published in articles has recently become a cause of concern in many scientific fields. Data involving light microscopy is no exception. The low awareness of researchers of the technologies they use in their research has been identified as one of the main causes of the problem. Potential solutions have hinted at the need to improve technological and methodological education within research. Despite the pivotal role of microscopy core facilities in the education of researchers being well documented, facility staff (FS) often learn their trade on the job, without receiving themselves any structured education about the technology they teach others to use. Additionally, despite endorsing an important role at the highest level of education, most FS never receive any training in pedagogy, the field of research on teaching and learning methods. In this article, we argue that the low level of awareness that researchers have of microscopy stems from a knowledge gap formed between them and microscopy FS during training routines. On the one hand, FS consider that their teaching task is to explain what is needed to produce reliable data. On the other, despite understanding what is being taught, researchers fail to learn the most challenging aspects of microscopy, those involving their judgement and reasoning. We suggest that the misunderstanding between FS and researchers is due to FS not being educated in pedagogy and thus often confusing understanding and learning. To bridge this knowledge gap and improve the quality of the microscopy education available to researchers, we propose a paradigm shift where training staff at technological core facilities be acknowledged as full-fledged teachers and offered structured education not only in the technology they teach but also in pedagogy. We then suggest that training routines at facilities be upgraded to follow the principles of the Constructive Alignment pedagogical method. We give an example of how this can be applied to existing microscopy training routines. We also describe a model to define where the responsibility of FS in training researchers begins and ends. This involves a major structural change where university staff involved in teaching research technologies themselves receive appropriate education. For this to be achieved, we advocate that funding agencies, universities, microscopy and core facility organisations mobilise resources of time and funding. Such changes may involve funding the creation and development of 'Train-the-trainer' type of courses and giving incentives for FS to upgrade their technological and pedagogical knowledge, for example by including them in career paths. We believe that this paradigm shift is necessary to improve the level of microscopy education and ultimately the reproducibility of published data.

Cells probe their microenvironment using membrane protrusion-retraction cycles. Spatiotemporal coordination of Rac1 and RhoA GTP-binding activities initiates and reinforces protrusions and retractions, but the control of their finite lifetime remains unclear. We examined the relations of Rac1 and RhoA GTP-binding levels to key protrusion and retraction events, as well as to cell-ECM traction forces at physiologically relevant ECM stiffness. High RhoA-GTP preceded retractions and Rac1-GTP elevation before protrusions. Notable temporal Rac1-GTP nadirs and peaks occurred at the maximal edge velocity of local membrane protrusions and retractions, respectively, followed by declined edge velocity. Moreover, altered local Rac1-GTP consistently preceded similarly altered traction force. Local optogenetic Rac1-GTP perturbations defined a function of Rac1 in restricting protrusions and retractions and in promoting local traction force. Together, we show that Rac1 plays a fundamental role in restricting the size and durability of protrusions and retractions, plausibly in part through controlling traction forces.

High-content image-based cell phenotyping provides fundamental insights into a broad variety of life science disciplines. Striving for accurate conclusions and meaningful impact demands high reproducibility standards, with particular relevance for high-quality open-access data sharing and meta-analysis. However, the sources and degree of biological and technical variability, and thus the reproducibility and usefulness of meta-analysis of results from live-cell microscopy, have not been systematically investigated. Here, using high-content data describing features of cell migration and morphology, we determine the sources of variability across different scales, including between laboratories, persons, experiments, technical repeats, cells, and time points. Significant technical variability occurred between laboratories and, to lesser extent, between persons, providing low value to direct meta-analysis on the data from different laboratories. However, batch effect removal markedly improved the possibility to combine image-based datasets of perturbation experiments. Thus, reproducible quantitative high-content cell image analysis of perturbation effects and meta-analysis depend on standardized procedures combined with batch correction.

Traction Force Microscopy (TFM) is a technique used to determine the tensions that a biological cell conveys to the underlying surface. Typically, TFM requires culturing cells on gels with fluorescent beads, followed by bead displacement calculations. We present a new method allowing to predict those forces from a regular fluorescent image of the cell. Using Deep Learning, we trained a Bayesian Neural Network adapted for pixel regression of the forces and show that it generalises on different cells of the same strain. The predicted forces are computed along with an approximated uncertainty, which shows whether the prediction is trustworthy or not. Using the proposed method could help estimating forces when calculating non-trivial bead displacements and can also free one of the fluorescent channels of the microscope. Code is available at https://github.com/wahlby-lab/InSilicoTFM.

Abstract High-content image-based cell phenotyping provides fundamental insights in a broad variety of life science areas. Striving for accurate conclusions and meaningful impact demands high reproducibility standards, even more importantly with the advent of data sharing initiatives. However, the sources and degree of biological and technical variability, and thus the reproducibility and usefulness of meta-analysis of results from live-cell microscopy have not been systematically investigated. Here, using high content data describing features of cell migration and morphology, we determine the sources of variability across different scales, including between laboratories, persons, experiments, technical repeats, cells and time points. Significant technical variability occurred between laboratories, providing low value to direct meta-analysis on the data from different laboratories. However, batch effect removal markedly improved the possibility to combine image-based datasets of perturbation experiments. Thus, reproducible quantitative high-content cell image data and meta-analysis depend on standardized procedures and batch correction applied to studies of perturbation effects.

To establish a new, real time, dynamic and direct optical detection method for mast cell degranulation caused by anaphylactoid reaction.A CD63-GFP plasmid was constructed and introduced steadily into rat basophilic leukemia (RBL-2H3) cells. The movements of CD63-GFP, which was located on both the granule membranes and the plasma membranes of RBL cells stimulated by Compound 48/80, were studied by confocal laser scanning microscope (CLSM) and total internal reflection fluorescence microscope (TIRFM) both inside and on the surface of living RBL-2H3 cells.Before antigen stimulation, most granules with CD63-GFP hardly moved in RBL cells. However, after antigen stimulation, the granules moved dramatically. They reached the plasma membranes in a few minutes and fused with them instantaneously. The velocity of the granule movement toward the plasma membranes on antigen stimulation was calculated to be 0.05 micron x s(-1).Analysis of the movement of each granule provided a new insight into the elementary process of degranulation. The method is rapid, sensitive and reliable, which could be used as a new detection method for anaphylactoid reaction in vitro.