Abstract The extreme durability of polyethylene terephthalate (PET) debris has rendered it a long-term environmental burden. At the same time, current recycling efforts still lack sustainability. Two recently discovered bacterial enzymes that specifically degrade PET represent a promising solution. First, Ideonella sakaiensis PETase, a structurally well-characterized consensus α/β-hydrolase fold enzyme, converts PET to mono-(2-hydroxyethyl) terephthalate (MHET). MHETase, the second key enzyme, hydrolyzes MHET to the PET educts terephthalate and ethylene glycol. Here, we report the crystal structures of active ligand-free MHETase and MHETase bound to a nonhydrolyzable MHET analog. MHETase, which is reminiscent of feruloyl esterases, possesses a classic α/β-hydrolase domain and a lid domain conferring substrate specificity. In the light of structure-based mapping of the active site, activity assays, mutagenesis studies and a first structure-guided alteration of substrate specificity towards bis-(2-hydroxyethyl) terephthalate (BHET) reported here, we anticipate MHETase to be a valuable resource to further advance enzymatic plastic degradation.

While plastics like polyethylene terephthalate can already be degraded efficiently by the activity of hydrolases, other synthetic polymers like polyurethanes (PUs) and polyamides (PAs) largely resist biodegradation. In this study, we solved the first crystal structure of the metagenomic urethanase UMG-SP-1, identified highly flexible loop regions to comprise active site residues, and targeted a total of 20 potential hot spots by site-saturation mutagenesis. Engineering campaigns yielded variants with single mutations, exhibiting almost 3- and 8-fold improved activity against highly stable N-aryl urethane and amide bonds, respectively. Furthermore, we demonstrated the release of the corresponding monomers from a thermoplastic polyester-PU and a PA (nylon 6) by the activity of a single, metagenome-derived urethanase after short incubation times. Thereby, we expanded the hydrolysis profile of UMG-SP-1 beyond the reported low-molecular weight carbamates. Together, these findings promise advanced strategies for the bio-based degradation and recycling of plastic materials and waste, aiding efforts to establish a circular economy for synthetic polymers.

Abstract The AMP-forming acetyl-CoA synthetase is regulated by lysine acetylation both in bacteria and eukaryotes. However, the underlying mechanism is poorly understood. The Bacillus subtilis acetyltransferase AcuA and the AMP-forming acetyl-CoA synthetase AcsA form an AcuA•AcsA complex, dissociating upon lysine acetylation of AcsA by AcuA. Crystal structures of AcsA from Chloroflexota bacterium in the apo form and in complex with acetyl-adenosine-5′-monophosphate (acetyl-AMP) support the flexible C-terminal domain adopting different conformations. AlphaFold2 predictions suggest binding of AcuA stabilizes AcsA in an undescribed conformation. We show the AcuA•AcsA complex dissociates upon acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA) dependent acetylation of AcsA by AcuA. We discover an intrinsic phosphotransacetylase activity enabling AcuA•AcsA generating acetyl-CoA from acetyl-phosphate (AcP) and coenzyme A (CoA) used by AcuA to acetylate and inactivate AcsA. Here, we provide mechanistic insights into the regulation of AMP-forming acetyl-CoA synthetases by lysine acetylation and discover an intrinsic phosphotransacetylase allowing modulation of its activity based on AcP and CoA levels.

Abstract Coenzyme F 420 is a microbial redox cofactor that is increasingly used for biocatalytic applications. Recently, diversified biosynthetic routes to F 420 and the discovery of a derivative, 3PG-F 420 , were reported. 3PG-F 420 is formed via activation of 3-phospho-D-glycerate (3-PG) by CofC, but the structural basis of substrate binding, its evolution, as well as the role of CofD in substrate selection remained elusive. Here, we present a crystal structure of the 3-PG-activating CofC from Mycetohabitans sp. B3 and define amino acids governing substrate specificity. Site-directed mutagenesis enabled bidirectional switching of specificity and thereby revealed the short evolutionary trajectory to 3PG-F 420 formation. Furthermore, CofC stabilized its product, thus confirming the structure of the unstable molecule, revealing its binding mode and suggesting a substrate channeling mechanism to CofD. The latter enzyme was shown to significantly contribute to the selection of related intermediates to control the specificity of the combined biosynthetic CofC/D step. Taken together, this work closes important knowledge gaps and opens up perspectives for the discovery, enhanced biotechnological production, and engineering of coenzyme F 420 derivatives in the future. Importance The microbial cofactor F 420 is crucial for processes like methanogenesis, antibiotics biosynthesis, drug resistance, and biocatalysis. Recently, a novel derivative of F 420 (3PG-F 420 ) was discovered, enabling the production and use of F 420 in heterologous hosts. By analyzing the crystal structure of a CofC homolog whose substrate choice leads to formation of 3PG-F 420 , we defined amino acid residues governing the special substrate selectivity. A diagnostic residue enabled reprogramming of the substrate specificity, thus mimicking the evolution of the novel cofactor derivative and successfully guiding the identification of further 3-PG-activating enzymes. Furthermore, a labile reaction product of CofC was revealed that has not been directly detected so far and CofD was shown to provide as another layer of specificity of the combined CofC/D reaction, thus controlling the initial substrate choice of CofC. The latter finding resolves a current debate in the literature about the starting point of F 420 biosynthesis in various organisms.

3,4-bridged indoles are underrepresented among the vast number of indoles described in the literature. Attempts to access 3,4-macrocyclized indoles led to the unexpected formation of a novel tetracyclic indole through intramolecular acid-catalyzed ring contraction. The herein-established one-step synthetic route provides an excellent medicinal chemistry platform for the construction of screening libraries covering a unique chemical space of indoles.

Abstract Während Kunststoffe wie Polyethylenterephthalat (PET) bereits effizient durch die Aktivität von Hydrolasen abgebaut werden können, sind andere synthetische Polymere wie Polyurethane (PUs) und Polyamide (PAs) weitgehend resistent gegenüber einem biologischen Abbau. In dieser Studie lösten wir die erste Kristallstruktur der metagenomischen Urethanase UMG‐SP‐1, identifizierten hochflexible Loopregionen, die Reste des aktiven Zentrums enthalten, und untersuchten insgesamt 20 potenzielle Hotspots mittels Sättigungsmutagenese. Die durch Protein Engineering erzeugten Einzelmutanten wiesen eine fast 3‐ bzw. 8‐fach verbesserte Aktivität gegenüber hochstabilen N ‐Arylurethan‐ und Amidbindungen auf. Darüber hinaus konnte die Freisetzung der entsprechenden Monomere aus einem thermoplastischen Polyester‐PU und einem PA (Nylon 6) durch die Aktivität einer einzigen, metagenomischen Urethanase nach kurzer Inkubationszeit nachgewiesen werden. Dadurch konnte das Hydrolyseprofil von UMG‐SP‐1 über die bekannten niedermolekularen Carbamate hinaus erweitert werden und erschließt so neue Möglichkeiten für den enzymatischen Abbau und das Recycling von Kunststoffen und Plastikabfällen. Damit unterstützt diese Studie Bemühungen um die Verbesserung einer Kreislaufwirtschaft für synthetische Polymere.