CD163, also referred to as M130, a member of the scavenger receptor cysteine-rich family (SRCR) is exclusively expressed on cells of the monocyte lineage. In freshly isolated monocytes the CD14bright CD16+ monocyte subset revealed the highest expression of CD163 among all monocyte subsets. CD163 mRNA and protein expression is up-regulated during macrophage colony-stimulating factor (M-CSF)-dependent phagocytic differentiation of human blood monocytes. In contrast, monocytic cells treated with GM-CSF and interleukin-4 (IL-4) for dendritic differentiation down-regulate this antigen. CD163 expression is also suppressed by proinflammatory mediators like lipopolysaccharide (LPS), interferon-gamma (IFN-gamma), and tumor necrosis factor alpha, whereas IL-6 and the antiinflammatory cytokine interleukin-10 (IL-10) strongly up-regulate CD163 mRNA in monocytes and macrophages. The effects of the immunosuppressants dexamethasone, cyclosporin A (CA), and cortisol differ in their capacity to influence CD163 mRNA levels. Our results demonstrate that CD163 expression in monocytes/macrophages is regulated by proinflammatory and antiinflammatory mediators. This expression pattern implies a functional role of CD 163 in the antiinflammatory response of monocytes.

We have cloned the full-length cDNA for the human ATP binding cassette transporter 1 (hABC1). The 6603-bp open reading frame encodes a polypeptide of 2201 amino acids resulting in a deduced molecular weight of 220 kDa. The hABC1 cDNA is highly homologous (62%) to the human rim ABC transporter (ABCR). hABC1 is expressed in a variety of human tissues with highest expression levels found in placenta, liver, lung, adrenal glands, and fetal tissues. We demonstrate that the hABC1 expression is induced during differentiation of human monocytes into macrophages in vitro. In macrophages, both the hABC1 mRNA and protein expression are upregulated in the presence of acetylated low-density lipoprotein (AcLDL). The AcLDL-induced increase in hABC1 expression is reversed by cholesterol depletion mediated by the addition of high-density lipoprotein (HDL3). Our data, demonstrating sterol-dependent regulation of hABC1 in human monocytes/macrophages, suggest a novel role for this transporter molecule in membrane lipid transport.

Analysis of free cholesterol (FC) is not well suited for electrospray ionization (ESI); however, cholesteryl ester (CE) form ammonium adducts in positive ion mode and generate a fragment ion of m/z 369 upon collision-induced fragmentation. In order to allow parallel analysis of FC and CE using ESI tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS), we developed an acetyl chloride derivatization method to convert FC to cholesteryl acetate (CE 2:0). Derivatization conditions were chosen to provide a quantitative conversion of FC to CE 2:0 without transesterification of naturally occurring CE species. FC and CE were analyzed by direct flow injection analysis using a fragment of m/z 369 in a combination of selected reaction monitoring (SRM) and precursor ion scan for FC and CE, respectively. Quantification was achieved using deuterated D7-FC and CE 17:0/CE 22:0 as internal standards as well as calibration lines generated by addition of FC and naturally occurring CE species to the respective sample matrix. The developed assay showed a precision and detection limit sufficient for routine analysis. A run time of 1.3 min and automated data analysis allow high throughput analysis. Loading of human skin fibroblast and monocyte derived macrophages with stable isotope labeled FC showed a potential application of this method in metabolism studies. Together with existing mass spectrometry methodologies for lipid analysis, the present methodology will provide a useful tool for clinical and biochemical studies and expands the lipid spectrum that can be analyzed from one lipid sample on a single instrumental platform.

Malignant glioma belong to the most aggressive neoplasms in humans with no successful treatment available. Patients suffering from glioblastoma multiforme (GBM), the highest-grade glioma, have an average survival time of only around one year after diagnosis. Both microglia and peripheral macrophages/monocytes accumulate within and around glioma, but fail to exert effective anti-tumor activity and even support tumor growth. Here we use microarray analysis to compare the expression profiles of glioma-associated microglia/macrophages and naive control cells. Samples were generated from CD11b+ MACS-isolated cells from naïve and GL261-implanted C57BL/6 mouse brains. Around 1000 genes were more than 2-fold up- or downregulated in glioma-associated microglia/macrophages when compared to control cells. A comparison with published data sets of M1, M2a,b,c-polarized macrophages revealed a gene expression pattern that has only partial overlap with any of the M1 or M2 gene expression patterns. Samples for the qRT-PCR validation of selected M1 and M2a,b,c-specific genes were generated from two different glioma mouse models and isolated by flow cytometry to distinguish between resident microglia and invading macrophages. We confirmed in both models the unique glioma-associated microglia/macrophage phenotype including a mixture of M1 and M2a,b,c-specific genes. To validate the expression of these genes in human we MACS-isolated CD11b+ microglia/macrophages from GBM, lower grade brain tumors and control specimens. Apart from the M1/M2 gene analysis, we demonstrate that the expression of Gpnmb and Spp1 is highly upregulated in both murine and human glioma-associated microglia/macrophages. High expression of these genes has been associated with poor prognosis in human GBM, as indicated by patient survival data linked to gene expression data. We also show that microglia/macrophages are the predominant source of these transcripts in murine and human GBM. Our findings provide new potential targets for future anti-glioma therapy.

The translocator protein (18 kDa) (TSPO) is a mitochondrial protein expressed on reactive glial cells and a biomarker for gliosis in the brain. TSPO ligands have been shown to reduce neuroinflammation in several mouse models of neurodegeneration. Here, we analyzed TSPO expression in mouse and human retinal microglia and studied the effects of the TSPO ligand XBD173 on microglial functions. TSPO protein analyses were performed in retinoschisin-deficient mouse retinas and human retinas. Lipopolysaccharide (LPS)-challenged BV-2 microglial cells were treated with XBD173 and TSPO shRNAs in vitro and pro-inflammatory markers were determined by qRT-PCR. The migration potential of microglia was determined with wound healing assays and the proliferation was studied with Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysis. Microglial neurotoxicity was estimated by nitrite measurement and quantification of caspase 3/7 levels in 661 W photoreceptors cultured in the presence of microglia-conditioned medium. The effects of XBD173 on filopodia formation and phagocytosis were analyzed in BV-2 cells and human induced pluripotent stem (iPS) cell-derived microglia (iPSdM). The morphology of microglia was quantified in mouse retinal explants treated with XBD173. TSPO was strongly up-regulated in microglial cells of the dystrophic mouse retina and also co-localized with microglia in human retinas. Constitutive TSPO expression was high in the early postnatal Day 3 mouse retina and declined to low levels in the adult tissue. TSPO mRNA and protein were also strongly induced in LPS-challenged BV-2 microglia while the TSPO ligand XBD173 efficiently suppressed transcription of the pro-inflammatory marker genes chemokine (C-C motif) ligand 2 (CCL2), interleukin 6 (IL6) and inducible nitric oxide (NO)-synthase (iNOS). Moreover, treatment with XBD173 significantly reduced the migratory capacity and proliferation of microglia, their level of NO secretion and their neurotoxic activity on 661 W photoreceptor cells. Furthermore, XBD173 treatment of murine and human microglial cells promoted the formation of filopodia and increased their phagocytic capacity to ingest latex beads or photoreceptor debris. Finally, treatment with XBD173 reversed the amoeboid alerted phenotype of microglial cells in explanted organotypic mouse retinal cultures after challenge with LPS. These findings suggest that TSPO is highly expressed in reactive retinal microglia and a promising target to control microglial reactivity during retinal degeneration.

Abstract Defects in primary or motile cilia result in a variety of human pathologies, and retinal degeneration is frequently associated with these so-called ciliopathies. We show that homozygosity for a truncating variant in CEP162, a centrosome and microtubule-associated protein required for transition zone (TZ) assembly during ciliogenesis and neuronal differentiation in the retina, causes late-onset retinitis pigmentosa in 2 unrelated families. The mutant CEP162-E646R*5 protein is expressed and properly localized to the mitotic spindle but missing from the basal body in primary and photoreceptor cilia. This impairs recruitment of TZ components to the basal body and corresponds to complete loss of CEP162 function at the ciliary compartment, reflected by delayed formation of dysmorphic cilia. In contrast, rescue of increased cell death in the developing mouse retina after shRNA knockdown of Cep162 by expression of CEP162-E646R*5 indicates that the mutant retains its role for retinal neurogenesis. Human retinal degeneration thus results from specific loss of ciliary CEP162 function. Graphical abstract

Purpose: In the aging retina, persistent activation of microglia is known to play a key role in retinal degenerative diseases like age-related macular degeneration (AMD). Furthermore, dysregulation of the alternative complement pathway is generally accepted as the main driver for AMD disease progression and microglia are important producers of local complement and are equipped with complement receptors themselves. Here, we investigate the involvement of anaphylatoxin signaling, predominantly on Iba1+ cell activity, in light-induced retinal degeneration as a model for dry AMD, using anaphylatoxin receptor knockout (KO) mice. Methods: Bright white light with an intensity of 10,000 lux was applied for 30 minutes to complement component 3a receptor 1 (C3ar1) or complement component 5a receptor 1 (C5ar1) KO and wildtype (WT) mice. Analyses of transcriptome changes and migration activity of Iba1+ cells as well as retinal thickness were performed 4 days after light exposure. Results: Full body KO mice of either C3aR1 or C5aR1 were tested, but none led to mitigated migration of Iba1+ cells to the subretinal space or decreased expression of complement factors after light damage compared to WT mice. However, a partial rescue of retinal thickness was shown in C3aR1 KO mice, which was mirrored by significant less membrane attack complex (MAC) occurrence in the outer retina. Conclusions: We conclude that deletion of the anaphylatoxin receptor C3aR1 cannot modulate mononuclear phagocytes but diminishes retinal degeneration through interference with the complement pathway and thus decreased MAC assembling. C3aR1-targeted therapy may be considered for patients with dry AMD.