The long-term developmental and behavioral consequences of mammalian embryo culture are unknown. By altering the culture medium with the addition of FCS, we wanted to determine whether mouse embryos cultured under suboptimal conditions develop aberrant mRNA expression of imprinting genes at the blastocyst stage and whether fetal development, growth, and behavior of adult mice are affected. One-cell embryos obtained from superovulated female B6CBAF 1 mice were cultured for 4 days in K + -modified simplex optimized medium in the presence of either 10% FCS or 1 g/liter BSA. After embryo transfer, born animals were submitted to several developmental and behavior tests. The mRNA expression of some imprinting genes was significantly affected in blastocysts cultured in the presence of FCS. Two of the eight measures of preweaning development and some specific measures of neuromotor development, such as the walking activity, were delayed in the group originated with FCS. After 34 weeks, the weight of female mice cultured in vitro in the presence of FCS was significantly higher than controls. In addition, the locomotion activity of mice was altered at 5 and 15 months. Anatomopathological and histological analysis of animals at 20 months of age showed some large organs and an increase in pathologies. We have found that mice derived from embryos cultured with FCS exhibited specific behavioral alterations in anxiety and displayed deficiencies in implicit memories. Our data indicate that long-term programming of postnatal development, growth, and physiology can be affected irreversibly during the preimplantation period of embryo development by suboptimal in vitro culture.

We report the complete 6,530,228-bp genome sequence of the symbiotic nitrogen fixing bacterium Rhizobium etli . Six large plasmids comprise one-third of the total genome size. The chromosome encodes most functions necessary for cell growth, whereas few essential genes or complete metabolic pathways are located in plasmids. Chromosomal synteny is disrupted by genes related to insertion sequences, phages, plasmids, and cell-surface components. Plasmids do not show synteny, and their orthologs are mostly shared by accessory replicons of species with multipartite genomes. Some nodulation genes are predicted to be functionally related with chromosomal loci encoding for the external envelope of the bacterium. Several pieces of evidence suggest an exogenous origin for the symbiotic plasmid (p42d) and p42a. Additional putative horizontal gene transfer events might have contributed to expand the adaptive repertoire of R. etli , because they include genes involved in small molecule metabolism, transport, and transcriptional regulation. Twenty-three putative sigma factors, numerous isozymes, and paralogous families attest to the metabolic redundancy and the genomic plasticity necessary to sustain the lifestyle of R. etli in symbiosis and in the soil.

Genetic and environmental factors produce different levels of DNA damage in spermatozoa. Usually, DNA-fragmented spermatozoa (DFS) are used with intracytoplasmic sperm injection (ICSI) treatments in human reproduction, and use of DFS is still a matter of concern. The purpose of the present study was to investigate the long-term consequences on development and behavior of mice generated by ICSI with DFS. Using CD1 and B6D2F1 mouse strains, oocytes were injected with fresh spermatozoa or with frozen-thawed spermatozoa without cryoprotector. This treatment increased the percentage of TUNEL-positive spermatozoa, tail length as measured by comet assay, and loss of telomeres as measured by quantitative PCR. The ICSI-generated embryos were cultured for 24 h in KSOM, and 2-cell embryos were transferred into CD1 females. The DFS reduced both the rate of preimplantation embryo development and number of offspring. Immunofluorescence staining with an antibody against 5-methylcytosine showed a delay of 2 h on the active demethylation of male pronucleus in the embryos produced by ICSI. Moreover, ICSI affected gene transcription and methylation of some epigenetically regulated genes like imprinting, X-linked genes, and retrotransposon genes. At 3 and 12 mo of age, ICSI with DFS-produced animals and in vivo-fertilized controls were submitted to behavioral tests: locomotor activity (open field), exploratory/anxiety behavior (elevated plus maze, open field), and spatial memory (free-choice exploration paradigm in Y maze). Females produced by ICSI showed increased anxiety, lack of habituation pattern, deficit in short-term spatial memory, and age-dependent hypolocomotion in the open-field test (P < 0.05). Postnatal weight gain of mice produced by ICSI with fresh or frozen sperm was higher than that of their control counterparts from 16 wk on (P < 0.01). Anatomopathological analysis of animals at 16 mo of age showed some large organs and an increase in pathologies (33% of CD1 females produced with DFS presented some solid tumors in lungs and dermis of back or neck). Moreover, 20% of the B6D2F1 mice generated with DFS died during the first 5 mo of life, with 25% of the surviving animals showing premature aging symptoms, and 70% of the B6D2F1 mice generated with DFS died earlier than controls with different kind of tumors. We propose that depending on the level of DFS, oocytes may partially repair fragmented DNA, producing blastocysts able to implant and produce live offspring. The incomplete repair, however, may lead to long-term pathologies. Our data indicate that use of DFS in ICSI can generate effects that only emerge during later life, such as aberrant growth, premature aging, abnormal behavior, and mesenchymal tumors.

Abstract Although the European rabbit is an “endangered” species and a notorious biological model, the analysis and comparative characterization of new tissue sources of rabbit mesenchymal stem cells (rMSCs) has not been well studied. Here we report for the first time the isolation and characterization of rMSCs derived from an animal belonging to a natural rabbit population within the species native region. New rMSC lines were isolated from different tissues: oral mucosa (rOM-MSC), dermal skin (rDS-MSC), subcutaneous adipose tissue (rSCA-MSC), ovarian adipose tissue (rOA-MSC), oviduct (rO-MSC), and mammary gland (rMG-MSC). The six rMSC lines showed plastic adhesion with fibroblast-like morphology and were all shown to be positive for CD44 and CD29 expression (characteristic markers of MSCs), and negative for CD34 or CD45 expression. In terms of pluripotency features, all rMSC lines expressed NANOG, OCT4, and SOX2. Furthermore, all rMSC lines cultured under osteogenic, chondrogenic, and adipogenic conditions showed differentiation capacity. In conclusion, this study describes the isolation and characterization of new rabbit cell lines from different tissue origins, with a clear mesenchymal pattern. We show that rMSC do not exhibit differences in terms of morphological features, expression of the cell surface, and intracellular markers of pluripotency and in vitro differentiation capacities, attributable to their tissue of origin.