Summary

 Macrophages activated by the TLR4 agonist LPS undergo dramatic changes in their metabolic activity. We here show that LPS induces expression of the key metabolic regulator Pyruvate Kinase M2 (PKM2). Activation of PKM2 using two well-characterized small molecules, DASA-58 and TEPP-46, inhibited LPS-induced Hif-1α and IL-1β, as well as the expression of a range of other Hif-1α-dependent genes. Activation of PKM2 attenuated an LPS-induced proinflammatory M1 macrophage phenotype while promoting traits typical of an M2 macrophage. We show that LPS-induced PKM2 enters into a complex with Hif-1α, which can directly bind to the IL-1β promoter, an event that is inhibited by activation of PKM2. Both compounds inhibited LPS-induced glycolytic reprogramming and succinate production. Finally, activation of PKM2 by TEPP-46 in vivo inhibited LPS and Salmonella typhimurium-induced IL-1β production, while boosting production of IL-10. PKM2 is therefore a critical determinant of macrophage activation by LPS, promoting the inflammatory response.

Particulate crystals can activate the NLRP3 inflammasome. Moore and colleagues show that the scavenger protein CD36 contributes to sterile inflammation via uptake of soluble cholesterol and amyloid peptides that nucleate into intracellular crystals. Particulate ligands, including cholesterol crystals and amyloid fibrils, induce production of interleukin 1β (IL-1β) dependent on the cytoplasmic sensor NLRP3 in atherosclerosis, Alzheimer's disease and diabetes. Soluble endogenous ligands, including oxidized low-density lipoprotein (LDL), amyloid-β and amylin peptides, accumulate in such diseases. Here we identify an endocytic pathway mediated by the pattern-recognition receptor CD36 that coordinated the intracellular conversion of those soluble ligands into crystals or fibrils, which resulted in lysosomal disruption and activation of the NLRP3 inflammasome. Consequently, macrophages that lacked CD36 failed to elicit IL-1β production in response to those ligands, and targeting CD36 in atherosclerotic mice resulted in lower serum concentrations of IL-1β and accumulation of cholesterol crystals in plaques. Collectively, our findings highlight the importance of CD36 in the accrual and nucleation of NLRP3 ligands from within the macrophage and position CD36 as a central regulator of inflammasome activation in sterile inflammation.

Recent work in mice has shown that microRNA-33a is an important regulator of lipid metabolism and that its inhibition can increase plasma high-density lipoprotein (HDL) and decrease atherosclerosis. Rayner et al. take an important step in translating these findings to non-human primates (African green monkeys), which, like humans and unlike mice, express both miR-33a and miR-33b. They find that anti-miR-33 is effective at inhibiting both miR-33a and miR-33b. As seen in the mouse studies, anti-miR33 raised plasma HDL but had the additional beneficial effect of reducing very low-density lipoprotein triglycerides, making this type of 'antagomir' therapy a candidate method of treating dyslipidaemias that increase cardiovascular disease risk. Cardiovascular disease remains the leading cause of mortality in westernized countries, despite optimum medical therapy to reduce the levels of low-density lipoprotein (LDL)-associated cholesterol. The pursuit of novel therapies to target the residual risk has focused on raising the levels of high-density lipoprotein (HDL)-associated cholesterol in order to exploit its atheroprotective effects1. MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important post-transcriptional regulators of lipid metabolism and are thus a new class of target for therapeutic intervention2. MicroRNA-33a and microRNA-33b (miR-33a/b) are intronic miRNAs whose encoding regions are embedded in the sterol-response-element-binding protein genes SREBF2 and SREBF1 (refs 3–5), respectively. These miRNAs repress expression of the cholesterol transporter ABCA1, which is a key regulator of HDL biogenesis. Recent studies in mice suggest that antagonizing miR-33a may be an effective strategy for raising plasma HDL levels3,4,5 and providing protection against atherosclerosis6; however, extrapolating these findings to humans is complicated by the fact that mice lack miR-33b, which is present only in the SREBF1 gene of medium and large mammals. Here we show in African green monkeys that systemic delivery of an anti-miRNA oligonucleotide that targets both miR-33a and miR-33b increased hepatic expression of ABCA1 and induced a sustained increase in plasma HDL levels over 12 weeks. Notably, miR-33 antagonism in this non-human primate model also increased the expression of miR-33 target genes involved in fatty acid oxidation (CROT, CPT1A, HADHB and PRKAA1) and reduced the expression of genes involved in fatty acid synthesis (SREBF1, FASN, ACLY and ACACA), resulting in a marked suppression of the plasma levels of very-low-density lipoprotein (VLDL)-associated triglycerides, a finding that has not previously been observed in mice. These data establish, in a model that is highly relevant to humans, that pharmacological inhibition of miR-33a and miR-33b is a promising therapeutic strategy to raise plasma HDL and lower VLDL triglyceride levels for the treatment of dyslipidaemias that increase cardiovascular disease risk.

Plasma HDL levels have a protective role in atherosclerosis, yet clinical therapies to raise HDL levels have remained elusive. Recent advances in the understanding of lipid metabolism have revealed that miR-33, an intronic microRNA located within the SREBF2 gene, suppresses expression of the cholesterol transporter ABC transporter A1 (ABCA1) and lowers HDL levels. Conversely, mechanisms that inhibit miR-33 increase ABCA1 and circulating HDL levels, suggesting that antagonism of miR-33 may be atheroprotective. As the regression of atherosclerosis is clinically desirable, we assessed the impact of miR-33 inhibition in mice deficient for the LDL receptor (Ldlr–/– mice), with established atherosclerotic plaques. Mice treated with anti-miR33 for 4 weeks showed an increase in circulating HDL levels and enhanced reverse cholesterol transport to the plasma, liver, and feces. Consistent with this, anti-miR33–treated mice showed reductions in plaque size and lipid content, increased markers of plaque stability, and decreased inflammatory gene expression. Notably, in addition to raising ABCA1 levels in the liver, anti-miR33 oligonucleotides directly targeted the plaque macrophages, in which they enhanced ABCA1 expression and cholesterol removal. These studies establish that raising HDL levels by anti-miR33 oligonucleotide treatment promotes reverse cholesterol transport and atherosclerosis regression and suggest that it may be a promising strategy to treat atherosclerotic vascular disease.

Cellular metabolism is increasingly recognized as a controller of immune cell fate and function. MicroRNA-33 (miR-33) regulates cellular lipid metabolism and represses genes involved in cholesterol efflux, HDL biogenesis, and fatty acid oxidation. Here, we determined that miR-33–mediated disruption of the balance of aerobic glycolysis and mitochondrial oxidative phosphorylation instructs macrophage inflammatory polarization and shapes innate and adaptive immune responses. Macrophage-specific Mir33 deletion increased oxidative respiration, enhanced spare respiratory capacity, and induced an M2 macrophage polarization–associated gene profile. Furthermore, miR-33–mediated M2 polarization required miR-33 targeting of the energy sensor AMP-activated protein kinase (AMPK), but not cholesterol efflux. Notably, miR-33 inhibition increased macrophage expression of the retinoic acid–producing enzyme aldehyde dehydrogenase family 1, subfamily A2 (ALDH1A2) and retinal dehydrogenase activity both in vitro and in a mouse model. Consistent with the ability of retinoic acid to foster inducible Tregs, miR-33–depleted macrophages had an enhanced capacity to induce forkhead box P3 (FOXP3) expression in naive CD4+ T cells. Finally, treatment of hypercholesterolemic mice with miR-33 inhibitors for 8 weeks resulted in accumulation of inflammation-suppressing M2 macrophages and FOXP3+ Tregs in plaques and reduced atherosclerosis progression. Collectively, these results reveal that miR-33 regulates macrophage inflammation and demonstrate that miR-33 antagonism is atheroprotective, in part, by reducing plaque inflammation by promoting M2 macrophage polarization and Treg induction.

Mycobacterium tuberculosis (Mtb) survives in macrophages by evading delivery to the lysosome and promoting the accumulation of lipid bodies, which serve as a bacterial source of nutrients. We found that by inducing the microRNA (miRNA) miR-33 and its passenger strand miR-33*, Mtb inhibited integrated pathways involved in autophagy, lysosomal function and fatty acid oxidation to support bacterial replication. Silencing of miR-33 and miR-33* by genetic or pharmacological means promoted autophagy flux through derepression of key autophagy effectors (such as ATG5, ATG12, LC3B and LAMP1) and AMPK-dependent activation of the transcription factors FOXO3 and TFEB, which enhanced lipid catabolism and Mtb xenophagy. These data define a mammalian miRNA circuit used by Mtb to coordinately inhibit autophagy and reprogram host lipid metabolism to enable intracellular survival and persistence in the host.

Recent advances in immunometabolism link metabolic changes in stimulated macrophages to production of IL-1β, a crucial cytokine in the innate immune response to Mycobacterium tuberculosis. To investigate this pathway in the host response to M. tuberculosis, we performed metabolic and functional studies on human alveolar macrophages, human monocyte-derived macrophages, and murine bone marrow-derived macrophages following infection with the bacillus in vitro. M. tuberculosis infection induced a shift from oxidative phosphorylation to aerobic glycolysis in macrophages. Inhibition of this shift resulted in decreased levels of proinflammatory IL-1β and decreased transcription of PTGS2, increased levels of anti-inflammatory IL-10, and increased intracellular bacillary survival. Blockade or absence of IL-1R negated the impact of aerobic glycolysis on intracellular bacillary survival, demonstrating that infection-induced glycolysis limits M. tuberculosis survival in macrophages through induction of IL-1β. Drugs that manipulate host metabolism may be exploited as adjuvants for future therapeutic and vaccination strategies.

IL-10 is a potent anti-inflammatory cytokine that is crucial for down-regulating pro-inflammatory genes, which are induced by Toll-like receptor (TLR) signaling. In this study, we have examined whether modulation of microRNAs plays a role in the inhibitory effect of IL-10 on TLR4 signaling. Analyzing microRNAs known to be induced by TLR4, we found that IL-10 could inhibit the expression of miR-155 in response to lipopolysaccharide but had no effect on miR-21 or miR-146a. IL-10 inhibited miR-155 transcription from the BIC gene in a STAT3-dependent manner. This inhibitory effect of IL-10 on miR-155 led to an increase in the expression of the miR-155 target, SHIP1. This is the first example of IL-10 playing a role in microRNA function and suggests that through its inhibitory effect on miR-155, IL-10 has the ability to promote anti-inflammatory gene expression. IL-10 is a potent anti-inflammatory cytokine that is crucial for down-regulating pro-inflammatory genes, which are induced by Toll-like receptor (TLR) signaling. In this study, we have examined whether modulation of microRNAs plays a role in the inhibitory effect of IL-10 on TLR4 signaling. Analyzing microRNAs known to be induced by TLR4, we found that IL-10 could inhibit the expression of miR-155 in response to lipopolysaccharide but had no effect on miR-21 or miR-146a. IL-10 inhibited miR-155 transcription from the BIC gene in a STAT3-dependent manner. This inhibitory effect of IL-10 on miR-155 led to an increase in the expression of the miR-155 target, SHIP1. This is the first example of IL-10 playing a role in microRNA function and suggests that through its inhibitory effect on miR-155, IL-10 has the ability to promote anti-inflammatory gene expression.