LH/hCG receptors were disrupted by gene targeting in embryonic stem cells. The disruption resulted in infertility in both sexes. The gonads contained no receptor mRNA or receptor protein. Serum LH levels were greatly elevated, and FSH levels were moderately elevated in both sexes; estradiol and progesterone levels decreased but were not totally suppressed in females; testosterone levels were dramatically decreased and estradiol levels moderately elevated in males. The external and internal genitalia were grossly underdeveloped in both sexes. Abnormalities included ambiguous vaginal opening, abdominal testes, micropenis, dramatically decreased weights of the gonads and reproductive tract, arrested follicular growth beyond antral stage, disarray of seminiferous tubules, diminished number and hypotrophy of Leydig cells, and spermatogenic arrest beyond the round spermatid stage. LH/hCG receptor gene disruption had no effect on FSH receptor mRNA levels in ovaries and testes, progesterone receptor (PR) levels in ovaries and androgen receptor (AR) levels in testes. However, it caused a dramatic decrease in StAR and estrogen receptor-α (ERα) mRNA levels and an increase in ERβ mRNA levels in both ovaries and testes. Estradiol and progesterone replacement therapy in females and testosterone replacement in males, to determine whether phenotype and biochemical changes were a consequence of decreased gonadal steroid levels or due to a loss of LH signaling, revealed complete restoration of some and partial restoration of others. Nevertheless, the animals remained infertile. It is anticipated that the LH receptor knockout animals will increase our current understanding of gonadal and nongonadal actions of LH and hCG.

The possible presence of gonadotropin receptors in nonpregnant human uterus and human fetoplacental unit was investigated by light microscope immunocytochemistry using a monoclonal antibody to rat luteal hCG/LH receptors. The receptor antibody cross-reacted with human and bovine hCG/LH receptors and appears to be directed against the receptor rather than other proteins, including HLA class I antigens. Uterus and fetoplacental unit contained receptor antibody-binding sites, which indicates the presence of hCG/LH receptors. In the endometrium these receptors were present in glandular and luminal epithelial cells as well as in stromal cells. In the myometrium the receptors were detected in circular and elongated myometrial smooth muscle and vascular smooth muscle. Comparison of immunostaining intensities, which indicates the presence of different amounts of receptors, revealed that luminal and glandular epithelial cells contained more receptors than stromal cells. These cells, in turn, contained more receptors than myometrial and vascular smooth muscle. All cells in secretory phase uterine specimens contained more receptors than corresponding cells from the proliferative phase of the cycle. Midpregnancy placenta, amniotic epithelium, chorionic cytotrophoblasts, and decidual cells contained hCG/LH receptors. At term pregnancy, while receptors in fetal membranes and decidua continue to be detected, placental tissues did not show any detectable receptors unless the tissues were pretreated with neuraminidase. This indicated that term pregnancy placenta contain hCG/LH receptors masked by sialic acid residues. Comparison of immunostaining intensities suggested that syncytiotrophoblasts contained more receptors than cytotrophoblasts at midpregnancy; mesenchymal cells or blood vessels contained no detectable receptors. There were more receptors in decidua than in fetal membranes at mid- and term pregnancy. While the amniotic epithelial receptors decreased, the receptors in chorionic cytotrophoblasts and decidual cells increased from midto term pregnancy. In summary, hCG/LH receptors were demonstrated in the nonpregnant human uterus, human placenta, fetal membranes, and decidua. This indicates that hCG/LH may directly regulate functions of these tissues by endocrine, autocrine, or paracrine mechanisms.

Abstract The declining rates of male fertility pose a significant clinical challenge, primarily due to our limited understanding of the testicular interstitium, which is crucial for male reproductive health. Here, we conducted a comprehensive analysis of the single-cell transcriptomic landscape of the murine testicular interstitium across the postnatal lifespan. Our investigation unveiled a previously unrecognized population of Cd34 + /Sox4 + mesenchymal cells nestled within the interstitium, hinting at their potential as Leydig cell progenitors. During the aging process of Cd34 + /Sox4 + mesenchymal cells, we observed a decline in glutathione levels within the testicular interstitium. Remarkably, these Cd34 + /Sox4 + mesenchymal cells exhibited clonogenic self-renewal capacity and an impressive propensity to differentiate into Leydig cells. Intriguingly, when transplanted into Leydig cell-disrupted or failure models, Cd34 + /Sox4 + cells efficiently colonized the testicular interstitium, resulting in a notable increase in testosterone production. Exploring the epigenetic landscape, we identified critical transcription factors, most notably Sox4, governing the stem cell fate of Cd34 + /Sox4 + mesenchymal cells. Overall, this comprehensive reference atlas of lifespan testicular Leydig cells presents significant findings that may guide the development of cell-based strategies for treating testicular hypogonadism in elderly individuals.

Abstract Leydig cell failure (LCF) caused by gene mutation results in testosterone deficiency and infertility. Serum testosterone levels can be recovered via testosterone replacement; however, established therapies have shown limited success in restoring fertility. Here, we used a luteinizing hormone/choriogonadotrophin receptor ( Lhcgr )-deficient mouse model of genetic LCF to investigate the feasibility of gene therapy for restoring testosterone production and fertility. We screened several adeno-associated virus (AAV) serotypes and identified AAV8 as an efficient vector to drive exogenous Lhcgr expression in progenitor Leydig cells through interstitial injection. We observed considerable testosterone recovery and Leydig cell maturation after AAV8-Lhcgr treatment in pubertal Lhcgr -/- mice. This gene therapy substantially recovered sexual development, partially restored spermatogenesis and effectively produced fertile offspring. Furthermore, these favorable effects could be reproduced in adult Lhcgr -/- mice. Our proof-of-concept experiments in this mouse model demonstrate that AAV-mediated gene therapy may represent a promising therapeutic approach for patients with genetic LCF.

Abstract Leydig cell failure (LCF) caused by gene mutations leads to testosterone deficiency, infertility and reduced physical function. Adeno‐associated virus serotype 8 (AAV8)‐mediated gene therapy shows potential in treating LCF in the Lhcgr‐deficient ( Lhcgr −/− ) mouse model. However, the gene‐treated mice still cannot naturally sire offspring, indicating the modestly restored testosterone and spermatogenesis in AAV8‐treated mice remain insufficient to support natural fertility. Recognizing this, we propose that enhancing gene delivery could yield superior results. Here, we screened a panel of AAV serotypes through in vivo transduction of mouse testes and identified AAVDJ as an impressively potent vector for testicular cells. Intratesticular injection of AAVDJ achieved markedly efficient transduction of Leydig cell progenitors, marking a considerable advance over conventional AAV8 vectors. AAVDJ‐Lhcgr gene therapy was well tolerated and resulted in significant recovery of testosterone production, substantial improvement in sexual development, and remarkable restoration of spermatogenesis in Lhcgr −/− mice. Notably, this therapy restored fertility in Lhcgr −/− mice through natural mating, enabling the birth of second‐generation. Additionally, this treatment led to remarkable improvements in adipose, muscle, and bone function in Lhcgr −/− mice. Collectively, our findings underscore AAVDJ‐mediated gene therapy as a promising strategy for LCF and suggest its broader potential in addressing various reproductive disorders.