Summary

 Indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) catabolizes the amino acid tryptophan. IDO-expressing immunoregulatory dendritic cells (DCs) have been implicated in settings including tumors, autoimmunity, and transplant tolerance. However, the downstream molecular mechanisms by which IDO functions to regulate T cell responses remain unknown. We now show that IDO-expressing plasmacytoid DCs activate the GCN2 kinase pathway in responding T cells. GCN2 is a stress-response kinase that is activated by elevations in uncharged tRNA. T cells with a targeted disruption of GCN2 were not susceptible to IDO-mediated suppression of proliferation in vitro. In vivo, proliferation of GCN2-knockout T cells was not inhibited by IDO-expressing DCs from tumor-draining lymph nodes. IDO induced profound anergy in responding wild-type T cells, but GCN2-knockout cells were refractory to IDO-induced anergy. We hypothesize that GCN2 acts as a molecular sensor in T cells, allowing them to detect and respond to conditions created by IDO.

One mechanism contributing to immunologic unresponsiveness toward tumors may be presentation of tumor antigens by tolerogenic host APCs. We show that mouse tumor-draining LNs (TDLNs) contained a subset of plasmacytoid DCs (pDCs) that constitutively expressed immunosuppressive levels of the enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). Despite comprising only 0.5% of LN cells, these pDCs in vitro potently suppressed T cell responses to antigens presented by the pDCs themselves and also, in a dominant fashion, suppressed T cell responses to third-party antigens presented by nonsuppressive APCs. Adoptive transfer of DCs from TDLNs into naive hosts created profound local T cell anergy, specifically toward antigens expressed by the transferred DCs. Anergy was prevented by targeted disruption of the IDO gene in the DCs or by administration of the IDO inhibitor drug 1-methyl-D-tryptophan to recipient mice. Within the population of pDCs, the majority of the functional IDO-mediated suppressor activity segregated with a novel subset of pDCs coexpressing the B-lineage marker CD19. We hypothesize that IDO-mediated suppression by pDCs in TDLNs creates a local microenvironment that is potently suppressive of host antitumor T cell responses.

A small population of plasmacytoid DCs (pDCs) in mouse tumor-draining LNs can express the immunoregulatory enzyme indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). We show that these IDO+ pDCs directly activate resting CD4+CD25+Foxp3+ Tregs for potent suppressor activity. In vivo, Tregs isolated from tumor-draining LNs were constitutively activated and suppressed antigen-specific T cells immediately ex vivo. In vitro, IDO+ pDCs from tumor-draining LNs rapidly activated resting Tregs from non–tumor-bearing hosts without the need for mitogen or exogenous anti-CD3 crosslinking. Treg activation by IDO+ pDCs was MHC restricted, required an intact amino acid–responsive GCN2 pathway in the Tregs, and was prevented by CTLA4 blockade. Tregs activated by IDO markedly upregulated programmed cell death 1 ligand 1 (PD-L1) and PD-L2 expression on target DCs, and the ability of Tregs to suppress target T cell proliferation was abrogated by antibodies against the programmed cell death 1/PD-L (PD-1/PD-L) pathway. In contrast, Tregs activated by anti-CD3 crosslinking did not cause upregulation of PD-Ls, and suppression by these cells was unaffected by blocking the PD-1/PD-L pathway. Tregs isolated from tumor-draining LNs in vivo showed potent PD-1/PD-L–mediated suppression, which was selectively lost when tumors were grown in IDO-deficient hosts. We hypothesize that IDO+ pDCs create a profoundly suppressive microenvironment within tumor-draining LNs via constitutive activation of Tregs.

Abstract In mice, immunoregulatory APCs express the dendritic cell (DC) marker CD11c, and one or more distinctive markers (CD8α, B220, DX5). In this study, we show that expression of the tryptophan-degrading enzyme indoleamine 2,3 dioxygenase (IDO) is selectively induced in specific splenic DC subsets when mice were exposed to the synthetic immunomodulatory reagent CTLA4-Ig. CTLA4-Ig did not induce IDO expression in macrophages or lymphoid cells. Induction of IDO completely blocked clonal expansion of T cells from TCR transgenic mice following adoptive transfer, whereas CTLA4-Ig treatment did not block T cell clonal expansion in IDO-deficient recipients. Thus, IDO expression is an inducible feature of specific subsets of DCs, and provides a potential mechanistic explanation for their T cell regulatory properties.

Abstract TLR ligands are effective vaccine adjuvants because they stimulate robust proinflammatory and immune effector responses and they abrogate suppression mediated by regulatory T cells (Tregs). Paradoxically, systemic administration of high doses of CpGs that bind to TLR9 ligands stimulated Tregs in mouse spleen to acquire potent suppressor activity dependent on interactions between programmed death-1 and its ligands. This response to CpG treatment manifested 8–12 h and was mediated by a rare population of plasmacytoid dendritic cells (CD19+ pDC) induced to express the immunosuppressive enzyme IDO after TLR9 ligation. When IDO was blocked, CpG treatment did not activate Tregs, but instead stimulated pDCs to uniformly express the proinflammatory cytokine IL-6, which in turn reprogrammed Foxp3-lineage Tregs to express IL-17. Thus, CpG-induced IDO activity in pDCs acted as a pivotal molecular switch that induced Tregs to acquire a stable suppressor phenotype, while simultaneously blocking CpG-induced IL-6 expression required to reprogram Tregs to become Th17-like effector T cells. These findings support the hypothesis that IDO dominantly controls the functional status of Tregs in response to inflammatory stimuli in physiological settings.

Over 700 drugs have failed in stroke clinical trials, an unprecedented rate thought to be attributed in part to limited and isolated testing often solely in "young" rodent models and focusing on a single secondary injury mechanism. Here, extracellular vesicles (EVs), nanometer-sized cell signaling particles, were tested in a mouse thromboembolic (TE) stroke model. Neural stem cell (NSC) and mesenchymal stem cell (MSC) EVs derived from the same pluripotent stem cell (PSC) line were evaluated for changes in infarct volume as well as sensorimotor function. NSC EVs improved cellular, tissue, and functional outcomes in middle-aged rodents, whereas MSC EVs were less effective. Acute differences in lesion volume following NSC EV treatment were corroborated by MRI in 18-month-old aged rodents. NSC EV treatment has a positive effect on motor function in the aged rodent as indicated by beam walk, instances of foot faults, and strength evaluated by hanging wire test. Increased time with a novel object also indicated that NSC EVs improved episodic memory formation in the rodent. The therapeutic effect of NSC EVs appears to be mediated by altering the systemic immune response. These data strongly support further preclinical development of a NSC EV-based stroke therapy and warrant their testing in combination with FDA-approved stroke therapies.

Visceral obesity increases risk of cognitive decline in humans, but subcutaneous adiposity does not. Here, we report that beige adipocytes are indispensable for the neuroprotective and anti-inflammatory effects of subcutaneous fat. Mice lacking functional beige fat exhibit accelerated cognitive dysfunction and microglial activation with dietary obesity. Subcutaneous fat transplantation also protects against chronic obesity in wildtype mice via beige fat-dependent mechanisms. Beige adipocytes restore hippocampal synaptic plasticity following transplantation, and these effects require the anti-inflammatory cytokine interleukin-4 (IL4). After observing beige fat-mediated induction of IL4 in meningeal T-cells, we investigated the contributions of peripheral lymphocytes in donor fat. There was no sign of donor-derived lymphocyte trafficking between fat and brain, but recipient-derived lymphocytes were required for the effects of transplantation on cognition and microglial morphology. These findings indicate that beige adipocytes oppose obesity-induced cognitive impairment, with a potential role for IL4 in the relationship between beige fat and brain function.

Abstract Uterine Natural Killer (uNK) cells, predominant leukocytes in mouse and human pregnant uteruses, play crucial roles in angiogenesis and pregnancy protection. In mice, DBA lectin-reactive uNK cells expressing Gal-N-Ac sugar exhibit angiogenic functions essential for pregnancy maintenance. This study compares the impact of different nutritional imbalances on mouse pregnancy and the activation of angiogenic DBA+ uNK cells to safeguard against pregnancy complications. High Fat (HF), High Carbohydrate (HC), High Protein (HP), and Food Restriction (FR) diets were administered from gestation day (GD) 1 to GD10 or until parturition. HF and HC diets led to reduced expression of DBA-identified N-acetyl-D-galactosamine, akin to LPS-induced inflammation, and decreased uNK perforin levels. Additionally, HF and HC diets resulted in elevated endometrial cleaved caspase-3 and decreased smooth muscle alpha-actin, causing blood vessel wall thinning without jeopardizing pregnancy term. FR impaired uNK differentiation, manifesting as an “all-or-none” phenomenon with 50% pregnancy failure. Our findings highlight the intricate relationship between nutritional imbalances and mouse pregnancy outcomes. Notably, high-fat diets elicited pronounced responses from DBA+ uNK cells, while high-protein diets had relatively weaker effects. This study underscores the importance of comprehending uNK cell dynamics in maintaining pregnancy homeostasis under diverse dietary conditions, paving the way for elucidating molecular mechanisms governing these interactions. By shedding light on these complex relationships, this research offers valuable insights for improving maternal and fetal health in the context of nutritional interventions during pregnancy.

Abstract Diabetes continues to challenge healthcare system as one of the most growing epidemics with staggering economic burden. It is estimated that 783 million by 2045 will live with diabetes worldwide, 90% of those cases are type 2 diabetes (T2D). T2D is a multifaceted disease, its treatment requires a holistic approach, beyond single target medications with high efficacy. There is a dire need to explore and invent new and effective therapeutic modalities for T2D. In this study we tested whether a combined formulation of cannabidiol (CBD) and probiotics could control glycemic indices and alleviate symptoms of T2D. We used a mouse model of T2D, replaced their drinking water with a combination of CBD and probiotics formulated as a commercially available beverage. Our findings demonstrated that combination of CBD and probiotics not only reduced the glycemic indices (HbA1c & FBG), but also altered the microbiome profile, promoted beneficial bacteria. Further, the CBD/probiotic combination reduced peripheral inflammatory cytokines and enhanced insulin production in pancreatic islets. In conclusion, our results suggest that consumption of combined CBD and probiotics could be used as a natural, practical, affordable, and safe alternative and complementary therapeutic modality to treat T2D.

We have previously demonstrated that Cepharanthine improves glycemic status and reduces renal injury in streptozotocin‐induced diabetic rats via antioxidant and anti‐inflammatory mechanisms. However, the hypoglycemic mechanism of Cepharanthine remains unclear. We hypothesize that Cepharanthine reduces blood glucose in steptozotocin‐induced diabetic rats via restoring pancreatic β‐cells mass and insulin secretion. Diabetes was induced by a single i.p. injection of streptozotocin (50 mg/kg) in male Sprague Dawley rats. Control and diabetic rats were treated with Cepharanthine (10 mg/kg/day, i.p.) for six weeks (n=6–8). Cepharanthine treatment significantly reduced blood glucose levels and increased plasma insulin levels in diabetic rats (blood glucose was 290± 67 in Cepharanthine treated diabetic rats vs. 550±17 mg/dl in non‐treated diabetic rats, P<0.05). The percentage of TUNEL positive cells was significantly elevated in the pancreas of diabetic rats and these changes was reduced by Cepharanthine treatment (P<0.05). Immunohistochemcial analysis revealed a decrease in pancreatic islet‐specific glucose‐6‐phosphatase catalytic subunit related protein (IGRP) and an increase in pancreatic and duodenal homeobox 1 (PDX‐1) expression levels in Cepharanthine treated vs. non treated diabetic rats (P<0.05). Cepharanthine also improved vascular endothelial function as it significantly attenuated the impairment in aortic ring relaxation to acetylcholine in diabetic rats. Moreover, Cepharanthine reduced markers of renal injury and inflammation and slowed the progression of renal fibrosis as evidenced by the reduction in levels of albuminuria, podocalyxin excretion, renal ICAM‐1 and TGF‐β in diabetic rats. The reduction in renal inflammation and injury was associated with decreased in renal caspase 3 expression in Cepharanthine treated diabetic rats. These data suggest that Cepharanthine halts the progression of streptozotocin‐induced diabetic complications in rats via reduced pancreatic β‐cells apoptosis and increased β‐cell s maturation and subsequently insulin release probably via the regulation of the PDX‐1 and IGRP transcription factors of pancreatic β‐cells. Support or Funding Information The work was supported by bridge funding grant from Augusta University, Augusta, Georgia to Dr. Ahmed A. Elmarakby This abstract is from the Experimental Biology 2018 Meeting. There is no full text article associated with this abstract published in The FASEB Journal .