Abstract

Purpose

 To investigate the outcome of cultivated corneal epithelial transplantation for severe stem cell deficiencies using denuded amniotic membrane (AM) as a carrier. 

Design

 Retrospective, noncomparative case series. 

Participants

 Thirteen eyes of 11 patients were studied. These consisted of five eyes with acute Stevens-Johnson syndrome (SJS), two with chronic SJS, one with an acute chemical injury, two with chronic chemical injuries, two with ocular cicatricial pemphigoid, and one with drug-induced pseudopemphigoid. All of these eyes had total stem cell deficiencies. 

Main outcome measures

 Adaptation of the cultivated corneal epithelium onto the host corneal surface was confirmed 48 hours after surgery. The reconstruction of the ocular surface and visual acuity were measured. 

Methods

 Corneal limbal epithelium from donor corneas was cultivated for 4 weeks on a denuded AM carrier, with 3T3 fibroblast coculture and air lifting. The cultivated corneal epithelium showed four to five layers of stratification and was well differentiated. After conjunctival tissue removal from the cornea up to 3 mm outside the limbus and subconjunctival tissue treatment with 0.04% mitomycin C, cultivated allocorneal epithelium, including the AM carrier, was transplanted onto the corneal surface up to the limbus. Lamellar keratoplasty, using preserved donor graft without epithelium, was performed simultaneously for five chronic-phase patients showing corneal stromal scarring. Systemic immunosuppression was used to prevent allograft rejection. 

Results

 In all 13 eyes, the entire corneal surface, on which cultivated allocorneal epithelium had been placed, was free from epithelial defects 48 hours after surgery, indicating complete survival of the transplanted corneal epithelium. Visual acuity improved in all eyes after surgery, and 10 of the 13 eyes were restored to good vision (postoperative visual acuity improved two or more lines) 6 months after the operation. During the follow-up period (mean ± standard deviation, 11.2 ± 1.3 months), the corneal surfaces were clear, although three eyes experienced epithelial rejection. 

Conclusions

 Cultivated corneal epithelial transplantation using denuded AM as a carrier can be used for severe stem cell deficiencies.

Purpose: To update the 2008 International Classification of Corneal Dystrophies (IC3D) incorporating new clinical, histopathologic, and genetic information. Methods: The IC3D reviewed worldwide peer-reviewed articles for new information on corneal dystrophies published between 2008 and 2014. Using this information, corneal dystrophy templates and anatomic classification were updated. New clinical, histopathologic, and confocal photographs were added. Results: On the basis of revisiting the cellular origin of corneal dystrophy, a modified anatomic classification is proposed consisting of (1) epithelial and subepithelial dystrophies, (2) epithelial–stromal TGFBI dystrophies, (3) stromal dystrophies, and (4) endothelial dystrophies. Most of the dystrophy templates are updated. The entity “Epithelial recurrent erosion dystrophies” actually includes a number of potentially distinct epithelial dystrophies (Franceschetti corneal dystrophy, Dystrophia Smolandiensis, and Dystrophia Helsinglandica) but must be differentiated from dystrophies such as TGFBI-induced dystrophies, which are also often associated with recurrent epithelial erosions. The chromosome locus of Thiel-Behnke corneal dystrophy is only located on 5q31. The entity previously designated as a variant of Thiel-Behnke corneal dystrophy on chromosome 10q24 may represent a novel corneal dystrophy. Congenital hereditary endothelial dystrophy (CHED, formerly CHED2) is most likely only an autosomal recessive disorder. The so-called autosomal dominant inherited CHED (formerly CHED1) is insufficiently distinct to continue to be considered a unique corneal dystrophy. On review of almost all of the published cases, the description appeared most similar to a type of posterior polymorphous corneal dystrophy linked to the same chromosome 20 locus (PPCD1). Confocal microscopy also has emerged as a helpful tool to reveal in vivo features of several corneal dystrophies that previously required histopathologic examination to definitively diagnose. Conclusions: This revision of the IC3D classification includes an updated anatomic classification of corneal dystrophies more accurately classifying TGFBI dystrophies that affect multiple layers rather than are confined to one corneal layer. Typical histopathologic and confocal images have been added to the corneal dystrophy templates.

Introduction: Stevens–Johnson syndrome (SJS) and toxic epidermal necrolysis (TEN) are rare but life-threatening severe cutaneous adverse reactions. Recently, strong associations of HLA-B*1502 and HLA-B*5801 with carbamazepine- and allopurinol-induced severe cutaneous adverse reactions were found in Han Chinese patients, respectively, but ethnic differences in the associations have been reported. The objective of this study is to clarify the involvement of HLA-B*1502 and HLA-B*5801 in Japanese SJS/TEN patients. Methods: HLA-B genotyping was performed on 58 Japanese SJS/TEN patients between July 2006 and April 2008 from multicenters in Japan. Results: There were no HLA-B*1502 carriers among 58 SJS/TEN patients. This patient group included seven carbamazepine-related and 11 aromatic anti-epileptic agent-related SJS/TEN patients. In addition, there were five HLA-B*5801 carriers, which included four allopurinol-related SJS/TEN patients. Conclusion: While HLA-B*1502 is unlikely to be associated with carbamazepine-related or aromatic anti-epileptic agent-related SJS/TEN, HLA-B*5801 was significantly associated with allopurinol-related SJS/TEN in Japanese.

Corneal endothelial cell (CEC) disorders, such as Fuchs's endothelial corneal dystrophy, induce abnormal corneal hydration and result in corneal haziness and vision loss known as bullous keratopathy. We investigated whether injection of cultured human CECs supplemented with a rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor into the anterior chamber could increase CEC density.We performed an uncontrolled, single-group study involving 11 persons who had received a diagnosis of bullous keratopathy and had no detectable CECs. Human CECs were cultured from a donor cornea; a total of 1×106 passaged cells were supplemented with a ROCK inhibitor (final volume, 300 μl) and injected into the anterior chamber of the eye that was selected for treatment. After the procedure, patients were placed in a prone position for 3 hours. The primary outcome was restoration of corneal transparency, with a CEC density of more than 500 cells per square millimeter at the central cornea at 24 weeks after cell injection. Secondary outcomes were a corneal thickness of less than 630 μm and an improvement in best corrected visual acuity equivalent to two lines or more on a Landolt C eye chart at 24 weeks after cell injection.At 24 weeks after cell injection, we recorded a CEC density of more than 500 cells per square millimeter (range, 947 to 2833) in 11 of the 11 treated eyes (100%; 95% confidence interval [CI], 72 to 100), of which 10 had a CEC density exceeding 1000 cells per square millimeter. A corneal thickness of less than 630 μm (range, 489 to 640) was attained in 10 of the 11 treated eyes (91%; 95% CI, 59 to 100), and an improvement in best corrected visual acuity of two lines or more was recorded in 9 of the 11 treated eyes (82%; 95% CI, 48 to 98).Injection of human CECs supplemented with a ROCK inhibitor was followed by an increase in CEC density after 24 weeks in 11 persons with bullous keratopathy. (Funded by the Japan Agency for Medical Research and Development and others; UMIN number, UMIN000012534 .).

Purpose

 To investigate tear function and prevalence of dry eye disease (DED) in visual display terminal (VDT) users. 

Design

 Cross-sectional study. 

Methods

 Six hundred and seventy-two young and middle-aged Japanese office workers who used VDT completed questionnaires and underwent dry eye testing. We estimated the prevalence of DED using logistic regression analysis to examine associations between DED and possible risk factors. The ocular surface feature, prevalence of DED, and risk factors were evaluated. 

Results

 Of the 672 workers, 561 (83.5%, mean age: 43.3 ± 9.1 years) completed the questionnaire. The percentage of women with a composite outcome of definite DED or probable DED was 76.5%, which was higher than that among men (60.2%; odds ratio [OR] = 2.00; 95% confidence interval [CI], 1.29-3.10, P = .002). Workers over 30 years of age had a higher risk of DED (OR = 2.22; 95% CI, 1.06-4.66), as did workers using a VDT >8 hours per day (OR = 1.94; 95% CI, 1.22-3.09). Average Schirmer value was 18.7 ± 11.7 mm and tear break-up time (TBUT) was 4.0 ± 2.5 seconds (78.6% of study participants had TBUT ≤5 seconds). 

Conclusions

 DED is prevalent among young to middle-aged Japanese VDT users. Ophthalmic findings revealed short TBUT and corneal staining accompanied by normal Schirmer test values. Increased risk for DED was noted for women aged over 30 years and prolonged VDT use. Measures to modify the adverse impact of VDT use on the ocular surface may provide a positive impact on public health and quality of life for office workers using VDTs.

purpose. The transplantation of cultivated corneal endothelial cells (CECs) has gained attention recently for the treatment of patients with corneal endothelial dysfunction. However, an efficient culturing technique for human (H)CECs has yet to be properly established. The present study was conducted to investigate the applicability of the Rho kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 in promoting cultivation of cynomolgus monkey (M)CECs. methods. MCECs of cynomolgus monkeys were cultured in a medium containing 10 μM Y-27632. The number of viable cells adherent to culture plates were monitored by a luminescent cell-viability assay and colony growth was detected by toluidine blue staining. Proliferating cells were detected by Ki67 expression using flow cytometry and a BrdU-labeling assay for immunocytochemistry. Annexin V-positive apoptotic cells were analyzed by flow cytometry. results. The number of viable cultivated MCECs was enhanced by Y-27632 addition after 24 hours in culture. The colony area of the culture in the presence of Y-27632 was higher than in the absence of Y-27632 on day 10. In Y-27632-treated cultures, the number of Ki67-positive cells was significantly increased at 24 and 48 hours, and the number of proliferating BrdU-positive cells was increased at 48 hours. The number of Annexin V-positive apoptotic cells was decreased at 24 hours. conclusions. The inhibition of Rho/ROCK signaling by specific ROCK inhibitor Y-27632 promoted the adhesion of MCECs, inhibited apoptosis, and increased the number of proliferating cells. These results suggest that the ROCK inhibitor may serve as a new tool for cultivating HCECs for transplantation.

Corneal endothelial dysfunction accompanied by visual disturbance is a primary indication for corneal transplantation. We previously reported that the adhesion of corneal endothelial cells (CECs) to a substrate was enhanced by the selective ROCK inhibitor Y-27632. It is hypothesized that the inhibition of ROCK signaling may manipulate cell adhesion properties, thus enabling the transplantation of cultivated CECs as a form of regenerative medicine. In the present study, using a rabbit corneal endothelial dysfunction model, the transplantation of CECs in combination with Y-27632 successfully achieved the recovery of corneal transparency. Complications related to cell injection therapy, such as the abnormal deposition of the injected cells as well as the elevation of intraocular pressure, were not observed. Reconstructed corneal endothelium with Y-27632 exhibited a monolayer hexagonal cell shape with a normal expression of function-related markers, such as ZO-1, and Na+/K+-ATPase, whereas reconstruction without Y-27632 exhibited a stratified fibroblastic phenotype without the expression of markers. Moreover, transplantation of CECs in primates in the presence of the ROCK inhibitor also achieved the recovery of long-term corneal transparency with a monolayer hexagonal cell phenotype at a high cell density. Taken together, these results suggest that the selective ROCK inhibitor Y-27632 enables cultivated CEC-based therapy and that the modulation of Rho-ROCK signaling activity serves to enhance cell engraftment for cell-based regenerative medicine. Corneal endothelial dysfunction accompanied by visual disturbance is a primary indication for corneal transplantation. We previously reported that the adhesion of corneal endothelial cells (CECs) to a substrate was enhanced by the selective ROCK inhibitor Y-27632. It is hypothesized that the inhibition of ROCK signaling may manipulate cell adhesion properties, thus enabling the transplantation of cultivated CECs as a form of regenerative medicine. In the present study, using a rabbit corneal endothelial dysfunction model, the transplantation of CECs in combination with Y-27632 successfully achieved the recovery of corneal transparency. Complications related to cell injection therapy, such as the abnormal deposition of the injected cells as well as the elevation of intraocular pressure, were not observed. Reconstructed corneal endothelium with Y-27632 exhibited a monolayer hexagonal cell shape with a normal expression of function-related markers, such as ZO-1, and Na+/K+-ATPase, whereas reconstruction without Y-27632 exhibited a stratified fibroblastic phenotype without the expression of markers. Moreover, transplantation of CECs in primates in the presence of the ROCK inhibitor also achieved the recovery of long-term corneal transparency with a monolayer hexagonal cell phenotype at a high cell density. Taken together, these results suggest that the selective ROCK inhibitor Y-27632 enables cultivated CEC-based therapy and that the modulation of Rho-ROCK signaling activity serves to enhance cell engraftment for cell-based regenerative medicine. Corneal endothelial dysfunction is a major cause of severe visual impairment, because corneal endothelial cells maintain corneal transparency through their barrier and Na+-K+ transport system. Highly effective surgical techniques to replace corneal endothelium (eg, Descemet's stripping endothelial keratoplasty) have been developed,1Gorovoy M.S. Descemet-stripping automated endothelial keratoplasty.Cornea. 2006; 25: 886-889Crossref PubMed Scopus (681) Google Scholar, 2Price Jr., F.W. Price M.O. Descemet's stripping with endothelial keratoplasty in 50 eyes: a refractive neutral corneal transplant.J Refract Surg. 2005; 21: 339-345PubMed Google Scholar aimed at replacing penetrating keratoplasty for overcoming pathological dysfunctions of corneal endothelial tissue. Several research groups, including ours, have devoted an intensive amount of effort in an attempt to establish new treatment methods suitable for a practical clinical intervention to repair corneal endothelial dysfunctions.3Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Okahara N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial cell sheet transplantation in a primate model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48: 4519-4526Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar, 4Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial transplantation in a primate: possible future clinical application in corneal endothelial regenerative medicine.Cornea. 2008; 27: S48-S55Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 5Mimura T. Yamagami S. Yokoo S. Usui T. Tanaka K. Hattori S. Irie S. Miyata K. Araie M. Amano S. Cultured human corneal endothelial cell transplantation with a collagen sheet in a rabbit model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45: 2992-2997Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar, 6Ishino Y. Sano Y. Nakamura T. Connon C.J. Rigby H. Fullwood N.J. Kinoshita S. Amniotic membrane as a carrier for cultivated human corneal endothelial cell transplantation.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45: 800-806Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar Because corneal endothelium is composed of a monolayer and is technically difficult to transplant into the anterior chamber as a structurally flexible cell sheet, those research teams cultured corneal endothelial cells (CECs) on substrates such as collagen sheets and amniotic membrane. The injection of cultivated cells has been reported for the treatment of a number of organs associated with degenerative diseases such as the heart,7Schachinger V. Erbs S. Elsasser A. Haberbosch W. Hambrecht R. Holschermann H. Yu J. Corti R. Mathey D.G. Hamm C.W. Suselbeck T. Assmus B. Tonn T. Dimmeler S. Zeiher A.M. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction.N Engl J Med. 2006; 355: 1210-1221Crossref PubMed Scopus (1682) Google Scholar vessels,8Tateishi-Yuyama E. Matsubara H. Murohara T. Ikeda U. Shintani S. Masaki H. Amano K. Kishimoto Y. Yoshimoto K. Akashi H. Shimada K. Iwasaka T. Imaizumi T. Therapeutic angiogenesis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial.Lancet. 2002; 360: 427-435Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1562) Google Scholar pancreas,9Shapiro A.M. Lakey J.R. Ryan E.A. Korbutt G.S. Toth E. Warnock G.L. Kneteman N.M. Rajotte R.V. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen.N Engl J Med. 2000; 343: 230-238Crossref PubMed Scopus (4355) Google Scholar and cartilage.10Yanaga H. Koga M. Imai K. Yanaga K. Clinical application of biotechnically cultured autologous chondrocytes as novel graft material for nasal augmentation.Aesthetic Plast Surg. 2004; 28: 212-221Crossref PubMed Scopus (37) Google Scholar In regard to corneal endothelium, it is known that injected cultured CECs appear to be washed off by aqueous humor flow, thus resulting in the poor adhesion of those injected cells onto the corneal tissue. To develop an effective method for delivering cultivated CECs to the posterior cornea, the magnetic attachment of iron powder or superparamagnetic microspheres incorporated in the cultivated CECs has been attempted. This method has been shown to work in a rabbit transplantation model11Mimura T. Shimomura N. Usui T. Noda Y. Kaji Y. Yamgami S. Amano S. Miyata K. Araie M. Magnetic attraction of iron-endocytosed corneal endothelial cells to Descemet's membrane.Exp Eye Res. 2003; 76: 745-751Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar, 12Mimura T. Yamagami S. Usui T. Ishii Y. Ono K. Yokoo S. Funatsu H. Araie M. Amano S. Long-term outcome of iron-endocytosing cultured corneal endothelial cell transplantation with magnetic attraction.Exp Eye Res. 2005; 80: 149-157Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar and in an organ culture model of the human eye13Patel S.V. Bachman L.A. Hann C.R. Bahler C.K. Fautsch M.P. Human corneal endothelial cell transplantation in a human ex vivo model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009; 50: 2123-2131Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar; however, these methods have yet to be applied in the clinical setting. Cell adhesion is known to be mediated through transmembrane adhesion molecules linked to the intracellular cytoskeleton. In addition to the structural function, these adhesion molecules reportedly serve as a platform for the interplay with the surrounding environments.14Sastry S.K. Burridge K. Focal adhesions: a nexus for intracellular signaling and cytoskeletal dynamics.Exp Cell Res. 2000; 261: 25-36Crossref PubMed Scopus (428) Google Scholar, 15Critchley D.R. Focal adhesions—the cytoskeletal connection.Curr Opin Cell Biol. 2000; 12: 133-139Crossref PubMed Scopus (494) Google Scholar Rho GTPase proteins are key modulators of cytoskeletal dynamics that occur after cell adhesion.16Hall A. Rho GTPases and the actin cytoskeleton.Science. 1998; 279: 509-514Crossref PubMed Scopus (5216) Google Scholar, 17Worthylake R.A. Lemoine S. Watson J.M. Burridge K. RhoA is required for monocyte tail retraction during transendothelial migration.J Cell Biol. 2001; 154: 147-160Crossref PubMed Scopus (410) Google Scholar, 18Worthylake R.A. Burridge K. RhoA and ROCK promote migration by limiting membrane protrusions.J Biol Chem. 2003; 278: 13578-13584Crossref PubMed Scopus (246) Google Scholar It has been reported that Rho GTPases induce a specific type of actin cytoskeleton through mediating downstream effectors mDia and Rho-associated kinase (ROCK), and that they regulate a variety of cellular functions.19Narumiya S. Tanji M. Ishizaki T. Rho signaling, ROCK and mDia1, in transformation, metastasis and invasion.Cancer Metastasis Rev. 2009; 28: 65-76Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar Cell adhesion, motility, and cell morphogenesis are thought to be determined by the balance between mDia and ROCK activities.19Narumiya S. Tanji M. Ishizaki T. Rho signaling, ROCK and mDia1, in transformation, metastasis and invasion.Cancer Metastasis Rev. 2009; 28: 65-76Crossref PubMed Scopus (416) Google Scholar We recently reported that the adhesion of CECs to a substrate was enhanced by inhibiting Rho/ROCK signaling.20Okumura N. Ueno M. Koizumi N. Sakamoto Y. Hirata K. Hamuro J. Kinoshita S. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009; 50: 3680-3687Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar This finding coincides well with those of other studies that demonstrated that Rho-ROCK signaling negatively regulates the integrin-mediated adhesion of monocytes, and that the inhibition of ROCK by a selective ROCK inhibitor upregulates adhesion.17Worthylake R.A. Lemoine S. Watson J.M. Burridge K. RhoA is required for monocyte tail retraction during transendothelial migration.J Cell Biol. 2001; 154: 147-160Crossref PubMed Scopus (410) Google Scholar, 18Worthylake R.A. Burridge K. RhoA and ROCK promote migration by limiting membrane protrusions.J Biol Chem. 2003; 278: 13578-13584Crossref PubMed Scopus (246) Google Scholar These features have led us to hypothesize that the inhibition of ROCK signaling may provide a way to manipulate the cell adhesion property of cultivated corneal endothelium to the extent practical for regenerative medicine. In this current study, in two animal models (rabbit and primate) of corneal endothelial dysfunctions, the transplantation of cultivated CECs in combination with ROCK inhibitor Y-27632 successfully achieved the recovery of corneal transparency. Inhibition of the ROCK signaling manipulated the adhesion property of the cultivated CECs. Moreover, the injected CECs functioned sufficiently well to reconstruct the corneal endothelium with an appropriate cell density, morphology, and expression of function-related markers. This novel treatment strategy may provide a new therapeutic modality for corneal-endothelium–associated pathological dysfunctions. Rabbit eyes were purchased from Funakoshi Corporation (Tokyo, Japan). Alizarin red S stain and selective ROCK inhibitor Y-27632 were purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan). Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with penicillin, streptomycin, and basic fibroblast growth factor (bFGF), Vybrant DiI cell-labeling solution, Alexa Fluor 594-conjugated phalloidin, Alexa Fluor 488-conjugated phalloidin, Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG, anti-vinculin antibody, ROCK1 Stealth RNAi (HSS109291, HSS109292, and HSS109293), ROCK2 Stealth RNAi (HSS114106, HSS114107, and HSS114108), Stealth RNAi negative control medium GC #2, and Lipofectamine RNAiMAX were purchased from Life Technologies (Carlsbad, CA). Dispase II was purchased from Roche Applied Science (Penzberg, Germany). FNC Coating Mix was purchased from Athena Environmental Sciences, Inc. (Baltimore, MD). Ki-67 monoclonal antibody, propidium iodide (PI), and Cytochalasin D were purchased from Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO). ZO-1 polyclonal antibody was purchased from Zymed Laboratories (South San Francisco, CA). α–Smooth muscle actin (α-SMA) monoclonal antibody was purchased from Thermo Fisher Scientific (Kalamazoo, MI). Na+/K+-ATPase monoclonal antibody was purchased from Upstate Biotech (Lake Placid, NY). DAPI was purchased from Vector Laboratories (Burlingame, CA). CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay was purchased from Promega (Madison, WI). In all experiments, animals were housed and treated in accordance with The Association for Research in Vision and Ophthalmology Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. The rabbit experiments were performed at Doshisha University (Kyoto, Japan) according to the protocol approved by that university's Animal Care and Use Committee (approval no. 0831). The monkey experiments were performed at the Research Center for Animal Life Science at Shiga University of Medical Science (Otsu, Japan) according to the protocol approved by that university's Animal Care and Use Committee (approval no. 2008-10-5). Ten rabbit eyes were used for the rabbit CECs (RCECs) culture. Eight corneas from four cynomolgus monkeys (3 to 5 years of age; estimated equivalent human age: 5 to 20 years) housed at the Nissei Bilis Co. (Otsu, Japan) and the Keari Co. (Wakayama, Japan), respectively, were used for the monkey CECs (MCECs) culture. The RCECs and MCECs were cultivated as described previously.3Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Okahara N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial cell sheet transplantation in a primate model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48: 4519-4526Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar, 20Okumura N. Ueno M. Koizumi N. Sakamoto Y. Hirata K. Hamuro J. Kinoshita S. Enhancement on primate corneal endothelial cell survival in vitro by a ROCK inhibitor.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2009; 50: 3680-3687Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar Briefly, Descemet's membrane with CECs was stripped and incubated in 0.6 U/mL of Dispase II to release the CECs. After a 60-minute incubation at 37°C, the CECs obtained from individual corneas were resuspended in culture medium and plated in one well of a six-well plate coated with cell attachment reagent (FNC Coating Mix). All primary cell cultures and serial passages of CECs were performed in growth medium composed of Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 50 U/mL penicillin, 50 μg/mL streptomycin, and 2 ng/mL bFGF. CECs were cultured in a humidified atmosphere at 37°C in 5% CO2. The culture medium was changed every 2 days. When cells reached confluency in 10 to 14 days, they were rinsed in Ca2+ and Mg2+-free Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS), trypsinized with 0.05% Trypsin-EDTA (Life Technologies, Carlsbad, CA) for 5 minutes at 37°C, and passaged at ratios of 1:2 to 1:4. Cultivated CECs derived from both rabbit and monkey corneas at passages 3 through 5 were used for all experiments. To confirm the cultivation of the CECs, the morphology and density of the cultivated cells were compared with normal in vivo rabbit CECs examined using a noncontact specular microscope (Noncon Robo, SP-8800; Konan Medical, Nishinomiya, Japan) and stained with Alizarin red. In some experiments, to investigate the fate of the injected CECs in vivo, the CECs were labeled with fluorescein by use of the Vybrant DiI cell-labeling solution according to the manufacturer's protocol. To create rabbit corneal endothelial pathological dysfunction models, the lenses of both eyes of 12 Japanese white rabbits were removed under general anesthesia by use of the Alcon Series 20000 Legacy Surgical System (Alcon, Fort Worth, TX) to deepen the anterior chamber. Next, the corneal endothelium of each of those eyes was mechanically scraped with a 20-gauge silicone needle (Soft Tapered Needle; Inami, Tokyo, Japan) from Descemet's membrane as described previously.3Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Okahara N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial cell sheet transplantation in a primate model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48: 4519-4526Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar, 4Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial transplantation in a primate: possible future clinical application in corneal endothelial regenerative medicine.Cornea. 2008; 27: S48-S55Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar The scraped area was then confirmed by 0.04% trypan blue staining during surgery. In the preliminary experiments, we confirmed that Descemet's membrane was intact, the mechanically scraped area had no cells on Descemet's membrane, and that residual CECs were detected in only a 500- to 600-μm area at the edge of Descemet's membrane. To evaluate the injection of cultivated CECs with ROCK inhibitor, RCECs at a density of 2.0 × 105 cells were suspended in 200 μl DMEM supplemented with 100 μmol/L of Y-27632 and then injected into the anterior chamber of the eyes of the above-described corneal endothelial dysfunction rabbit model. RCECs with Y-27632 were injected into the right eyes of six rabbits, and RCECs without Y-27632 were injected into the right eyes of the other six rabbits. After the injection, the eyes of those 12 rabbits were kept in the face-down position for 3 hours under general anesthesia. The left eyes of those 12 rabbits in which the corneal endothelium was removed mechanically were used as a control. One rabbit injected with RCECs with Y-27632 and one rabbit injected with RCECs without Y-27632 were euthanized 3 hours after injection for histological examination. The corneal appearance of the other 10 rabbits was examined daily by use of a slit-lamp microscope for the first week, and then once every 2 days for the following 2 weeks. Those 10 rabbits were then euthanized for histological examination. Corneal thickness was determined by use of an ultrasound pachymeter (SP-2000; Tomey, Nagoya, Japan), and the mean of 10 measured values was then calculated (up to a maximum thickness of 1200 μm, the instrument's maximum reading). Intraocular pressure was measured by use of a pneumatonometer (30 Classic; Reichert, NY). Sections (6-μm) of corneal specimens obtained from the 10 rabbits euthanized 2 weeks after injection were embedded in OCT compound and then fixed in 4% formaldehyde. Differential interference contrast (DIC) images and fluorescence images of DiI-labeled cells were obtained by use of a fluorescence microscope (TCS SP2 AOBS; Leica Microsystems, Welzlar, Germany). For flat-mount examinations, whole corneal specimens were fixed in 4% formaldehyde and incubated in 1% bovine serum albumin (BSA) to block any nonspecific binding. To evaluate the effect of Y-27632 on the adhesion property of the cells, corneas obtained from the 2 rabbits euthanized 3 hours after injection were examined by actin staining performed with a 1:400 dilution of Alexa Fluor 488–conjugated phalloidin. Actin staining was used to evaluate the cellular morphology. The cell nuclei were then stained with PI. To investigate the phenotype of the reconstructed corneal endothelium obtained from the 10 rabbits euthanized 2 weeks after injection, immunohistochemical analyses of actin, α-SMA, ZO-1, Na+/K+-ATPase, DiI, and Ki-67 were performed. α-SMA was used to evaluate the fibroblastic change. ZO-1, a tight-junction–associated protein, and Na+/K+-ATPase, the protein associated with pump function, were used for function related markers of CECs. The α-SMA, ZO-1, and Na+/K+-ATPase staining were performed with a 1:200 dilution of α-SMA monoclonal antibody, ZO-1 polyclonal antibody, and Na+/K+-ATPase monoclonal antibody, respectively. Ki-67 (a cell-proliferation–related maker) staining was performed using a 1:400 dilution of anti-mouse Ki-67 antibody. For the secondary antibody, a 1:2000 dilution of Alexa Fluor 488–conjugated goat anti-mouse IgG was used. Cell nuclei were then stained with DAPI, and the slides were inspected by fluorescence microscopy. MCECs were cultured at a density of 2.5 × 104 cells/cm2 on Lab-Tek Chamber Slides (NUNC A/S, Roskilde, Denmark). Actin staining was performed with 1:400-diluted Alexa Fluor, as described above, after 24 hours of seeding, and vinculin staining was performed using 1:200-diluted vinculin after 3 hours of seeding. The number of attached MCECs was evaluated by use of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay performed according to the manufacturer's protocol. The MCECs were seeded with a different concentration of Y-27632 at the density of 1.0 × 103 cells onto 96-well plates, and the number of adhered MCECs at 24 hours after seeding was then measured by use of a Veritas Microplate Luminometer (Promega). In addition to ROCK signaling inhibition, to evaluate the effect of inhibition of actin polymerization on CECs adhesion, MCECs were seeded with a different concentration of cytochalasin D at the density of 1.0 × 103 cells onto 96-well plates, and the number of adhered MCECs at 24 hours after seeding was then measured. Five samples were prepared for each group. To determine the adhesion property of the MCECs onto the basement membrane, the cells were seeded onto rabbit corneas in which the corneal endothelium was mechanically denuded and the basement membranes were exposed. The cells were seeded at the density of 2.5 × 104 cells/cm2 suspended in culture medium supplemented with or without 10 μmol/L Y-27632. Actin staining was performed at 3 hours after seeding in the same manner as with the Alexa Fluor 488–conjugated phalloidin staining described above. Cell nuclei were then stained with PI. MCECs at the density of 2.0 × 105 cells were also seeded, with or without Y-27632, onto Descemet's membrane of four rabbits from each group, and the membrane was then mechanically peeled off at 3 hours after seeding. The adhered MCECs were recovered by trypsin digestion, and the cell numbers were then counted. MCECs seeded at the density of 2.5 × 104 cells/cm2 onto a 24-well plate were incubated with RNAi duplex (ROCK1 Stealth RNAi and ROCK2 Stealth RNAi) and Lipofectamine RNAiMAX according to the manufacturer's protocol. Briefly, 1 day before transfection, the culture medium was replaced with fresh medium without antibiotics. RNAi duplex at the final concentration of 10 nmol/L and Lipofectamine RNAiMAX complexes were added to each well. The MCECs were incubated for 12 hours at 37°C in a CO2 incubator. Random RNAi was used as a control. The MCECs were then seeded at the density of 1.0 × 103 cells onto 96-well plates, and the number of attached MCECs was evaluated by use of CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay. Knockdown of both ROCK1 and ROCK2, two ROCK isoforms that were identified in the mammalian system,21Liao J.K. Seto M. Noma K. Rho kinase (ROCK) inhibitors.J Cardiovasc Pharmacol. 2007; 50: 17-24Crossref PubMed Scopus (320) Google Scholar was confirmed by quantitative PCR analysis (data not shown). Representative data were from six independent experiments using three kinds of ROCK1 Stealth RNAi and ROCK2 Stealth RNAi, respectively. To create monkey corneal endothelial pathological dysfunction models, the corneal endothelium of the left eyes of four monkeys was mechanically scraped with a 20-gauge silicone needle under general anesthesia, as described above for the rabbit model. Next, a 2.0 × 105 density of cultivated MCECs suspended in 200 μl DMEM supplemented with 100 μmol/L Y-27632 were injected into the anterior chamber of two of the four monkeys. Cultivated MCECs suspended in 200 μl DMEM without Y-27632 were injected into the anterior chamber of the other 2 monkeys. The eyes of all four monkeys were kept in the face-down position for 3 hours under general anesthesia. The MCECs were labeled with DiI before transplantation.3Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Okahara N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial cell sheet transplantation in a primate model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007; 48: 4519-4526Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar, 4Koizumi N. Sakamoto Y. Okumura N. Tsuchiya H. Torii R. Cooper L.J. Ban Y. Tanioka H. Kinoshita S. Cultivated corneal endothelial transplantation in a primate: possible future clinical application in corneal endothelial regenerative medicine.Cornea. 2008; 27: S48-S55Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar The corneal appearance of all four monkeys was examined daily by use of a slit-lamp microscope for the first week, and then once per week for the following 3 months. Two monkeys from each group (the MCEC-injection with Y-27632 group, and the MCEC-injection without Y-27632 group) were euthanized at 14 days after the injection, and the other 2 monkeys were euthanized at 3 months after the injection. For flat-mount examinations, whole corneal specimens were fixed in 4% formaldehyde, incubated in 1% BSA to block nonspecific binding, and then prepared for histological examination. To investigate the phenotype of the reconstructed corneal endothelium, immunohistochemical analyses of actin, ZO-1, and Na+/K+-ATPase were performed in the same manner as that of the above-described rabbit experiments. After the actin immunostaining, the corneal endothelium of the four monkeys was evaluated by KSS-400EB software version 2.71 (Konan Medical, Hyogo, Japan). The statistical significance (P value) in mean values of the two-sample comparison was determined by Student's t-test. Values shown on the graphs represent the mean ± SEM. The third-passaged RCECs exhibited a monolayer of hexagonal shaped cells, similar to in vivo RCECs with a cell density of approximately 2600 cells/mm2 as previously reported5Mimura T. Yamagami S. Yokoo S. Usui T. Tanaka K. Hattori S. Irie S. Miyata K. Araie M. Amano S. Cultured human corneal endothelial cell transplantation with a collagen sheet in a rabbit model.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45: 2992-2997Crossref PubMed Scopus (225) Google Scholar, 6Ishino Y. Sano Y. Nakamura T. Connon C.J. Rigby H. Fullwood N.J. Kinoshita S. Amniotic membrane as a carrier for cultivated human corneal endothelial cell transplantation.Invest Ophthalmol Vis Sci. 2004; 45: 800-806Crossref PubMed Scopus (271) Google Scholar (Figure 1A). Cultivated RCECs injected together with Y-27632 were successful in recovering complete transparency of the corneas with pathological dysfunctions. In contrast, RCECs injected without Y-27632 induced hazy and severely edematous corneas, thus indicating that the corneal endothelial dysfunctions were sustained, comparable with those of the control corneas. Slit-lamp microscopy performed at 48 hours after injection revealed complete corneal transparency with the iris and the pupil clearly observed in the eyes injected with RCECs with Y-27632, whereas the iris and pupil could not be observed in the eyes injected with RCECs without Y-27632 and in the control eyes in which the corneal endothelium was mechanically scraped (Figure 1B). Consistent with the slit-lamp microscopy findings, histological analysis performed at 14 days after injection also revealed that the eyes injected with RCECs with Y-27632 had a normal range of corneal thickness, whereas those without Y-27632 exhibited a thick cornea with severe stromal edema. The corneal thicknesses of those specimens were 409 μm and 730 μm, respectively (Figure 1C). In the eyes injected with RCECs with Y-27632, the corneal edema was moderate (<800 μm) at day 1, yet gradually recovered to the normal level. In contrast, in both the control eyes and the eyes injected with RCECs without Y-27632, prominent corneal edema (>1200 μm) was observed at day 1, and corneal edema persisted throughout the observation period (Figure 1D). Next, possible complications associated with cell injection into the anterior chamber were investigated, as the injected cells might possibly interfere with normal aqueous humor outflow and produce an increase in intraocular pressure. No abnormal deposition of the injected DiI-positive RCECs onto the trabecular meshwork or onto the iris and no anatomical abnormality such as mechanical angle closure or peripheral anterior synechia were detected (Figure 2A). Intraocular pressures were found to be in the normal range in all groups (Figure 2B). To evaluate the injected CECs proliferation status in vivo, a flat-mount cornea was examined at 14 days after injection. Immunofluorescence analysis using the Ki-67 monoclonal antibody (a marker of cell proliferation) revealed that the cell cycle of the nearly all of the injected cells was arrested 2 weeks after injection (Figure 2C). These results indicate that ROCK inhib

Abstract Canonically, hormones are produced in the endocrine organs and delivered to target tissues. However, for steroids, the concept of tissue intracrinology, whereby hormones are produced in the tissues where they exert their effect without release into circulation, has been proposed, but its role in physiology/disease remains unclear. The meibomian glands in the eyelids produce oil to prevent tear evaporation, which reduces with aging. Here, we demonstrate that (re)activation of local intracrine activity through nicotinamide adenine dinucleotide (NAD + )-dependent circadian 3β-hydroxyl-steroid dehydrogenase (3β-HSD) activity ameliorates age-associated meibomian gland dysfunction and accompanying evaporative dry eye disease. Genetic ablation of 3β-HSD nullified local steroidogenesis and led to atrophy of the meibomian gland. Conversely, reactivation of 3β-HSD activity by boosting its coenzyme NAD + availability improved glandular cell proliferation and alleviated the dry eye disease phenotype. Both women and men express 3β-HSD in the meibomian gland. Enhancing local steroidogenesis may help combat age-associated meibomian gland dysfunction.

PURPOSE To investigate the incidence and prognostic factors of ocular sequelae in Stevens-Johnson syndrome (SJS)/toxic epidermal necrolysis (TEN) cases arising between 2016 and 2018 in Japan, and compare the findings with those presented in the previous 2005-2007 survey. DESIGN Retrospective, national trend survey . METHODS Dermatological case report forms (CRFs) (d-CRFs) were sent to 257 institutions that treated at least 1 SJS/TEN case, and 508 CRFs were collected from 160 institutions. Ophthalmological CRFs (o-CRFs) regarding patient demographic data, onset date, ocular findings (first appearance, day of worst severity, and final follow-up), topical treatment (betamethasone), outcome (survival or death), and ocular sequelae (visual disturbance, eye dryness) were sent to the ophthalmologists in those 160 institutions. The results of this survey were then compared with that of the previous 2005-2007 survey. RESULTS A total of 240 cases (SJS/TEN: 132/108) were included. The incidence of ocular sequelae incidence was 14.0%, a significant decrease from the 39.2% in the previous survey (SJS/TEN: 87/48). In 197 (82.1%) of the cases, systemic treatment was initiated within 3 days after admission, an increase compared to the previous survey (ie, treatment initiated in 82 [60.7%] of 135 cases). Of the 85 cases with an Acute Ocular Severity Score of 2 and 3, 62 (72.9%) received corticosteroid pulse therapy and 73 (85.9%) received 0.1% betamethasone therapy; an increase compared to the 60.0% and 70.8%, respectively, in the previous survey. Ocular-sequelae-associated risk factors included Acute Ocular Severity Score (P < 0.001) and specific year in the survey (P < 0.001). CONCLUSIONS The ophthalmologic prognosis of SJS/TEN has dramatically improved via early diagnosis, rapid assessment of acute ocular severity, and early treatment.