Abstract Chimeric antigen receptor (CAR)–modified T cells with anti-CD19 specificity are a highly effective novel immune therapy for relapsed/refractory acute lymphoblastic leukemia. Cytokine release syndrome (CRS) is the most significant and life-threatening toxicity. To improve understanding of CRS, we measured cytokines and clinical biomarkers in 51 CTL019-treated patients. Peak levels of 24 cytokines, including IFNγ, IL6, sgp130, and sIL6R, in the first month after infusion were highly associated with severe CRS. Using regression modeling, we could accurately predict which patients would develop severe CRS with a signature composed of three cytokines. Results were validated in an independent cohort. Changes in serum biochemical markers, including C-reactive protein and ferritin, were associated with CRS but failed to predict development of severe CRS. These comprehensive profiling data provide novel insights into CRS biology and, importantly, represent the first data that can accurately predict which patients have a high probability of becoming critically ill. Significance: CRS is the most common severe toxicity seen after CAR T-cell treatment. We developed models that can accurately predict which patients are likely to develop severe CRS before they become critically ill, which improves understanding of CRS biology and may guide future cytokine-directed therapy. Cancer Discov; 6(6); 664–79. ©2016 AACR. See related commentary by Rouce and Heslop, p. 579. This article is highlighted in the In This Issue feature, p. 561

Cancer immunotherapy based on genetically redirecting T cells has been used successfully to treat B cell malignancies1–3. In this strategy, the T cell genome is modified by integration of viral vectors or transposons encoding chimaeric antigen receptors (CARs) that direct tumour cell killing. However, this approach is often limited by the extent of expansion and persistence of CAR T cells4,5. Here we report mechanistic insights from studies of a patient with chronic lymphocytic leukaemia treated with CAR T cells targeting the CD19 protein. Following infusion of CAR T cells, anti-tumour activity was evident in the peripheral blood, lymph nodes and bone marrow; this activity was accompanied by complete remission. Unexpectedly, at the peak of the response, 94% of CAR T cells originated from a single clone in which lentiviral vector-mediated insertion of the CAR transgene disrupted the methylcytosine dioxygenase TET2 gene. Further analysis revealed a hypomorphic mutation in this patient’s second TET2 allele. TET2-disrupted CAR T cells exhibited an epigenetic profile consistent with altered T cell differentiation and, at the peak of expansion, displayed a central memory phenotype. Experimental knockdown of TET2 recapitulated the potency-enhancing effect of TET2 dysfunction in this patient’s CAR T cells. These findings suggest that the progeny of a single CAR T cell induced leukaemia remission and that TET2 modification may be useful for improving immunotherapies. Genetically engineered T cells that induced remission in a patient with chronic lymphocytic leukaemia were found to have disruption of the TET2 gene, which caused T cell changes that potentiated their anti-tumour effects.

We report a patient relapsing 9 months after CD19-targeted CAR T cell (CTL019) infusion with CD19– leukemia that aberrantly expressed the anti-CD19 CAR. The CAR gene was unintentionally introduced into a single leukemic B cell during T cell manufacturing, and its product bound in cis to the CD19 epitope on the surface of leukemic cells, masking it from recognition by and conferring resistance to CTL019. A CAR gene unintentionally introduced in a contaminating leukemia cell during the manufacturing of CAR T cells caused a patient to relapse after therapy.

Potent CD19-directed immunotherapies, such as chimeric antigen receptor T cells (CART) and blinatumomab, have drastically changed the outcome of patients with relapsed/refractory B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). However, CD19-negative relapses have emerged as a major problem that is observed in approximately 30% of treated patients. Developing approaches to preventing and treating antigen-loss escapes would therefore represent a vertical advance in the field. Here, we found that in primary patient samples, the IL-3 receptor α chain CD123 was highly expressed on leukemia-initiating cells and CD19-negative blasts in bulk B-ALL at baseline and at relapse after CART19 administration. Using intravital imaging in an antigen-loss CD19-negative relapse xenograft model, we determined that CART123, but not CART19, recognized leukemic blasts, established protracted synapses, and eradicated CD19-negative leukemia, leading to prolonged survival. Furthermore, combining CART19 and CART123 prevented antigen-loss relapses in xenograft models. Finally, we devised a dual CAR-expressing construct that combined CD19- and CD123-mediated T cell activation and demonstrated that it provides superior in vivo activity against B-ALL compared with single-expressing CART or pooled combination CART. In conclusion, these findings indicate that targeting CD19 and CD123 on leukemic blasts represents an effective strategy for treating and preventing antigen-loss relapses occurring after CD19-directed therapies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is resistant to T-cell–mediated immunotherapy. We engineered T cells to transiently express a messenger RNA encoding a chimeric antigen receptor (CAR) specific for mesothelin, a protein that is overexpressed by PDAC cells. We performed a phase I study to evaluate the safety and efficacy of adoptive cell therapy with autologous mesothelin-specific CAR T cells (CARTmeso cells) in 6 patients with chemotherapy-refractory metastatic PDAC. Patients were given intravenous CARTmeso cells 3 times weekly for 3 weeks. None of the patients developed cytokine release syndrome or neurologic symptoms and there were no dose-limiting toxicities. Disease stabilized in 2 patients, with progression-free survival times of 3.8 and 5.4 months. We used 18F-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG)-positron emission tomography/computed tomography imaging to monitor the metabolic active volume (MAV) of individual tumor lesions. The total MAV remained stable in 3 patients and decreased by 69.2% in 1 patient with biopsy-proven mesothelin expression; in this patient, all liver lesions had a complete reduction in FDG uptake at 1 month compared with baseline, although there was no effect on the primary PDAC. Transient CAR expression was detected in patients’ blood after infusion and led to expansion of new immunoglobulin G proteins. Our results provide evidence for the potential antitumor activity of messenger RNA CARTmeso cells, as well as PDAC resistance to the immune response. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is resistant to T-cell–mediated immunotherapy. We engineered T cells to transiently express a messenger RNA encoding a chimeric antigen receptor (CAR) specific for mesothelin, a protein that is overexpressed by PDAC cells. We performed a phase I study to evaluate the safety and efficacy of adoptive cell therapy with autologous mesothelin-specific CAR T cells (CARTmeso cells) in 6 patients with chemotherapy-refractory metastatic PDAC. Patients were given intravenous CARTmeso cells 3 times weekly for 3 weeks. None of the patients developed cytokine release syndrome or neurologic symptoms and there were no dose-limiting toxicities. Disease stabilized in 2 patients, with progression-free survival times of 3.8 and 5.4 months. We used 18F-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG)-positron emission tomography/computed tomography imaging to monitor the metabolic active volume (MAV) of individual tumor lesions. The total MAV remained stable in 3 patients and decreased by 69.2% in 1 patient with biopsy-proven mesothelin expression; in this patient, all liver lesions had a complete reduction in FDG uptake at 1 month compared with baseline, although there was no effect on the primary PDAC. Transient CAR expression was detected in patients’ blood after infusion and led to expansion of new immunoglobulin G proteins. Our results provide evidence for the potential antitumor activity of messenger RNA CARTmeso cells, as well as PDAC resistance to the immune response. See editorial on page 11. See editorial on page 11. What You Need to KnowBackground and ContextChimeric antigen receptor (CAR)-modified autologous T cells are an effective way to target cancer cells particularly in hematological malignancies, but their application to solid malignancies such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains ill-defined.New FindingsCAR T cells were safely administered to 6 PDAC patients with one patient showing a response in the liver, despite lack of activity against the primary lesion in the same patient.LimitationsThis study included a small cohort of patients, and CAR expression on autologous T cells was engineered to be transient, using mRNA electroporation for initial safety evaluation.ImpactCAR T cells are a potentially valuable tool for evaluating mechanisms of immune resistance in PDAC. Chimeric antigen receptor (CAR)-modified autologous T cells are an effective way to target cancer cells particularly in hematological malignancies, but their application to solid malignancies such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) remains ill-defined. CAR T cells were safely administered to 6 PDAC patients with one patient showing a response in the liver, despite lack of activity against the primary lesion in the same patient. This study included a small cohort of patients, and CAR expression on autologous T cells was engineered to be transient, using mRNA electroporation for initial safety evaluation. CAR T cells are a potentially valuable tool for evaluating mechanisms of immune resistance in PDAC. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) has demonstrated striking resistance to T-cell immunotherapy.1Le D.T. et al.J Clin Oncol. 2017; 35 (abstract 345)PubMed Google Scholar, 2Brahmer J.R. et al.N Engl J Med. 2012; 366: 2455-2465Crossref PubMed Scopus (5856) Google Scholar, 3Royal R.E. et al.J Immunother. 2010; 33: 828-833Crossref PubMed Scopus (791) Google Scholar This resistance may reflect the lack of strong immunogenic neoantigens4Alexandrov L.B. et al.Nature. 2013; 500: 415-421Crossref PubMed Scopus (6263) Google Scholar in PDAC or ineffective priming of endogenous T cells in vivo.5Le D.T. et al.J Clin Oncol. 2015; 33: 1325-1333Crossref PubMed Scopus (417) Google Scholar, 6Beatty G.L. et al.Gastroenterology. 2015; 149: 201-210Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (181) Google Scholar To circumvent these issues, T cells can be synthetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) that activates T cells on engagement with its cognate cell surface target protein.7Gill S. et al.Immunol Rev. 2015; 263: 68-89Crossref PubMed Scopus (261) Google Scholar However, the translation of CAR T cells to solid malignancies has been hampered by on-target off-tumor toxicities as a result of target antigen expression by normal healthy tissues.8Morgan R.A. et al.Mol Ther. 2010; 18: 843-851Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1762) Google Scholar, 9Lamers C.H. et al.J Clin Oncol. 2006; 24: e20-e22Crossref PubMed Scopus (699) Google Scholar To address this concern, we have used messenger RNA (mRNA) electroporation to engineer T cells to transiently express a CAR, so as to limit exposure and potential for toxicity. Here, we conducted a phase I study to evaluate adoptive cell therapy with autologous T lymphocytes (mesothelin-specific CAR T [CARTmeso] cells) genetically modified with mRNA to express a CAR recognizing mesothelin,10Beatty G.L. et al.Pharmacol Ther. 2016; 166: 30-39Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar a protein that is overexpressed in most surgically resected PDACs11Pastan I. et al.Cancer Res. 2014; 74: 2907-2912Crossref PubMed Scopus (165) Google Scholar, 12Argani P. et al.Clin Cancer Res. 2001; 7: 3862-3868PubMed Google Scholar but also found on some normal tissues, including the lining of the peritoneum, pleura, and pericardium. Six patients with chemotherapy-refractory metastatic PDAC received CARTmeso cells administered intravenously 3 times weekly for 3 weeks (Figure 1A, Supplementary Figure 1, and Supplementary Methods). Fifty-three of 54 planned CARTmeso cell infusions were administered. None of the patients experienced cytokine release syndrome or neurologic symptoms (Supplementary Table 1). There were no dose-limiting toxicities. Safety and tolerability of the infusions are described in Supplementary Methods. The best overall response achieved with mRNA CARTmeso cells was stable disease by RECIST v1.1, with 2 patients (08212-100 and 08212-108) demonstrating progression-free survival lasting 3.8 and 5.4 months, respectively (Figure 1B and Supplementary Figure 1). We used 18F-2-fluoro-2-deoxy-D-glucose (FDG) positron emission tomography/computed tomography imaging to monitor the metabolically active volume (MAV) and maximum standardized uptake value of individual tumor lesions (Figure 1C and D). We found that the total MAV remained stable in 3 patients but decreased by 69.2% in 1 patient (08212-113). For 08212-113, maximum standardized uptake value for all lesions was found to decrease with a complete reduction in FDG uptake seen in all liver lesions at month 1 compared with baseline, despite an increase in MAV within the primary pancreatic lesion (Figure 1E and F). This dramatic reduction in FDG uptake is atypical for the course of this disease and, thus, this observation is highly suggestive of the potential antitumor activity of mRNA CARTmeso cells. CAR expression is transient in T cells when introduced as mRNA.13Beatty G.L. et al.Cancer Immunol Res. 2014; 2: 112-120Crossref PubMed Scopus (611) Google Scholar Consistent with this, we detected CAR transcripts transiently in the blood after each infusion in all patients (Figure 2A). To determine the impact of CARTmeso cell infusion on endogenous immune responses, we first examined serum cytokine levels within the peripheral blood after infusion. We found elevated levels of several inflammatory cytokines, including interleukin (IL)6, hepatocyte growth factor, IL1RA, and IL8, after starting therapy in patient 08212-113, but not in any of the other patients (Figure 2B). We also detected no significant levels of human anti-mouse antibodies in patients at baseline or at multiple defined time points after CARTmeso infusion. In contrast, human anti-chimeric antibodies were seen in some patients (Supplementary Figure 2A). We next analyzed serum from patients at baseline and 1 to 2 months after beginning CARTmeso therapy for the presence of immunoglobulin G antibodies reactive to an array of >9000 proteins. For all but 1 patient (08212-108), antibody levels against multiple protein targets were found to increase, with some against previously unrecognized proteins (Figure 2C, Supplementary Tables 2 and 3). Gene ontology analysis of differentially recognized proteins from all patients identified oxidative stress and leukocyte activation and proliferation as the most significantly upregulated protein function groups (Supplementary Figure 2C). Increases in immunoglobulin G antibodies reactive against 6 proteins, including 3 immune-related proteins (BCMA, PD-1, and PD-L1), were detected in multiple patients (Supplementary Figure 2D). We next considered the possibility that exclusion of T cells from the tumor microenvironment, lack of mesothelin expression on malignant cells, or both might limit the efficacy of CARTmeso cell therapy. Tumor biopsies at 3 to 7 days after the last infusion were available from patients 08212-104 and 08212-108 who demonstrated disease progression and prolonged stable disease, respectively. CAR transcripts were not detected in either biopsy, excluding the presence of CARTmeso cells within tumors at this time point. Baseline tumor biopsies were available for patients 08212-108 and 08212-113 and showed CD3+ T cells among malignant cells in both specimens suggesting the potential of T cells to penetrate the tumor microenvironment in these patients (Figure 2D). For patient 08212-108, mesothelin expression was confined to the cytoplasm of malignant cells, whereas for patient 08212-113, malignant cells showed mesothelin expression on the cell surface, a prerequisite for CARTmeso effector activity (Figure 2D). Our findings reveal the safety, feasibility, and therapeutic potential of autologous T cells redirected with a CAR recognizing mesothelin for the treatment of PDAC. The mixed metabolic response detected in 1 patient with biopsy-proven cell surface expression of mesothelin implies distinct biology associated with primary and metastatic lesions in this patient. We hypothesized that CARTmeso cells may produce a vaccine effect by inducing tumor cell death and the release of tumor-associated antigens. Consistent with this hypothesis, we found that therapy induced a spreading of antibody responses against multiple proteins, including immunoregulatory molecules (eg, PD-1, PD-L1, and BCMA). Further, we have recently reported that mRNA CARTmeso cell infusion stimulates clonal expansion of T-cell clones, which may contribute to the antitumor potential of CAR T cells.14Kim R.H. et al.J Clin Oncol. 2017; 35 (3011–3011)Google Scholar The ultimate fate of tumor-infiltrating T cells, though, is determined by signals received within the tumor microenvironment. In our study, we were unable to evaluate the fate of adoptively transferred CARTmeso cells due to transient CAR expression in vivo. In conclusion, we propose that CARTmeso adoptive cell therapy can serve as a novel tool for probing the immunobiology of PDAC, without issues of T-cell priming, and in doing so, guide the development of effective T-cell immunotherapies in this disease. The authors thank the nurses of the Clinical Trials Research Center, Don Siegel Director of Transfusion Medicine and Therapeutic Pathology, and the staff of the Apheresis Unit at the Hospital of the University of Pennsylvania for their outstanding and dedicated patient care and careful data collection. We also acknowledge Natalka Kengle for cytokine luminex assays, Jeffrey Finklestein and Minnal Gupta for sample processing, Vanessa Gonzalez for data management and quality control, and Andrea Brennan and the staff of the Clinical Cell and Vaccine Production Facility for cell manufacturing and testing. We also thank the Lustgarten Foundation and Cancer Research Institute for funding and support of this study. This article presents original results of a phase I study of autologous mesothelin-specific chimeric antigen receptor–modified T cells in patients with chemotherapy-refractory metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma. Preliminary findings were reported at the 51st Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology, May 29–June 2, 2015, Chicago, IL. Author Contributions: Study concept and design: Gregory L. Beatty, Gabriela Plesa, and Carl H. June; acquisition of data: Gregory L. Beatty, Mark H. O’Hara, Drew A. Torigian, Maureen McGarvey, Anne Marie Nelson; analysis and interpretation of data: all authors contributed; drafting of manuscript: Gregory L. Beatty; critical revision of the manuscript for important intellectual content: all authors contributed; statistical analysis: Gregory L. Beatty, Farzana Nazimuddin, Simon F. Lacey, Fang Chen; obtained funding: Gregory L. Beatty, Carl H. June; study supervision: Gregory L. Beatty, Gabriela Plesa, Carl H. June. All authors edited and approved the final manuscript. Download .pdf (.14 MB) Help with pdf files Supplementary Material Download .pdf (.07 MB) Help with pdf files Supplementary Figure 1 Download .pdf (.16 MB) Help with pdf files Supplementary Figure 2 Download .pdf (.06 MB) Help with pdf files Supplementary Table 1 Download .pdf (.14 MB) Help with pdf files Supplementary Table 2 Download .pptx (.04 MB) Help with pptx files Supplementary Table 3 Unmasking Pancreatic Cancer: Epitope Spreading After Single Antigen Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy in a Human Phase I TrialGastroenterologyVol. 155Issue 1PreviewT-cells engineered with antibody-like recognition domains, better known as CAR-Ts, represent a promising treatment modality for cancer. Approval from the US Food and Drug Administration for two CD19-directed CAR-T therapies has invigorated research in this area. CD19 expression is restricted to normal B cells and B-cell leukemias, and is critical for leukemic cell survival, making it a nearly perfect therapeutic target, which has been difficult to emulate in solid tumors. Nevertheless, efforts to extend CAR-T technology to solid tumors are underway, and, in this issue of Gastroenterology, Beatty et al1 demonstrate that mesothelin-specific CAR T-cell therapy is feasible in pancreatic ductal adenocarcinoma. Full-Text PDF