Phase-separated states of proteins underlie ribonucleoprotein (RNP) granules and nuclear RNA-binding protein assemblies that may nucleate protein inclusions associated with neurodegenerative diseases. We report that the N-terminal low-complexity domain of the RNA-binding protein Fused in Sarcoma (FUS LC) is structurally disordered and forms a liquid-like phase-separated state resembling RNP granules. This state directly binds the C-terminal domain of RNA polymerase II. Phase-separated FUS lacks static structures as probed by fluorescence microscopy, indicating they are distinct from both protein inclusions and hydrogels. We use solution nuclear magnetic resonance spectroscopy to directly probe the dynamic architecture within FUS liquid phase-separated assemblies. Importantly, we find that FUS LC retains disordered secondary structure even in the liquid phase-separated state. Therefore, we propose that disordered protein granules, even those made of aggregation-prone prion-like domains, are dynamic and disordered molecular assemblies with transiently formed protein-protein contacts.

Abstract Very few demographic surveys in developing countries have gathered information on household incomes or consumption expenditures. Researchers interested in living standards therefore have had little alternative but to rely on simple proxy indicators. The properties of these proxies have not been analyzed systematically. We ask what hypotheses can be tested using proxies, and compare these indicators with consumption expenditures per adult, our preferred measure of living standards. We find that the proxies employed in much demographic research are very weak predictors of consumption per adult. Nevertheless, hypothesis tests based on proxies are likely to be powerful enough to warrant consideration.

Article8 August 2017Open Access Transparent process Phosphorylation of the FUS low-complexity domain disrupts phase separation, aggregation, and toxicity Zachary Monahan Zachary Monahan Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Veronica H Ryan Veronica H Ryan Neuroscience Graduate Program, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Abigail M Janke Abigail M Janke Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Kathleen A Burke Kathleen A Burke Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Shannon N Rhoads Shannon N Rhoads Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Gül H Zerze Gül H Zerze Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA Search for more papers by this author Robert O'Meally Robert O'Meally Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomic Facility, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Gregory L Dignon Gregory L Dignon orcid.org/0000-0001-8016-8652 Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA Search for more papers by this author Alexander E Conicella Alexander E Conicella Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Wenwei Zheng Wenwei Zheng Laboratory of Chemical Physics, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Robert B Best Robert B Best Laboratory of Chemical Physics, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Robert N Cole Robert N Cole Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomic Facility, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Jeetain Mittal Jeetain Mittal orcid.org/0000-0002-9725-6402 Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA Search for more papers by this author Frank Shewmaker Corresponding Author Frank Shewmaker [email protected] orcid.org/0000-0003-2022-0249 Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Nicolas L Fawzi Corresponding Author Nicolas L Fawzi [email protected] orcid.org/0000-0001-5483-0577 Neuroscience Graduate Program, Brown University, Providence, RI, USA Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Zachary Monahan Zachary Monahan Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Veronica H Ryan Veronica H Ryan Neuroscience Graduate Program, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Abigail M Janke Abigail M Janke Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Kathleen A Burke Kathleen A Burke Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Shannon N Rhoads Shannon N Rhoads Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Gül H Zerze Gül H Zerze Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA Search for more papers by this author Robert O'Meally Robert O'Meally Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomic Facility, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Gregory L Dignon Gregory L Dignon orcid.org/0000-0001-8016-8652 Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA Search for more papers by this author Alexander E Conicella Alexander E Conicella Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Wenwei Zheng Wenwei Zheng Laboratory of Chemical Physics, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Robert B Best Robert B Best Laboratory of Chemical Physics, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Robert N Cole Robert N Cole Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomic Facility, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA Search for more papers by this author Jeetain Mittal Jeetain Mittal orcid.org/0000-0002-9725-6402 Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA Search for more papers by this author Frank Shewmaker Corresponding Author Frank Shewmaker [email protected] orcid.org/0000-0003-2022-0249 Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA Search for more papers by this author Nicolas L Fawzi Corresponding Author Nicolas L Fawzi [email protected] orcid.org/0000-0001-5483-0577 Neuroscience Graduate Program, Brown University, Providence, RI, USA Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, Providence, RI, USA Search for more papers by this author Author Information Zachary Monahan1,‡, Veronica H Ryan2,‡, Abigail M Janke3, Kathleen A Burke3, Shannon N Rhoads1, Gül H Zerze4, Robert O'Meally5, Gregory L Dignon4, Alexander E Conicella6, Wenwei Zheng7, Robert B Best7, Robert N Cole5, Jeetain Mittal4, Frank Shewmaker *,1 and Nicolas L Fawzi *,2,3,6 1Department of Pharmacology and Molecular Therapeutics, Uniformed Services University, Bethesda, MD, USA 2Neuroscience Graduate Program, Brown University, Providence, RI, USA 3Department of Molecular Pharmacology, Physiology, and Biotechnology, Brown University, Providence, RI, USA 4Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Lehigh University, Bethlehem, PA, USA 5Johns Hopkins Mass Spectrometry and Proteomic Facility, Johns Hopkins University, Baltimore, MD, USA 6Graduate Program in Molecular Biology, Cell Biology and Biochemistry, Brown University, Providence, RI, USA 7Laboratory of Chemical Physics, National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA ‡These authors contributed equally to this work *Corresponding author. Tel: +1 301 295 3527; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +1 401 863 5232; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2017)36:2951-2967https://doi.org/10.15252/embj.201696394 See also: J Shorter (October 2017) [The copyright line of this article was changed on 14 August 2017 after original online publication.] PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Neuronal inclusions of aggregated RNA-binding protein fused in sarcoma (FUS) are hallmarks of ALS and frontotemporal dementia subtypes. Intriguingly, FUS's nearly uncharged, aggregation-prone, yeast prion-like, low sequence-complexity domain (LC) is known to be targeted for phosphorylation. Here we map in vitro and in-cell phosphorylation sites across FUS LC. We show that both phosphorylation and phosphomimetic variants reduce its aggregation-prone/prion-like character, disrupting FUS phase separation in the presence of RNA or salt and reducing FUS propensity to aggregate. Nuclear magnetic resonance spectroscopy demonstrates the intrinsically disordered structure of FUS LC is preserved after phosphorylation; however, transient domain collapse and self-interaction are reduced by phosphomimetics. Moreover, we show that phosphomimetic FUS reduces aggregation in human and yeast cell models, and can ameliorate FUS-associated cytotoxicity. Hence, post-translational modification may be a mechanism by which cells control physiological assembly and prevent pathological protein aggregation, suggesting a potential treatment pathway amenable to pharmacologic modulation. Synopsis Self-association of the ALS and FTD neurodegenerative disease-linked RNA-binding protein FUS is regulated by phosphorylation of its low complexity domain. FUS low complexity (LC) domain can be phosphorylated at several sites: by DNA-PK at 12 sites in vitro, and in human cells after DNA damage at additional sites. FUS LC phosphorylation and phosphomimetic substitution discourages phase separation and aggregation. FUS LC phosphomimetic substitution decreases FUS aggregation in yeast and human cell models. FUS LC phosphomimetic substitution reduces FUS toxicity in the yeast model. Introduction Protein aggregation is a common hallmark of neurodegenerative disease (Harper & Lansbury, 1997; Trojanowski et al, 1998; Koo et al, 1999; Aguzzi & O'Connor, 2010) although the mechanisms of toxicity remain poorly understood. Different neurodegenerative diseases, or their subtypes, are often distinguished by the specific patterns of protein aggregation. Subtypes of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and frontotemporal dementia (FTD), two related neurodegenerative diseases, are characterized by neuronal inclusions of the RNA-binding protein fused in sarcoma (FUS; Kwiatkowski et al, 2009; Neumann et al, 2009; Vance et al, 2009; Mitchell et al, 2013). FUS is highly abundant (Beck et al, 2011; Uhlen et al, 2015) and involved in RNA processing, splicing, and transport (Sama et al, 2014). FUS consists of a N-terminal serine/tyrosine/glycine/glutamine (SYGQ)-rich low-complexity domain (LC), several RGG-rich domains, an RNA recognition motif (RRM), a zinc finger domain, and a PY nuclear localization signal (NLS). FUS is primarily localized in the nucleus, but can shuttle between the nucleus and the cytoplasm. Familial ALS mutations in FUS most often disrupt the nuclear localization signal, resulting in cytoplasmic accumulation and apparent gain-of-function toxicity (Scekic-Zahirovic et al, 2016; Sharma et al, 2016). An emerging hypothesis is that RNA-binding protein aggregation in neurodegenerative diseases is seeded from cytoplasmic ribonucleoprotein (RNP) granules (Li et al, 2013), including stress granules (SGs), processing bodies (P-bodies), and transport granules (Kiebler & Bassell, 2006; Thomas et al, 2011). Recent reports suggest these granules are membraneless organelles, partially or wholly stabilized by liquid–liquid phase separation (LLPS) where molecules self segregate (demix) to form two co-existing liquids as observed for oil droplets in water (Courchaine et al, 2016). However, unlike oil–water emulsions, RNP granules formed by LLPS are not devoid of water and are thought to be stabilized by multivalent, dynamic protein:protein and protein:mRNA interactions, concentrating granule components into a dense and viscous compartment into which other molecules can partition and localizing their cellular function (Ryu et al, 2014; Burke et al, 2015; Di Salvio et al, 2015; Lenzi et al, 2015; Bowden & Dormann, 2016; Daigle et al, 2016; Nott et al, 2016). Indeed, FUS-containing granules and FUS at sites of DNA damage have liquid-like properties in cells (Patel et al, 2015). We recently showed that FUS LC maintains its primarily disordered structure within in vitro models of RNP granules (Burke et al, 2015). However, the high local concentration of proteins in RNP granules formed by LLPS may potentiate the conversion of liquid compartments into solid cytoplasmic aggregates and inclusions observed in disease (Murakami et al, 2015; Patel et al, 2015). This phenomenon may be enhanced by mutations in disease-associated ribonuclear proteins that increase their cytoplasmic concentration (Vance et al, 2013) or aggregation propensity (Kim et al, 2013). LLPS, FUS granule assembly, and FUS inclusion formation both in vitro and in cells require the aggregation-prone FUS LC (Shelkovnikova et al, 2014; Patel et al, 2015). The FUS LC has garnered particular attention because its polar-rich sequence resembles so-called prion domains that form self-propagating amyloid aggregates in yeast cells (Gitler & Shorter, 2011; Ju et al, 2011; Kryndushkin et al, 2011; Sun et al, 2011). Yeast prion domains contain a paucity of hydrophobic and charged residues, but are rich in polar residues, especially glutamine and asparagine (Ross & Toombs, 2010). Several human proteins including FUS, TDP-43, hnRNPA1, and hnRNPA2 contain low-complexity sequences that are compositionally similar to yeast prion domains. Note that yeast prion and mammalian prion-like domains have no sequence resemblance nor homology to the mammalian PrP prion associated with “mad cow disease”. Human prion-like domains have emerged as primary drivers of cytoplasmic protein aggregation in neurodegenerative disease and are also sites of mutations in genetic forms of these conditions (King et al, 2012). Importantly, mammalian domains categorized as prion-like are not homologous to yeast prions, but do contain amino acids such as serine, threonine, and tyrosine, which are potential targets of cellular phosphorylation. Low-complexity domains associated with LLPS and granule formation are targets of phosphorylation, possibly to regulate assembly (Aguzzi & Altmeyer, 2016). Previous studies have found that FUS is phosphorylated by phosphoinositide 3-kinase-like kinases (PIKKs), especially DNA-dependent protein kinase (DNA-PK; Gardiner et al, 2008; Deng et al, 2014). PIKKs phosphorylate their protein targets at serine or threonine residues followed by glutamine (S/TQ; Kim et al, 1999; O'Neill et al, 2000). Indeed, the FUS LC domain has twelve S/TQ motifs (8 SQ, 4 TQ), but previous in vitro DNA-PK phosphorylation of FUS identified only pS26, pS42, pS61, pS84, and pS131 (Gardiner et al, 2008; Han et al, 2012). Although FUS phosphorylation is thought to increase cytoplasmic FUS partitioning (Deng et al, 2014), little is known about the effect of post-translational modifications on FUS self-assembly. Interestingly, in vitro phosphorylation of recombinant, isolated FUS LC reduces its ability to bind hydrogels formed from amyloid-like fibrils of purified recombinant, unphosphorylated FUS LC (Han et al, 2012). However, the effect of FUS phosphorylation on LLPS has not yet been determined. Modification of FUS with poly(ADP-ribose; PAR) at sites of DNA damage induces phase separation of FUS (Altmeyer et al, 2015), while arginine methylation of the nuage protein DDX4 reduces LLPS (Nott et al, 2015). More generally, many of the low-complexity prion-like domains associated with aggregation in disease have been shown by proteomic screens to harbor many sites of post-translational modification. However, the significance of these sites remains largely unknown. Here, we combine nuclear magnetic resonance spectroscopy, in vitro phase separation and aggregation assays, in-cell phosphorylation site identification by proteomic mass spectrometry, and cellular aggregation and toxicity assays to characterize the location and effect of LC phosphorylation on FUS structure, interactions, aggregation, and toxicity. Because FUS aggregation in the cytoplasm of motor neurons is linked to gain-of-function cytotoxicity, altering FUS phosphorylation could serve as a therapeutic strategy for diseases that currently have no effective therapeutics. Results FUS LC is multiply phosphorylated by DNA-PK The N-terminal, 163-amino acid, low-complexity domain (LC) of FUS contains 12 conserved S/TQ sequence motifs that make up the primary recognition site of DNA-dependent protein kinase (DNA-PK; Fig 1A, gray lines, Appendix Fig S1A; Kim et al, 1999). However, DNA-PK treatment in vitro followed by either tandem mass spectroscopy or Edman sequencing resulted in identification of only five phosphorylation sites in FUS: S26, S42, S61, S84, and S131 (Gardiner et al, 2008; Han et al, 2012). None of the four conserved TQ sites were detected. We and others have suspected that the complete lack of positively charged residues in FUS LC obscures phosphorylation detection by standard proteomic workflows due to lack of positive residues both for efficient positive ion formation for mass spectrometry and for trypsin cleavage sites (Knight et al, 2003). Therefore, to determine the full possible extent of the FUS LC phosphorylation by DNA-PK, we used in vitro DNA-PK phosphorylation as described previously (Gardiner et al, 2008; Han et al, 2012; Deng et al, 2014) and detected phosphosites by two-dimensional solution NMR, which offers direct residue resolution. The appearance of many robust peaks in the phosphoserine and importantly in the phosphothreonine regions of the 1H 15N heteronuclear single quantum coherence (HSQC) spectrum immediately suggests FUS can be phosphorylated at more positions than the five previously reported serines (Fig 1B). By phosphorylating a series of single serine/threonine-to-alanine FUS LC variants and single alanine-to-serine/threonine variants in a 12 alanine FUS LC background, we assigned the phosphorylated resonances. We find that FUS LC is phosphorylated at all 12 distinct S/TQ sites. Observing the extent of phosphorylation over time in vitro by NMR shows that some residues (T7, T11, T19, S26, S42, S61, S84) are effectively fully phosphorylated as measured by a complete loss of intensity of the unphosphorylated peak (Fig 1C, Appendix Fig S1B). Other positions (S30, T68, S87, S117) appear to be incompletely phosphorylated even after extended incubation. However, the apparent halting of the reaction can be attributed to deactivation of DNA-PK by auto-phosphorylation that is almost complete by 30 min (Carter et al, 1990). The fact that the sum of the intensity of phosphorylated and unphosphorylated peaks does not add to 1 may be due to heterogeneity in the phosphorylation pattern increasing peak width and to alteration in spin relaxation properties. Based on the extent of phosphorylation observed, each FUS polypeptide must be multiply phosphorylated. Taken together, these data establish that DNA-PK is able to phosphorylate all S/TQ positions in the FUS LC, including all 4 TQ positions, none of which had been identified in previous in vitro experiments. Figure 1. FUS LC is multiply phosphorylated FUS contains an SYQG-rich low-complexity (LC) domain, a glycine-rich domain containing RGG motifs, an RNA recognition motif (RRM), two RGG-rich domains separated by a zinc finger (ZnF), and a non-canonical PY nuclear localization signal (NLS). PLAAC scores (Lancaster et al, 2014) indicating the degree of prion-like character in WT (black) and phosphomimetic (12E, red) full-length FUS show that phosphomimetic mutations reduce the prion-like character of the low-complexity domain. 12E refers to FUS containing 12 phosphomimetic (E, glutamate) substitutions at the S/TQ DNA-PK consensus phosphorylation sites in the LC domain, indicated by a gray line. FUS is phosphorylated at all 12 S/TQ sites in vitro by DNA-PK, as identified by NMR. Change in intensity of phosphorylated (orange) and not phosphorylated (blue) peaks in NMR spectra quantified over time for select residues (time course of phosphorylation for the remaining residues can be found in Appendix Fig S1). Error bars indicate ± SD derived from uncertainty in NMR signal intensity in a single representative biochemical experiment. Treatment of HEK cells with calicheamicin, which causes double-strand breaks, results in a change in the apparent mobility of FUS when analyzed by SDS–PAGE, consistent with previously published findings and reversible by subsequent phosphatase treatment (Deng et al, 2014). Download figure Download PowerPoint Identification of FUS LC phosphorylation sites in cells Although FUS LC is known to be a target of phosphorylation, site-specific identification of in-cell phosphorylation sites has not been reported using proteomic approaches due to the difficulties described above. Treatment of cells with calicheamicin causes double-strand DNA breaks that activate DNA-PK, which is proposed to phosphorylate FUS LC. We confirmed phosphorylation in cells induces a large SDS–PAGE mobility shift (Fig 1D) that collapses upon treatment with phosphatase (data not shown), as reported previously (Deng et al, 2014). A similar phosphorylation-induced mobility shift was reported after treatment with calyculin A (Deng et al, 2014), a phosphatase inhibitor that stimulates DNA damage (Takeuchi et al, 1994). Using phosphopeptide enrichment approaches, we attempted to identify phosphorylation sites in the LC of endogenous FUS in human cells. Our initial efforts to identify the phosphosites by FUS immunoprecipitation and positive ion tandem mass spectroscopy of chymotrypsin digests were not successful. This was likely a result of the complete lack of positively charged residues in FUS LC, precluding trypsin digest and resulting in low ionization of highly negatively charged peptides (Schuller & Eick, 2016), placing FUS LC phosphopeptides in the noise. We therefore developed a strategy to remove easily ionizable peptides by an initial digest with trypsin, washing away tryptic fragments via centrifugal filtration leaving the undigested FUS LC intact, and then cleaving with chymotrypsin followed by TiO2 phosphopeptide enrichment. This procedure enabled identification of pS26 as well as three other non-S/TQ sites pT71, pS77, and pS96 after calicheamicin treatment. Calyculin A treatment resulted in detection of phosphorylation at S/TQ sites pT7, pS26, pS30, pS42, and pS61, as well as the same non-S/TQ sites (pT71, pS77, and pS96) among others (Appendix Fig S1C). We observed only mono-phosphorylated chymotryptic peptide fragments. Multi-phosphorylated peptides likely were present but were not detected due to low abundance or increasing net negative charge of the peptide. No FUS LC phosphopeptides were identified in control treatments with DMSO, which is consistent with none being previously reported under un-stressed conditions (Gardiner et al, 2008; Deng et al, 2014). Combined with previous work showing that DNA-PK activity is required for the mobility shift detected phosphorylation, these results demonstrate that FUS LC is cellularly phosphorylated both at S/TQ and other positions following DNA damage. Given the high specificity of DNA-PK for S/TQ sites (Fig 1B), the phosphorylation we identified at non-S/TQ positions likely arises from other kinases. In total, by mass spectrometry and NMR we have identified 17 putative phosphosites in FUS LC, suggesting phosphorylation could have a role in FUS function. Phosphorylation and phosphomimetic variants reduce FUS LC phase separation and aggregation FUS LC is rich in aromatic and glutamine residues, mediating self-assembly into granules and inclusion formation in ALS and frontotemporal dementia. We next sought to test the hypothesis that phosphorylation could disrupt FUS self-association and aggregation by altering the biophysical properties of the LC. One measure of the self-assembly/aggregation propensity of disordered domains is a quantitative assessment of their “prion-like” character, a name given to sequences enriched in polar residues and lacking charged and aliphatic residues as found in yeast prion proteins (Cascarina & Ross, 2014). Mimicking phosphorylation at S/TQ positions by substitution of serine or threonine with the negatively charged residue glutamic acid (glutamate) results in a marked decrease in the prion-like propensity as measured by the PLAAC algorithm (Fig 1A; Lancaster et al, 2014), which identifies probable prion-like protein segments. This result is consistent with changing the sequence composition character of the domain from nearly uncharged (only two negatively charged residues; no positively charged lysine, arginine, or histidine) to polyanionic and hence soluble and self-repulsive by like-charge interactions. We tested the influence of charge on liquid–liquid phase separation (LLPS) via molecular simulations using a novel coarse-grained model (one “bead” per residue) incorporating favorable interactions based on a common hydrophobicity scale and screened electrostatic potentials. We simulated FUS LC wild-type and 12E (all 12 S/TQ sites substituted with glutamic acid, S/TQ→EQ) using a box of 22 chains and 150 mM NaCl. For wild-type FUS LC, a marked peak in the heat capacity as a function of temperature (Fig 2B) is observed concomitant with phase separation into a single continuous phase (Fig 2B, upper left inset). At the same temperature and conditions, FUS LC 12E does not show a heat capacity peak or collapse (Fig 2B). Snapshots of simulated FUS LC polypeptides are shown within Fig 2B to illustrate the change from a single uniform phase to a phase-separated condition; wild type is phase separated at temperatures below the phase transition (upper left), while 12E remains dispersed, not phase separated (bottom). To establish that the change in charge is sufficient to explain the difference between wild type and 12E, simulations isolating the contributions from electrostatic interactions were designed. Adding virtual negative charges to the 12 serine and threonine positions resulted in lack of phase separation mirroring 12E (Appendix Fig S2A), confirming that the disruption in phase separation observed in the model arises due to electrostatic repulsion. Figure 2. FUS LC phosphorylation and phosphomimetic substitution reduce FUS phase separation and aggregation in vitro WT FUS LC undergoes LLPS (top left) and aggregation (top right) under DNA-PK reaction solution conditions (no DNA-PK), while DNA-PK-treated WT FUS LC or phosphomimetic (12E) FUS LC does not (all samples incubated identically: 1 day at 25°C). Heat capacity curves for simulations of WT and 12E FUS LC show that WT undergoes a phase transition while, at the same conditions, 12E does not. At high temperatures, snapshots show both WT and 12E are disperse but at temperatures below the phase transition (7°C), WT is phase separated, while 12E remains disperse. Full-length FUS 6E and 12E are much more sensitive to salt-induced disruption of phase separation than FUS WT. FUS 6E and 12E exhibit decreased phase separation compared to WT at salt concentrations above 150 mM, and both show no phase separation in high salt conditions. Data shown is 45 min after the addition of TEV protease, which cleaves a maltose-binding protein (MBP) solubility tag fused to the N-terminus of FUS. Phase separation of full-length FUS 6E and 12E is disrupted, not enhanced, by RNA. At mass ratios of RNA:full-length FUS of 1:1 or higher, full-length FUS WT phase separation persists whereas full-length FUS 12E does not. Full-length FUS 6E shows reduced phase separation compared to WT when RNA is added at mass ratios of RNA:full-length FUS ranging from 0.2:1 to 2:1. Data shown are 45 min after addition of TEV protease. Full-length FUS 6E and 12E do not form fibrous aggregates. Differential interference contrast microscopy shows that 5 μM full-length FUS WT forms morphologically distinct assemblies as compared to 5 μM full-length FUS 6E and 12E. After the addition of TEV protease to cleave the N-terminal MBP tag, indicated samples were agitated (middle and bottom) for 1 day at 25°C. FUS WT forms fibrous aggregates in the presence and absence of RNA (0.4:1 full-length FUS, by mass), whereas FUS 6E and FUS 12E assemblies remain spherical despite agitation. Larger images of fibrous WT aggregates are shown (bottom left, blue insets). Phosphorylation of full-length FUS WT by DNA-PK prevents formation of fibrous aggregates. DIC images taken 1 h after cleavage of the N-terminal MBP tag show that full-length FUS WT and 12E undergo LLPS following phosphorylation (row 1) and control treatments (rows 2–4). After agitation at 25°C for 1 day, phosphorylated full-length FUS WT assemblies remain spherical, whereas unphosphorylated FUS WT begins to form fibrous aggregates. Full-length FUS WT exhibits aggregation in all control treatments after 3 days of agitation at 25°C. See Appendix Fig S2 for additional images of samples 1 and 3 days post-TEV. Data information: Average and standard deviation calculated from experiments performed in triplicate. Representative images are shown. Download figure Download PowerPoint To test the hypothesis that phosphorylation alters FUS LC assembly in vitro, we evaluated the phase separation of wild-type FUS LC (with and without DNA-PK treatment) and FUS LC 12E, carrying the 12 phosphomimetic substitutions at the consensus DNA-PK sites. We performed differential interference contrast (DIC) microscopy of FUS LC incubated for 1 day where wild-type FUS LC undergoes LLPS to form round micron-sized droplets (Fig 2A, top left). Some of these droplets convert to fibrous aggregates during this time (Fig 2A, top right). After the same incubation period, DNA-PK-phosphorylated FUS LC and FUS LC 12E (phosphomimetic) showed no LLPS or aggregation (Fig 2A, bottom). Given that phosphorylation and phosphomimetics of FUS LC alter self-assembly and aggregation of the isolated LC, we hypothesized that LLPS would be disrupted f

hnRNPA2, a component of RNA-processing membraneless organelles, forms inclusions when mutated in a syndrome characterized by the degeneration of neurons (bearing features of amyotrophic lateral sclerosis [ALS] and frontotemporal dementia), muscle, and bone. Here we provide a unified structural view of hnRNPA2 self-assembly, aggregation, and interaction and the distinct effects of small chemical changes—disease mutations and arginine methylation—on these assemblies. The hnRNPA2 low-complexity (LC) domain is compact and intrinsically disordered as a monomer, retaining predominant disorder in a liquid-liquid phase-separated form. Disease mutations D290V and P298L induce aggregation by enhancing and extending, respectively, the aggregation-prone region. Co-aggregating in disease inclusions, hnRNPA2 LC directly interacts with and induces phase separation of TDP-43. Conversely, arginine methylation reduces hnRNPA2 phase separation, disrupting arginine-mediated contacts. These results highlight the mechanistic role of specific LC domain interactions and modifications conserved across many hnRNP family members but altered by aggregation-causing pathological mutations.

Abstract Clear cell carcinoma of the endometrium is a rare type of endometrial cancer that is generally associated with an aggressive clinical behaviour. Here, we sought to define the repertoire of somatic genetic alterations in endometrial clear cell carcinomas (ECCs), and whether ECCs could be classified into the molecular subtypes described for endometrial endometrioid and serous carcinomas. We performed a rigorous histopathological review, immunohistochemical analysis and massively parallel sequencing targeting 300 cancer‐related genes of 32 pure ECCs. Eleven (34%), seven (22%) and six (19%) ECCs showed abnormal expression patterns for p53, ARID1A, and at least one DNA mismatch repair (MMR) protein, respectively. Targeted sequencing data were obtained from 30 of the 32 ECCs included in this study, and these revealed that two ECCs (7%) were ultramutated and harboured mutations affecting the exonuclease domain of POLE . In POLE wild‐type ECCs, TP53 (46%), PIK3CA (36%), PPP2R1A (36%), FBXW7 (25%), ARID1A (21%), PIK3R1 (18%) and SPOP (18%) were the genes most commonly affected by mutations; 18% and 11% harboured CCNE1 and ERBB2 amplifications, respectively, and 11% showed DAXX homozygous deletions. ECCs less frequently harboured mutations affecting CTNNB1 and PTEN but more frequently harboured PPP2R1A and TP53 mutations than non‐POLE endometrioid carcinomas from The Cancer Genome Atlas (TCGA). Compared to endometrial serous carcinomas (TCGA), ECCs less frequently harboured TP53 mutations. When a surrogate model for the molecular‐based TCGA classification was used, all molecular subtypes previously identified in endometrial endometrioid and serous carcinomas were present in the ECCs studied, including POLE, MMR‐deficient, copy‐number high (serous‐like)/p53 abnormal, and copy‐number low (endometrioid)/p53 wild‐type, which were significantly associated with disease‐free survival in univariate analysis. These findings demonstrate that ECCs constitute a histologically and genetically heterogeneous group of tumours with varying outcomes. Furthermore, our data suggest that the classification of ECCs as being generally ‘high‐grade’ or ‘type II’ tumours may not be warranted. Copyright © 2017 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.

Suicides have increased to over 48,000 deaths yearly in the United States. Major depressive disorder (MDD) is the most common diagnosis among suicides, and identifying those at the highest risk for suicide is a pressing challenge. The objective of this study is to identify changes in gene expression associated with suicide in brain and blood for the development of biomarkers for suicide. Blood and brain were available for 45 subjects (53 blood samples and 69 dorsolateral prefrontal cortex (DLPFC) samples in total). Samples were collected from MDD patients who died by suicide (MDD-S), MDDs who died by other means (MDD-NS) and non-psychiatric controls. We analyzed gene expression using RNA and the NanoString platform. In blood, we identified 14 genes which significantly differentiated MDD-S versus MDD-NS. The top six genes differentially expressed in blood were: PER3, MTPAP, SLC25A26, CD19, SOX9, and GAR1. Additionally, four genes showed significant changes in brain and blood between MDD-S and MDD-NS; SOX9 was decreased and PER3 was increased in MDD-S in both tissues, while CD19 and TERF1 were increased in blood but decreased in DLPFC. To our knowledge, this is the first study to analyze matched blood and brain samples in a well-defined population of MDDs demonstrating significant differences in gene expression associated with completed suicide. Our results strongly suggest that blood gene expression is highly informative to understand molecular changes in suicide. Developing a suicide biomarker signature in blood could help health care professionals to identify subjects at high risk for suicide.