For patients with large abdominal aortic aneurysms, randomized trials have shown an initial overall survival benefit for elective endovascular repair over conventional open repair. This survival difference, however, was no longer significant in the second year after the procedure. Information regarding the comparative outcome more than 2 years after surgery is important for clinical decision making.

The LKB1 gene encodes a serine/threonine kinase that is mutated in the Peutz-Jeghers cancer syndrome. LKB1 is homologous to the Par-4 polarity genes in C. elegans and D. melanogaster. We have previously reported the identification and characterization of an LKB1-specific adaptor protein, STRAD, which activates LKB1 and translocates it from nucleus to cytoplasm. We have now constructed intestinal epithelial cell lines in which inducible STRAD activates LKB1. Upon LKB1 activation, single cells rapidly remodel their actin cytoskeleton to form an apical brush border. The junctional proteins ZO-1 and p120 redistribute in a dotted circle peripheral to the brush border, in the absence of cell-cell contacts. Apical and basolateral markers sort to their respective membrane domains. We conclude that LKB1 can induce complete polarity in intestinal epithelial cells. In contrast to current thinking on polarization of simple epithelia, these cells can fully polarize in the absence of junctional cell-cell contacts.

Importance

 The causal direction and magnitude of the association between telomere length and incidence of cancer and non-neoplastic diseases is uncertain owing to the susceptibility of observational studies to confounding and reverse causation. 

Objective

 To conduct a Mendelian randomization study, using germline genetic variants as instrumental variables, to appraise the causal relevance of telomere length for risk of cancer and non-neoplastic diseases. 

Data Sources

 Genomewide association studies (GWAS) published up to January 15, 2015. 

Study Selection

 GWAS of noncommunicable diseases that assayed germline genetic variation and did not select cohort or control participants on the basis of preexisting diseases. Of 163 GWAS of noncommunicable diseases identified, summary data from 103 were available. 

Data Extraction and Synthesis

 Summary association statistics for single nucleotide polymorphisms (SNPs) that are strongly associated with telomere length in the general population. 

Main Outcomes and Measures

 Odds ratios (ORs) and 95% confidence intervals (CIs) for disease per standard deviation (SD) higher telomere length due to germline genetic variation. 

Results

 Summary data were available for 35 cancers and 48 non-neoplastic diseases, corresponding to 420 081 cases (median cases, 2526 per disease) and 1 093 105 controls (median, 6789 per disease). Increased telomere length due to germline genetic variation was generally associated with increased risk for site-specific cancers. The strongest associations (ORs [95% CIs] per 1-SD change in genetically increased telomere length) were observed for glioma, 5.27 (3.15-8.81); serous low-malignant-potential ovarian cancer, 4.35 (2.39-7.94); lung adenocarcinoma, 3.19 (2.40-4.22); neuroblastoma, 2.98 (1.92-4.62); bladder cancer, 2.19 (1.32-3.66); melanoma, 1.87 (1.55-2.26); testicular cancer, 1.76 (1.02-3.04); kidney cancer, 1.55 (1.08-2.23); and endometrial cancer, 1.31 (1.07-1.61). Associations were stronger for rarer cancers and at tissue sites with lower rates of stem cell division. There was generally little evidence of association between genetically increased telomere length and risk of psychiatric, autoimmune, inflammatory, diabetic, and other non-neoplastic diseases, except for coronary heart disease (OR, 0.78 [95% CI, 0.67-0.90]), abdominal aortic aneurysm (OR, 0.63 [95% CI, 0.49-0.81]), celiac disease (OR, 0.42 [95% CI, 0.28-0.61]) and interstitial lung disease (OR, 0.09 [95% CI, 0.05-0.15]). 

Conclusions and Relevance

 It is likely that longer telomeres increase risk for several cancers but reduce risk for some non-neoplastic diseases, including cardiovascular diseases.

CHARGE syndrome is a non-random clustering of congenital anomalies including coloboma, heart defects, choanal atresia, retarded growth and development, genital hypoplasia, ear anomalies, and deafness. A consistent feature in CHARGE syndrome is semicircular canal hypoplasia resulting in vestibular areflexia. Other commonly associated congenital anomalies are facial nerve palsy, cleft lip/palate, and tracheo-oesophageal fistula. Specific behavioural problems, including autistic-like behaviour, have been described. The CHD7 gene on chromosome 8q12.1 was recently discovered as a major gene involved in the aetiology of this syndrome.The coding regions of CHD7 were screened for mutations in 107 index patients with clinical features suggestive of CHARGE syndrome. Clinical data of the mutation positive patients were sampled to study the phenotypic spectrum of mutations in the CHD7 gene.Mutations were identified in 69 patients. Here we describe the clinical features of 47 of these patients, including two sib pairs. Most mutations were unique and were scattered throughout the gene. All patients but one fulfilled the current diagnostic criteria for CHARGE syndrome. No genotype-phenotype correlations were apparent in this cohort, which is best demonstrated by the differences in clinical presentation in sib pairs with identical mutations. Somatic mosaicism was detected in the unaffected mother of a sib pair, supporting the existence of germline mosaicism.CHD7 mutations account for the majority of the cases with CHARGE syndrome, with a broad clinical variability and without an obvious genotype-phenotype correlation. In one case evidence for germline mosaicism was provided.

Article1 October 2003free access MO25α/β interact with STRADα/β enhancing their ability to bind, activate and localize LKB1 in the cytoplasm Jérôme Boudeau Corresponding Author Jérôme Boudeau MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Annette F. Baas Annette F. Baas Hubrecht Laboratory, Center for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author Maria Deak Maria Deak MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Nick A. Morrice Nick A. Morrice MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Agnieszka Kieloch Agnieszka Kieloch MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Mike Schutkowski Mike Schutkowski Jerini Array Technologies, Jerini AG, Invalidenstrasse 130, D-10115 Berlin, Germany Search for more papers by this author Alan R. Prescott Alan R. Prescott Division of Cell Biology and Immunology, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Hans C. Clevers Hans C. Clevers Hubrecht Laboratory, Center for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author Dario R. Alessi Dario R. Alessi MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Jérôme Boudeau Corresponding Author Jérôme Boudeau MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Annette F. Baas Annette F. Baas Hubrecht Laboratory, Center for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author Maria Deak Maria Deak MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Nick A. Morrice Nick A. Morrice MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Agnieszka Kieloch Agnieszka Kieloch MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Mike Schutkowski Mike Schutkowski Jerini Array Technologies, Jerini AG, Invalidenstrasse 130, D-10115 Berlin, Germany Search for more papers by this author Alan R. Prescott Alan R. Prescott Division of Cell Biology and Immunology, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Hans C. Clevers Hans C. Clevers Hubrecht Laboratory, Center for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author Dario R. Alessi Dario R. Alessi MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author Author Information Jérôme Boudeau 1, Annette F. Baas2, Maria Deak1, Nick A. Morrice1, Agnieszka Kieloch1, Mike Schutkowski3, Alan R. Prescott4, Hans C. Clevers2 and Dario R. Alessi1 1MRC Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK 2Hubrecht Laboratory, Center for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands 3Jerini Array Technologies, Jerini AG, Invalidenstrasse 130, D-10115 Berlin, Germany 4Division of Cell Biology and Immunology, School of Life Sciences, MSI/WTB Complex, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2003)22:5102-5114https://doi.org/10.1093/emboj/cdg490 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Mutations in the LKB1 protein kinase result in the inherited Peutz Jeghers cancer syndrome. LKB1 has been implicated in regulating cell proliferation and polarity although little is known about how this enzyme is regulated. We recently showed that LKB1 is activated through its interaction with STRADα, a catalytically deficient pseudokinase. Here we show that endogenous LKB1–STRADα complex is associated with a protein of unknown function, termed MO25α, through the interaction of MO25α with the last three residues of STRADα. MO25α and STRADα anchor LKB1 in the cytoplasm, excluding it from the nucleus. Moreover, MO25α enhances the formation of the LKB1–STRADα complex in vivo, stimulating the catalytic activity of LKB1 ∼10-fold. We demonstrate that the related STRADβ and MO25β isoforms are also able to stabilize LKB1 in an active complex and that it is possible to isolate complexes of LKB1 bound to STRAD and MO25 isoforms, in which the subunits are present in equimolar amounts. Our results indicate that MO25 may function as a scaffolding component of the LKB1–STRAD complex and plays a crucial role in regulating LKB1 activity and cellular localization. Introduction LKB1 is a serine/threonine protein kinase not closely related to other protein kinases (reviewed in Yoo et al., 2002; Boudeau et al., 2003c). Mutations in LKB1 have been linked to Peutz Jeghers cancer syndrome (PJS), an autosomal dominant inherited disorder (Hemminki et al., 1998; Jenne et al., 1998) characterized in those affected by the development of multiple gastro-intestinal hamartomatous polyps as well as a wide spectrum of benign and malignant tumours (Hemminki, 1999). Deletion of both alleles of the LKB1 gene in mice results in embryonic lethality at midgestation (Ylikorkala et al., 2001), but importantly LKB1 heterozygous mice develop a PJS-like disease characterized by gastro-intestinal hamartomas, and later on in life these animals also develop malignant tumours, such as hepatocellular carcinoma (Bardeesy et al., 2002; Jishage et al., 2002; Miyoshi et al., 2002; Nakau et al., 2002; Rossi et al., 2002). Overexpression of LKB1 in certain cancer cells results in growth suppression due to a G1 cell cycle arrest which is dependent on LKB1 catalytic activity (Tiainen et al., 1999), and this has been proposed to be mediated through activation of p21WAF1/CIP1 through a p53-dependent mechanism (Tiainen et al., 2002). Taken together, these findings indicate that LKB1 functions as a tumour suppressor. Recent work has indicated that both the Caenorhabditis elegans (Watts et al., 2000) and the Drosophila (Martin and St Johnston, 2003) homologues of LKB1 regulate cell polarity and, if this function is conserved in humans, loss of cell polarity in PJS patients could account for the development of hamartomas. Although LKB1 is essentially nuclear when overexpressed in cells, a low level of cytosolic localization is also frequently observed (Smith et al., 1999; Tiainen et al., 1999; Karuman et al., 2001). Significantly, mutants of LKB1 that are excluded from the nucleus retain full growth suppression activity, suggesting that the cytoplasmic localization of this enzyme is important for its tumour suppressor function (Tiainen et al., 2002). Several mutant forms of LKB1 found in PJS patients localize only in the nucleus and are not detectable in the cytoplasm (Tiainen et al., 2002; Boudeau et al., 2003b), further suggesting that cytoplasmic localization of LKB1 is important. Relatively little is known about how LKB1 is regulated and how it functions. Recently, we have shown that LKB1 is associated with a STE20-related pseudokinase termed STRADα, which lacks catalytic activity because key residues required for the function of nearly all protein kinases are missing (Baas et al., 2003). Moreover, LKB1 binds STRADα through its catalytic domain and this interaction enhances LKB1 in vivo activity as well as promoting LKB1 cytoplasmic localization (Baas et al., 2003). LKB1 is no longer able to suppress cell growth in cells in which STRADα has been depleted using an siRNA approach, suggesting that the binding of LKB1 to STRADα plays an important role in mediating its tumour suppressor function. In this study, we identify MO25α as a novel component of the LKB1–STRADα complex and establish that MO25α plays an important role in stabilizing this complex in the cell cytoplasm as well as enhancing LKB1 catalytic activity. Our data indicate that MO25 may function as a scaffolding component of the LKB1–STRADα complex. Results Identification of MO25α in an LKB1 complex In order to identify proteins associated with LKB1, we have utilized previously described HeLa cells stably expressing low levels of either the wild type or catalytically inactive LKB1 with an N-terminal Flag epitope tag to enable facile immunopurification of LKB1-associated proteins employing the Flag antibody (Boudeau et al., 2003a). Flag-LKB1 was immunopurified from one hundred 10 cm dishes of HeLa cell lysate derived from the cells expressing wild-type LKB1 or kinase-dead LKB1, or from the control parental HeLa cell line that does not express LKB1. The preparations were subjected to electrophoresis on a polyacrylamide gel, which was stained with colloidal Coomassie Blue (Figure 1A). A sample of the kinase-dead LKB1 preparation was also concentrated further to enable better visualization of lower abundance proteins. Several bands were observed which were present in both the wild-type and kinase-dead LKB1 preparations, but were absent in the control sample (Figure 1A). The identity of the colloidal Coomassie Blue-stained bands labelled in Figure 1A was established by tryptic peptide mass-spectral fingerprinting procedures (Figure 1B), and confirmed by immunoblotting with appropriate antibodies (Figure 1C). Proteins previously established to be associated with LKB1, including the Hsp90 and Cdc37 chaperone proteins (Boudeau et al., 2003a) and STRADα (Baas et al., 2003) were detected. In addition, a protein of ∼40 kDa identified as MO25α, co-immunopurified with both wild-type and kinase-dead LKB1 and was not present in the control purification (Figure 1A and C). Figure 1.Association of MO25α with LKB1. (A) Cell lysates derived from control parental HeLa cells or HeLa cells stably expressing N-terminal Flag epitope-tagged wild-type (WT) or kinase-dead (KD) LKB1 were passed through an anti-Flag M2–affinity agarose column, LKB1 eluted with the Flag peptide and the samples concentrated as described in Materials and methods. The samples were electrophoresed on a polyacrylamide gel and the protein bands visualized following colloidal Coomassie Blue staining. Protein bands unique to the wild-type and kinase-dead LKB1 preparations are indicated. (B) The colloidal Coomassie Blue-stained bands labelled as indicated in (A) were excised from the gel, the proteins digested in gel with trypsin, and their identities were determined by tryptic peptide mass-spectral fingerprint. The identity of STRADα and MO25α were confirmed by LC–MS/MS sequence analysis on a Q-TOF2 mass spectrometer. The number of tryptic peptides, percentage of sequence coverage and NCBI gi accession numbers for each protein identified are indicated. (C) The samples purified in (A) were immunoblotted with the indicated antibodies. Identical results were obtained following two independent purifications of LKB1 from HeLa cells. Download figure Download PowerPoint MO25α was first identified as a gene expressed at the early cleavage stage of mouse embryogenesis (Miyamoto et al., 1993) and was shown to be a highly evolutionarily conserved protein (Nozaki et al., 1996; Karos and Fischer, 1999) for which no cellular function has been ascribed. From analysis of databases, we have identified a closely related isoform of MO25α, which we termed MO25β, and a sequence alignment of both MO25 isoforms together with their putative homologues in Drosophila and C.elegans is shown in Figure 2A. Northern blot analysis indicated that MO25α is widely expressed in human tissues, with the highest levels of expression in skeletal muscle (Figure 2B). Immunoblot analysis using an antibody raised against the MO25α protein, which does not crossreact with MO25β (Figure 2C and D), and analysis of EST databases (see the Supplementary table available at The EMBO Journal Online) confirmed that MO25α is expressed in many tissues and cell lines. Although we were unable to detect significant levels of MO25β RNA by northern blot analysis, immunoblotting using an antibody raised against the MO25β protein, which does not crossreact with MO25α, suggested that MO25β is also expressed in a variety of tissues and cell lines tested (Figure 2C and D). We found that MO25β is not expressed in the liver (Figure 2C) or a number of cell lines including HeLa cells (Figure 2D), indicating that expression of MO25β may be more restricted than MO25α and explaining why MO25β was not co-purified with Flag-LKB1 in HeLa cells (Figure 1). Figure 2.Amino acid sequence and tissue distribution patterns of MO25α and MO25β isoforms. (A) Amino acid sequence alignment of the human MO25α (NCBI accession No. NP_057373) and MO25β (NCBI accession No. CAC37735) isoforms as well as C.elegans MO25α (NCBI accession No. CAB16486) and MO25β (NCBI accession No. NP_508691) and Drosophila MO25 (NCBI accession No. P91891) putative homologues. Conserved residues are boxed in black, and homologous residues are shaded in grey. Sequence alignments were performed using the CLUSTALW and BOXSHADE programmes at http://www.ch.embnet.org/ using standard parameters. (B) A 32P-labelled fragment of the MO25α cDNA was used to probe a northern blot containing polyadenylated RNA isolated from the indicated human tissues. The membrane was autoradiographed, and the MO25α probe was observed to hybridize to a 4.2-kb message, identical to the size predicted for the MO25α message from database analysis. As a loading control, the northern blot was hybridized with a β-actin probe. (C and D) The indicated mouse tissue (C) or cell (D) extracts containing 20 μg of total cell protein were immunoblotted with anti-MO25α and anti-MO25β antibodies. Download figure Download PowerPoint Endogenous MO25α is present in complex with endogenous LKB1 We next immunoprecipitated endogenous LKB1 from 293 cells (Figure 3A, left panel) or Rat-2 cells (Figure 3A, right panel), and immunoblotted the precipitates for LKB1, STRADα and MO25α. The experiments showed that MO25α, as well as STRADα, were co-immunoprecipitated with LKB1, but not with pre-immune IgG. We also immunoprecipitated endogenous MO25α from 293 cells (Figure 3B, left panel) or Rat-2 cells (Figure 3B, right panel), and immunoblotted for the presence of LKB1, STRADα and MO25α (Figure 3B). Endogenous LKB1 and STRADα were co-immunoprecipitated with MO25α, but not with pre-immune IgG, consistent with the notion that these proteins form a complex. Figure 3.Endogenous LKB1 is associated with MO25α. (A) LKB1 was immunoprecipitated from 2 mg of the indicated lysates using 10 μg of anti-LKB1 antibody covalently coupled to protein G–Sepharose, and the immunoprecipitates were immunoblotted with the indicated antibodies. As a control, immunoprecipitations were also performed in parallel experiments with pre-immune IgG antibodies covalently coupled to protein G–Sepharose. In each gel, 20 μg of total cell lysate was also immunoblotted in parallel. (B) MO25α was immunoprecipitated as above except that 15 μg of the MO25α antibody was employed. The results shown are from a single experiment that was repeated three times with similar results. Download figure Download PowerPoint MO25 interacts with STRAD rather than with LKB1 To verify which component of the LKB1–STRAD complex MO25α interacted with, we co-transfected 293 cells with constructs expressing MO25α and either N-terminal glutathione S-transferase (GST)-tagged LKB1, STRADα or the closely related STRADβ pseudokinase, as well as Cdc37, a chaperone previously shown to bind LKB1 (Boudeau et al., 2003a). A sequence alignment of STRADα and STRADβ is shown in Supplementary figure 1 and both lack the same key conserved residues required for catalysis, in subdomains VI and VII of the kinase domain. The GST-tagged proteins were affinity purified and immunoblotted for MO25α (Figure 4A). Under the rigorous conditions employed to avoid detection of weak or non-specific interactions, we found that MO25α interacts only with STRADα and STRADβ but not with LKB1 or Cdc37. Figure 4.MO25α is associated with LKB1 through STRAD. (A) 293 cells were transfected with plasmids encoding for the expression of the indicated GST fusion proteins together with Myc-MO25α. Thirty-six hours post-transfection, the GST-tagged proteins were affinity purified from the cell lysates using glutathione–Sepharose as described in Materials and methods. Similar amounts of the purified GST fusion proteins were subjected to SDS–PAGE and immunoblotted with anti-Myc antibody to detect co-purified Myc-MO25α, or with anti-GST antibody to ensure that comparable amounts of the GST-tagged proteins were present in each lane (upper and middle panels). Total cell lysates (5 μg) prior to affinity purification were also subjected to immunoblotting with anti-Myc antibody to ensure that Myc-MO25α was expressed at similar levels in each co-transfection (lower panel). (B) N-terminal GST-tagged LKB1 was expressed in 293 cells in the presence or absence of Flag-STRADα and purified as above. The purified proteins were subjected to SDS–PAGE and visualized by colloidal Coomassie Blue staining (upper panel). The faint protein band indicated, corresponding to an endogenous protein of 40-kDa (marked *), was identified by tryptic peptide mass-spectral fingerprint as endogenously expressed MO25α (with 38% sequence coverage). The purified proteins were also immunoblotted with the indicated antibodies (lower panels). (C) As above except that GST–LKB1 was expressed in 293 cells together with the indicated isoforms of Flag-STRAD and Myc-MO25 and the proteins visualized by colloidal Coomassie Blue staining were also immunoblotted with the indicated antibodies. For all panels, similar results were obtained in at least three separate experiments. Download figure Download PowerPoint We next expressed LKB1 in 293 cells in the presence or absence of STRADα, and the protein composition of the affinity purified LKB1 was analysed following electrophoresis and staining with colloidal Coomassie Blue. As expected, STRADα was co-purified with LKB1 (Figure 4B). In addition, a faintly staining band corresponding to an endogenous protein of ∼40 kDa was observed in the LKB1–STRADα complex, which was not present in the uncomplexed LKB1 preparation. Tryptic peptide mass-spectral fingerprinting revealed that this protein corresponded to endogenous MO25α. This was confirmed by immunoblotting with an anti-MO25α antibody (Figure 4B), further suggesting that MO25α is associated with LKB1 through STRADα. We consistently observed that higher levels of GST–LKB1 were expressed in the presence of STRADα, indicating that binding of STRADα to LKB1 may stabilize the latter. In Figure 4C, we demonstrate by performing appropriate co-transfections, that it is possible to purify a heterotrimeric LKB1 complex in which LKB1, STRADα and MO25α are present in similar equimolar proportions. We also demonstrate that it is possible to form complexes of LKB1–STRADα–MO25β, LKB1–STRADβ–MO25α and LKB1–STRADβ–MO25β (Figure 4C), indicating that both isoforms of STRAD and MO25 are able to bind each other, as well as LKB1. LKB1 was previously found to be phosphorylated at Ser431 by PKA and p90RSK kinases and is also farnesylated at Cys433 (Collins et al., 2000; Sapkota et al., 2001). To investigate whether these modifications affect the assembly of the LKB1–STRAD–MO25 complex, mutants of LKB1 in which Ser431 was changed to Ala or Asp, or Cys433 to Ala, were co-expressed with STRADα and MO25α. LKB1 was affinity purified and immunoblotting analysis revealed that the LKB1 mutants interacted with STRADα and MO25α similarly to wild-type LKB1 (Supplementary figure 2A). We also stimulated 293 cells with forskolin (to activate PKA) and 12-O-tetradeconylphorbol-13-acetate (to activate p90RSK) and immunoprecipitated endogenously expressed LKB1. Immunoblotting analysis of the immunoprecipitates revealed that these treatments induced phosphorylation of LKB1 at Ser431, but did not affect its association with STRADα and MO25α (Supplementary figure 2B). Consistent with (see next section) this green fluorescent protein (GFP)–LKB1[S431A] and GFP–LKB1[S431D] were localized in the cytoplasm when co-expressed with STRADα and MO25α (data not shown). This indicates that phosphorylation of Ser431 or prenylation of Cys433 do not regulate formation of the LKB1 complex. MO25α cooperates with STRADα to localize LKB1 in the cytoplasm The cytoplasmic fraction of LKB1 was recently shown to conduct a G1 cell cycle arrest (Tiainen et al., 2002). Therefore, we were interested in studying how the formation of a complex of LKB1, STRADα and MO25α affected the localization of these proteins. HeLa cells were transfected with combinations of tagged MO25α, STRADα and LKB1 and these proteins were visualized in cells by confocal fluorescence microscopy in which the MO25α, STRADα and LKB1 proteins could be detected independently in the same cell. MO25α (Figure 5A) and STRADα (Figure 5E) expressed on their own were localized throughout the cytoplasm and nucleus. Strikingly however, when MO25α and STRADα were co-expressed, both proteins were re-localized to the cytoplasm and were excluded from the nucleus (Figure 5G and H). LKB1 expressed alone was mainly nuclear (Figure 5L) and consistent with MO25 not binding to LKB1, co-expression of LKB1 with MO25 did not affect LKB1 nuclear localization (Figure 5M and O). As reported previously in COS cells, co-expression of LKB1 with STRADα promoted significant cytoplasmic localization of LKB1, however significant levels of LKB1 remained in the nucleus under these conditions (Figure 5R) (Baas et al., 2003). In the presence of both MO25α and STRADα, however, LKB1 was essentially only localized in the cytoplasm and virtually excluded from the nucleus (Figure 5U). These observations indicate that MO25α and STRADα form a complex that anchors LKB1 in the cytoplasm more effectively than STRADα alone. Figure 5.MO25α and STRADα anchor LKB1 in the cytoplasm. HeLa cells were transfected with the indicated constructs encoding for the expression of Myc-MO25α, Flag-STRADα and GFP–LKB1. Twenty-four hours post-transfection the cells were fixed in 4% (by vol) paraformaldehyde and immunostained with anti-MO25α antibody to detect MO25α (TR anti-sheep secondary antibody, red channel) and anti-Flag to detect STRADα (Cy5 anti-mouse secondary antibody, blue channel). GFP–LKB1 localization was visualized directly through the GFP fluorescence (green channel). The cells were imaged using a Zeiss LSM 510 META confocal microscope. The cells shown are representative images obtained in three separate experiments. The scale bars correspond to 10 μm. Download figure Download PowerPoint A mutant form of LKB1 termed SL26-LKB1 isolated from a Peutz Jeghers syndrome patient which retains normal ability to autophosphorylate, indicating that it is not catalytically deficient, in which three residues are mutated in the C-terminal region of the kinase domain (Hemminki et al., 1998), was found not to interact with STRADα (Baas et al., 2003). Consistent with this observation, the nuclear localization of SL26-LKB1 was not affected by co-expression with MO25α and STRADα (Supplementary figure 3). We also demonstrate that a catalytically inactive LKB1[D194A] mutant is anchored in the cytoplasm in the presence of MO25α and STRADα, indicating that catalytic activity of LKB1 is not essential for association with STRADα/MO25α and cytoplasmic localization (Supplementary figure 3). These findings are confirmed in Supplementary figure 4 where we demonstrate using a cell co-expression binding assay that SL26-LKB1 fails to interact with STRADα and MO25α, whereas catalytically inactive LKB1[D194A] efficiently binds these molecules. MO25α recognizes the last three residues of STRADα To define the binding site of MO25α on STRADα, a series of deletion mutations of STRADα were tested for their ability to interact with MO25α in a co-transfection binding assay. Strikingly, deletion of only the last three amino acids of STRADα (Trp-Glu-Phe) abolished binding of MO25α to STRADα. Moreover, mutation of the C-terminal Trp residue to Phe also vastly reduced binding of MO25α to STRADα (Figure 6A). We then tested whether it was possible to affinity purify endogenously expressed MO25α from three different mammalian cell lysates employing biotinylated peptides encompassing the C-terminal residues of STRADα conjugated to streptavidin–Sepharose. We found that a peptide encompassing the C-terminal 12 residues (Figure 6B) but not the last six residues (data not shown and Figure 6C) of STRADα efficiently purified endogenous MO25α from all cell lysates tested (Figure 6B). To further delineate the MO25α binding site on the STRADα peptide, we performed an alanine scan, mutating each residue of the peptide individually to Ala and verifying how this affected binding to MO25α (Figure 6B). Consistent with the Trp-Glu-Phe residues being required for MO25α recognition, mutation of any of these three residues in the C-terminal STRADα peptide abolished or vastly reduced MO25α binding in three different cell lysates, whereas mutation of the other residues either did not affect binding or only had a moderate effect. These findings were also confirmed in a more quantitative surface plasmon resonance BiaCore binding assay (Figure 6C). Figure 6.MO25α recognizes the C-terminal three residues of STRADα. (A) N-terminal GST-tagged wild-type STRADα or the indicated mutants of STRADα were expressed in 293 cells together with Myc-MO25α, and 36 h post-transfection the STRADα proteins were affinity purified from the cell lysates using glutathione–Sepharose. Similar amounts of the purified proteins were subjected to SDS–PAGE and immunoblotting with anti-Myc antibody to detect co-purified Myc-MO25α, or with anti-GST antibody to ensure that comparable amounts of the GST-tagged proteins were present in each lane (upper and middle panels). Five micrograms of the total cell lysates prior to affinity purification were also subjected to immunoblotting with anti-Myc antibody to ensure that Myc-MO25α was expressed at similar levels in each condition (lower panel). (B) The indicated cell lysates (0.5 mg) were incubated with 5 μg of an N-terminal biotinylated peptide encompassing either the C-terminal 12 residues of STRADα conjugated to streptavidin–Sepharose (NLEELEVDDWEF, termed STRADα-C12) or mutants of this peptide in which the indicated residues were individually mutated to Ala. Following isolation and washing of the beads, the samples were subjected to SDS–PAGE and immunoblotted with an anti-MO25α antibody. (C) Binding of bacterially expressed MO25α to the indicated peptides was analysed by surface plasmon resonance BiaCore analysis as described in Materials and methods. Binding was analysed over a range of MO25α concentrations (6.25–3200 nM) and the response level at the steady-state binding was plotted versus the log of the MO25α concentration. The estimated Kd for the STRADα-C12 peptide was obtained by fitting the data to the formula [m1 X m0/(m0 + m2)] using Kaleidagraph software and the Kd was calculated to be 850 nM. WEF-C12 corresponds to NLEELEVDDWEF, WEA-C12 corresponds to NLEELEVDDWEA, AEF-C12 corresponds to NLEELEVDDAEF, WAF-C12 corresponds to NLEELEVDDWAF, WEF-C6 corresponds to VDDWEF. Download figure Download PowerPoint Binding of LKB1 to STRADα creates novel binding site(s) for MO25α We next investigated how binding of LKB1 to STRADα affected the interaction with MO25α using a co-expression binding assay in 293 cells in which full-length wild type and deletion mutants of GST–STRADα were co-expressed in the presence or absence of MO25α and LKB1. Consistent with previous findings, STRADα mutants that lack either the C-terminal 12 or 48 residues did not bind MO25α in the absence of LKB1 (Figure 7, panel 1). Strikingly though, when these STRADα mutants were co-expressed with LKB1, MO25α was recovered in the purified complexes (Figure 7), indicating that the binding of LKB1 to STRADα generates additional binding site(s) for MO25α within the LKB1–STRADα complex. We also consistently noticed that the amount of LKB1 recovered in the GST–STRADα pull downs was significantly higher in the presence of MO25α (Figure 7, compare panels 2 and 3), suggesting that MO25α might stabilize the formation of a heterotrimeric LKB1 complex. Moreover, a catalytic fragment of LKB1 encompassing only the kinase domain (residues 44–343) interacted much more efficiently with STRADα in the presence of MO25α (Figure 7, compare panels 4 and 5). These observations indicate that MO25α could be stabilizing the LKB1–STRADα complex by generating additi

Article16 June 2003free access Activation of the tumour suppressor kinase LKB1 by the STE20-like pseudokinase STRAD A.F. Baas A.F. Baas Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author J. Boudeau J. Boudeau Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author G.P. Sapkota G.P. Sapkota Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author L. Smit L. Smit Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author R. Medema R. Medema Division of Molecular Biology, Netherlands Cancer Institute, 1066 CX, Amsterdam, The Netherlands Search for more papers by this author N.A. Morrice N.A. Morrice Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author D.R. Alessi D.R. Alessi Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author H.C. Clevers Corresponding Author H.C. Clevers Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author A.F. Baas A.F. Baas Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author J. Boudeau J. Boudeau Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author G.P. Sapkota G.P. Sapkota Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author L. Smit L. Smit Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author R. Medema R. Medema Division of Molecular Biology, Netherlands Cancer Institute, 1066 CX, Amsterdam, The Netherlands Search for more papers by this author N.A. Morrice N.A. Morrice Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author D.R. Alessi D.R. Alessi Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK Search for more papers by this author H.C. Clevers Corresponding Author H.C. Clevers Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands Search for more papers by this author Author Information A.F. Baas1, J. Boudeau2, G.P. Sapkota2, L. Smit1, R. Medema3, N.A. Morrice2, D.R. Alessi2 and H.C. Clevers 1 1Hubrecht Laboratory, Centre for Biomedical Genetics, Uppsalalaan 8, 3584 CT, Utrecht, The Netherlands 2Medical Research Council Protein Phosphorylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, Dow Street, Dundee, DD1 5EH UK 3Division of Molecular Biology, Netherlands Cancer Institute, 1066 CX, Amsterdam, The Netherlands *Corresponding author. E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2003)22:3062-3072https://doi.org/10.1093/emboj/cdg292 PDFDownload PDF of article text and main figures. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The LKB1 gene encodes a serine/threonine kinase mutated in Peutz–Jeghers cancer syndrome. Despite several proposed models for LKB1 function in development and in tumour suppression, the detailed molecular action of LKB1 remains undefined. Here, we report the identification and characterization of an LKB1-specific adaptor protein and substrate, STRAD (STe20 Related ADaptor). STRAD consists of a STE20- like kinase domain, but lacks several residues that are indispensable for intrinsic catalytic activity. Endogenous LKB1 and STRAD form a complex in which STRAD activates LKB1, resulting in phosphorylation of both partners. STRAD determines the subcellular localization of wild-type, but not mutant LKB1, translocating it from nucleus to cytoplasm. One LKB1 mutation previously identified in a Peutz–Jeghers family that does not compromise its kinase activity is shown here to interfere with LKB1 binding to STRAD, and hence with STRAD-dependent regulation. Removal of endogenous STRAD by siRNA abrogates the LKB1-induced G1 arrest. Our results imply that STRAD plays a key role in regulating the tumour suppressor activities of LKB1. Introduction The tumour suppressor protein LKB1 is a serine/threonine kinase that has been causally linked to Peutz–Jeghers syndrome (PJS) (Hemminki et al., 1998; Jenne et al., 1998). Inactivating mutations in the LKB1 gene are found in ∼80% of PJS patients. Such patients are clinically characterized by mucocutaneous pigmentation, the development of hamartomas in the gastrointestinal tract and a predisposition to rare types of cancer (Peutz, 1921; Jeghers et al., 1949; Giardiello et al., 2000). Lkb1+/− mice develop gastrointestinal polyps and hepatocellular carcinomas, confirming its role as a tumour suppressor (Bardeesy et al., 2002; Jishage et al., 2002; Miyoshi et al., 2002; Nakau et al., 2002; Rossi et al., 2002). LKB1 also plays an essential role in development, since Lkb1−/− mice die at embryonic day 9 due to a variety of developmental abnormalities, affecting the yolk sac and placenta (Ylikorkala et al., 2001; Jishage et al., 2002). Genetic studies in Caenorhabditis elegans and Drosophila have indicated an essential function of LKB1 homologues in establishing cell polarity (Watts et al., 2000; Martin and St Johnston, 2003). This may suggest a model in which LKB1 loss causes hamartoma formation through disruption of epithelial polarity. Forced expression of LKB1 in cells lacking this enzyme induces a G1 cell cycle arrest (Tiainen et al., 1999). Phosphorylation of LKB1 by cyclic AMP-dependent kinase or by p90 ribosomal S6 kinase may be required for this growth arrest (Collins et al., 2000; Sapkota et al., 2001), as is the chromatin modifier BRG-1 (Marignani et al., 2001). The subcellular localization of LKB1 seems to be crucial for its role in mediating G1 cell cycle arrest. This was demonstrated by a study with an LKB1 mutant lacking the nuclear localization signal (Tiainen et al., 2002). This solely cytoplasmic LKB1 protein was still able to induce growth arrest, suggesting that this portion of LKB1 is responsible for its growth regulating activities. Recently, LKB1-interacting protein 1 (LIP1) was identified and shown to translocate LKB1 from the nucleus to the cytoplasm upon forced expression of both proteins (Smith et al., 2001). Due to an observed interaction between LIP1 and SMAD4, LIP1 may link LKB1 to the transforming growth factor β pathway. LKB1 has also been suggested to play a central role in p53-mediated apoptosis (Karuman et al., 2001). Despite several proposed models for LKB1 function, the molecular activities of LKB1 in development and in preventing cellular transformation remain poorly understood. This is mainly due to the fact that LKB1 exhibits weak catalytic activity and that no in vivo LKB1 substrates have been identified to date. In the present study, we identified a novel STE20-related kinase, which we termed STRAD (for STE20 Related ADaptor), as an LKB1-specific adaptor and substrate. Members of the STE20-like kinase family are implicated in the stimulation of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways, by direct activation of MAPKKK. It has been suggested that this activity of STE20-like kinases is independent of their catalytic capacities (Dan et al., 2001). Interestingly, in contrast to previously described STE20-like kinases, STRAD encodes a pseudokinase due to the lack of several residues that are indispensable for intrinsic catalytic activity. We provide compelling evidence that STRAD acts as an upstream activator of the LKB1 kinase. Moreover, we show that STRAD is the first LKB1 substrate in vivo, and that STRAD directs the subcellular localization of LKB1 by anchoring it in the cytoplasm. Results STRAD is a pseudokinase which specifically binds to LKB1 To gain more insight into the activities of LKB1, we performed a yeast two-hybrid screen to identify potential binding partners. We screened a fetal brain library using kinase-dead (KD) LKB1 (D176Y) as bait, and identified a single clone that interacted specifically with LKB1 and not with control baits. This clone encoded a protein consisting almost entirely of a kinase-like domain with strong homology to STE20-like kinases. We named this protein, which was previously submitted as NY-BR-96 (DDBJ/EMBL/GenBank accession No. AF308302), STRAD. STRAD most closely resembles the recently described STE20 homologues SPAK (Johnston et al., 2000) and ILPIP (Sanna et al., 2002) or PAP kinase (Nishigaki et al., 2003). Sequence analysis revealed that STRAD lacked several residues that are indispensable for intrinsic kinase activity compared with SPAK (Figure 1A) (Huse and Kuriyan, 2002). Specifically, the DFG motif of the potential magnesium interacting site of the ATP-binding cleft was absent. Furthermore, the essential aspartic acid residue, crucial for mediating proton transfer in the catalytic site, was replaced by serine. This replacement was found to be conserved in mouse and fly orthologues of STRAD (data not shown). The STRAD gene localizes to human chromosome 17, and its 13 exons produce a 2.1 kb cDNA, encoding a putative protein of ∼50 kDa. Figure 1.(A) Deduced amino acid sequence of human STRAD aligned with SPAK. Identical residues are represented in black and similar residues in grey. The subdomains of the pseudokinase domain are indicated with Roman numerals. The serine replacement of the essential aspartic acid residue in the catalytic site and the absence of the DFG motif in STRAD compared with SPAK are designated with closed arrows. The STRAD phosphorylation sites Thr329 and Thr419 are designated with open arrows. (B) STRAD does not phosphorylate the exogenous substrates myelin basic protein (MBP), histone 2A, histone 2B and CRE binding protein (CREB). Exogenous proteins (10 μg) were subjected to an in vitro kinase (IVK) assay with either 1 U of cAMP-dependent kinase (PKA) or 1 μg of GST–STRAD. Proteins were separated by SDS–PAGE and immunoblotted (WB) with α-GST or visualized by autoradiography. Download figure Download PowerPoint We generated an expression vector which produces a glutathione S-transferase (GST)-tagged STRAD fusion protein. GST–STRAD was isolated from HEK-293T cells and subjected to several in vitro kinase assays in the presence of [γ-32P]ATP. As predicted from the sequence analysis, GST–STRAD was not able to autophosphorylate (data not shown) nor to phosphorylate histone 2A, histone 2B, myelin basic protein (MBP) and CRE binding protein (CREB). These exogenous substrates were readily phosphorylated by cAMP-dependent kinase (PKA) (Figure 1B). We therefore tentatively concluded that STRAD is a pseudokinase. To establish whether endogenous LKB1 and STRAD interact, we generated a monoclonal antibody against STRAD. This anti-STRAD antibody recognized two specific bands on immunoblots at 45–48 kDa (Figure 2A). A direct interaction could be readily visualized in Rat-2 and HEK-293T cells, as determined by endogenous STRAD being co-immunoprecipitated with endogenous LKB1 (Figure 2A). HeLa cells, which do not express LKB1, were included as a negative control. A GST–LKB1 fusion protein, transfected into HEK-293T cells, associated with endogenous STRAD (Figure 2B). Unrelated GST fusion proteins, including several kinases, did not bind to STRAD, confirming the specificity of the interaction between LKB1 and STRAD. Deletion of either N- or C-terminal amino acids from the LKB1 kinase domain abolished STRAD binding completely (data not shown). Because GST–LKB1[1–319] and GST–LKB1[44–319] failed to bind strongly to STRAD, whereas GST–LKB1[1–343] and GST–LKB1[44–343] did bind (Figure 2C), we concluded that the entire kinase domain as well as the C-terminal amino acids 319–343 of LKB1 were necessary for binding STRAD. Figure 2.(A) Endogenous LKB1 (55 kDa) interacts with STRAD (45–48 kDa) in Rat-2 and HEK-293T cells. Co-immunoprecipitations (IP) were performed on 1 mg of indicated cell lysates with either α-LKB1 polyclonal antibody (sheep) or an irrelevant sheep polyclonal antibody. Protein complexes (right panel) and 20 μg of total lysates (left panel) were immunoblotted (WB) with α-LKB1 or α-STRAD. (B) STRAD specifically interacts with LKB1. GST–LKB1 and several unrelated GST fusion proteins were isolated from HEK-293T cells using GST-affinity chromatography. Protein complexes were immunoblotted (WB) with α-GST or α-STRAD. (C) Amino acids 319–343 of LKB1 are necessary for STRAD binding. Indicated GST–LKB1 deletion constructs were isolated from HEK-293T using GST-affinity chromatography. Protein complexes were immunoblotted (WB) with α-GST or α-STRAD. Download figure Download PowerPoint LKB1 phosphorylates STRAD in vitro and in vivo After confirming the LKB1–STRAD interaction in mammalian cells, we were interested in the molecular consequences of STRAD binding to LKB1. For this purpose, we used myc-tagged LKB1-WT (wild type) and LKB1-KD (kinase dead; D176Y) constructs, and a myc-tagged LKB1 mutant found in a PJS family: SL26. The SL26 mutation consists of a small in-frame deletion of 9 bp at the C-terminus of the kinase domain (Hemminki et al., 1998), and is the only LKB1 mutant found in PJS patients that retains its intrinsic kinase activity (Nezu et al., 1999). Flag-tagged STRAD and myc-tagged LKB1 could be co-immunoprecipitated following co-transfection of HEK-293T cells (Figure 3A). Remarkably, when the isolated complexes were analysed in an in vitro kinase assay in the presence of [γ-32P]ATP, STRAD became phosphorylated and LKB1 autophosphorylation was strongly enhanced (Figure 3A and B). Moreover, by means of metabolic phosphate labelling of the transfected cells, we found that these processes also occurred in vivo (Figure 3A, bottom panel). The phosphorylation events were dependent on the kinase activity of LKB1, since no phosphorylation was observed with LKB1-KD (Figure 3A, last two lanes). Figure 3.LKB1 phosphorylates STRAD directly in vitro and in vivo. (A) LKB1-WT (wild type), but not LKB1-KD (kinase dead; D176Y), mediates phosphorylation of STRAD and shows enhanced autophosphorylation upon forced STRAD expression. Myc-tagged LKB1-WT, LKB1-KD and flag-STRAD were transfected into HEK-293T cells as indicated. Protein complexes were co-immunoprecipitated (IP) using either myc-Ab (M) or flag-Ab (F), and immunoblotted (WB) with α-myc or α-STRAD. In addition, the protein complexes were subjected to an in vitro kinase (IVK) assay. Cells transfected with the indicated constructs were metabolically labelled with [32P]phosphate for 3 h prior to lysing and co-immunoprecipitation. Protein complexes were separated by SDS–PAGE and visualized by autoradiography. (B) The LKB1-SL26 mutant does not bind to STRAD, which prevents STRAD phosphorylation and STRAD-mediated enhanced autophosphorylation of LKB1. Myc-tagged LKB1-WT, LKB1-SL26 and flag-STRAD were transfected into HEK-293T cells as indicated. Protein complexes were co-immunoprecipitated (IP) using either myc-Ab (M) or flag-Ab (F). Subsequently, they were immunoblotted (WB) with α-myc or α-STRAD. In addition, the protein complexes were subjected to an in vitro kinase assay (IVK), separated by SDS–PAGE and visualized by autoradiography. (C) LKB1–STRAD interaction is required for STRAD phosphorylation by LKB1. Anti-myc immunoprecipitated LKB1-WT, LKB1-KD and LKB1-SL26 were subjected to an in vitro kinase assay (IVK) alone, or after mixing with α-flag immunoprecipitated STRAD. Protein complexes were immunoblotted (WB) with α-myc or α-STRAD, and visualized by autoradiography. (D) LKB1 phosphorylates STRAD directly. Bacterially produced GST–LKB1-WT, GST–LKB1-KD and flag-STRAD were subjected to an in vitro kinase assay as indicated. Proteins were separated by SDS–PAGE, and immunoblotted (WB) with α-GST or α-flag. Phosphorylated proteins were visualized by autoradiography. Download figure Download PowerPoint We confirmed that LKB1-SL26 retains its kinase activity, as demonstrated by its ability to autophosphorylate in vitro (Figure 3C, upper panel, overexposure). However, the 9 bp deletion abolished the interaction with STRAD (Figure 3B, last two lanes). As predicted, this prevented LKB1-SL26 from phosphorylating STRAD and from increasing its autophosphorylation (Figure 3B, bottom panel). We postulate that LKB1-SL26 is a loss-of-function mutant causing PJS due to its inability to interact with STRAD. To investigate whether the interaction of LKB1 and STRAD is necessary for STRAD phosphorylation by LKB1, we mixed immunoprecipitated LKB1-WT, -KD or -SL26 with immunoprecipitated STRAD (Figure 3C). While LKB1-WT was still able to phosphorylate STRAD under these conditions, LKB1-KD and LKB1-SL26 were not. This means that both LKB1 kinase activity and LKB1 ability to bind to STRAD were required for LKB1-mediated STRAD phosphorylation. In order to prove that STRAD is directly phosphorylated by LKB1, and not by putative kinases that could be bound to the LKB1–STRAD complex, we isolated bacterially expressed GST–LKB1-WT, GST–LKB1-KD and GST–flag-STRAD. The GST tag of flag-STRAD was subsequently removed. An in vitro kinase analysis of the purified proteins showed that LKB1-WT directly phosphorylated STRAD, whereas LKB1-KD did not (Figure 3D). Thus, our results indicate that the pseudokinase STRAD is the first direct in vivo LKB1 substrate to be identified. STRAD activates the catalytic activity of LKB1 The previous observations led us to hypothesize that STRAD could activate the autophosphorylation, and hence the catalytic activity of LKB1. However, upon transfection of STRAD, LKB1 accumulates in cells (data not shown), which makes it difficult to distinguish between enhanced activation and stabilization of LKB1. To examine the activation of LKB1 in more detail, we therefore isolated GST–LKB1 and the GST–LKB1/flag-STRAD complex from transfected HEK-293T cells, since these purified complexes were easily quantified. Equal amounts of the protein complexes were subjected to an in vitro kinase assay in the presence of [γ-32P]ATP. Immunoblots were performed with phospho-specific antibodies against the major in vitro autophosphorylation sites of LKB1, namely Thr336 and Thr363 (Thr366 in mouse Lkb1) (Sapkota et al., 2002). Upon transfection of STRAD, we found a strong increase in LKB1 autophosphorylation at these sites (Figure 4A). Alone, LKB1 is a weakly active kinase with minimal potential to phosphorylate exogenous substrates (D.R.Alessi, unpublished data). We investigated whether STRAD could enhance phosphorylation of the exogenous substrate MBP by LKB1. The phosphorylation of MBP by the GST–LKB1/flag-STRAD complex was strongly enhanced compared with its phosphorylation by GST–LKB1 alone (Figure 4A, bottom panel). Figure 4.(A) STRAD activates LKB1 as visualized by LKB1s enhanced autophosphorylation and its increased ability to phosphorylate MBP. GST–LKB1-WT and GST–LKB1-WT/flag-STRAD protein complexes were isolated from transfected HEK-293T cells using GST-affinity chromatography. Protein complexes were subjected to an in vitro kinase assay (IVK) in the presence or absence of 10 μg of MBP. Protein complexes were immunoblotted (WB) with α-GST or α-flag to determine equal loading. Autophosphorylation of LKB1 was determined by immunoblotting (WB) with phospho-specific antibodies against the LKB1 autophosphorylation sites Thr336 and Thr363. Phosphorylated proteins were separated by SDS–PAGE and visualized by autoradiography. (B) LKB1 autophosphorylation is enhanced 3- to 4-fold upon forced expression of STRAD. A time-course experiment was performed using GST–LKB1-WT, GST–LKB1-WT/flag-STRAD and GST–LKB1-KD isolated from transfected HEK-293T cells. The in vitro kinase assay (IVK) was initiated by adding [γ-32P]ATP and kinase buffer to the GST proteins, and stopped at the indicated time points by the addition of SDS sample buffer. The protein complexes were separated by SDS–PAGE and immunoblotted (WB) with α-GST. Phosphorylated proteins were visualized by autoradiography. Levels of phosphorylation were quantified and are represented graphically. Download figure Download PowerPoint To study the kinetics of STRAD-mediated activation of LKB1 autophosphorylation, we performed a time-course experiment (Figure 4B). GST–LKB1-WT, GST–LKB1-KD and the GST–LKB1-WT/flag-STRAD complex were isolated from transfected HEK-293T cells, and subjected to an in vitro kinase assay in the presence of [γ-32P]ATP for time periods ranging from 0 to 40 min. LKB1 autophosphorylation increased 3- to 4-fold upon forced STRAD expression, and this enhancement was already visible after 2.5 min (Figure 4B, bottom panel). STRAD activates LKB1, but does not alter its substrate specificity To address the specificity of STRAD-mediated LKB1 activation, we investigated the phosphorylated sites on LKB1 and MBP. GST–LKB1 and the GST–LKB1/flag-STRAD complex were isolated from transfected HEK-293T cells and subjected to an in vitro kinase assay in the presence of [γ-32P]ATP. HPLC fractionation of trypsin-digested LKB1 and STRAD-activated LKB1 generated comparable peak patterns (Figure 5A, upper left), confirming that the increased phosphorylation of LKB1 upon transfection of STRAD was caused by intrinsic activation of LKB1. The stoichiometry of LKB1 autophosphorylation in the presence of STRAD was dramatically increased. The 32P fractions were analysed by MALDI-TOF mass spectrometry, followed by phospho-amino acid analysis and solid-phase Edman degradation. In addition to the previously identified Thr336 and Thr363 sites (Figure 5A, bottom right; Table I), two novel autophosphorylation sites, namely Thr185 and Thr402, were characterized (Figure 5A, upper right and bottom left; Table I). Figure 5.STRAD-mediated activation of LKB1 does not affect its substrate specificity. (A) Clockwise, starting upper left. Tryptic peptide map of GST–LKB1 and GST–LKB1 activated by STRAD, and the corresponding Edman degradation diagrams and phospho-amino acid (PAA) analysis (inserts). The increased stoichiometry of LKB1 autophosphorylation upon STRAD activation enabled the identification of two novel autophosphorylation sites: Thr185 and Thr402. (B) Tryptic peptide map of MBP phosphorylated by GST–LKB1 and GST–LKB1/flag-STRAD (left panel), and the corresponding Edman degradation diagram (right panel) and PAA analysis (insert). The LKB1 phosphorylation site on MBP was determined as Thr65. Download figure Download PowerPoint Table 1. Identification of tryptic peptides isolated from the in vitro kinase reactions Residues Phosphorylation site Modification Mass Measured Theoretical 389–403 LKB1 T402 P04 + Met-Ox 1724.697 1724.776 176–191 LKBI T185 P04 1720.915 1720.959 334–383 LKB1 T336 + T363 2× P04 5843.049 5842.028 64–73 MBP T65 P04 1211.533 1211.546 317–346 STRAD T329 P04 3204.390 3204.470 386–431 STRAD T419 P04 5213.557 5212.619 The 32P-labelled peptides from Figures 5 and 6 were analysed on a PerSeptive Biosystems Elite STR MALDI-TOF mass spectrometer in linear and reflective mode, using 10 mg/ml α-cyanocinnamic acid as the matrix. The site phosphorylated in MBP by GST–LKB1 alone and by the GST–LKB1/flag-STRAD complex was similarly determined to be Thr65 (Figure 5B; Table I). The comparable peak patterns of the HPLC traces of trypsin-digested MBP in this experiment (Figure 5B, left panel) indicated that STRAD enhanced the kinase activity of LKB1, but did not alter its substrate specificity. LKB1 phosphorylates STRAD at Thr329 and Thr419 Since STRAD is the first physiological substrate of LKB1 identified so far, we were interested in mapping the phosphorylated sites on STRAD. For this purpose, a GST–STRAD/myc–LKB1-WT complex was expressed in HEK-293T cells and subsequently isolated. After the complex was subjected to an in vitro kinase assay in the presence of [γ-32P]ATP, the sites were mapped as described above and were found to be Thr329 and Thr419 (Figure 6A; Table I). Mutation of these sites to either alanine or aspartic acid residues abolished LKB1-mediated STRAD phosphorylation, as is demonstrated by an in vitro kinase assay with the corresponding mutants (Figure 6B). However, these mutations did not alter the ability of STRAD to bind or activate LKB1. Figure 6.(A) LKB1 phosphorylates STRAD at Thr329 and Thr419. Tryptic map of GST–STRAD phosphorylated by myc–LKB1-WT (upper panel), and the corresponding Edman degradation diagrams (bottom two panels) and phospho-amino acid (PAA) analysis (inserts). (B) Mutation of Thr329 and Thr419 abolishes STRAD phosphorylation by LKB1, but does not interfere with STRAD's ability to bind or activate LKB1. Thr329 and/or Thr419 of flag-STRAD were mutated to Ala (T329A, T419A) or Asp (T329D, T419D). The indicated protein complexes were isolated from transfected HEK-293T cells using GST-affinity chromatography and immunoblotted (WB) with α-GST or α-STRAD. In addition, protein complexes were subjected to an in vitro kinase assay (IVK), separated by SDS–PAGE and visualized by autoradiography. Download figure Download PowerPoint STRAD determines the subcellular localization of LKB1 Cytoplasmic localization of LKB1 is reportedly important for its role in mediating G1 cell cycle arrest (Tiainen et al., 2002). Previously, it was shown that overexpression of an LKB1-interacting protein, LIP1, induces translocation of LKB1 from the nucleus to the cytoplasm (Smith et al., 2001). To study whether STRAD affects the subcellular distribution of LKB1, we carried out localization studies in COS cells. Myc-tagged LKB1 constructs and flag-tagged STRAD constructs were transfected into COS cells, and the localization of the corresponding proteins was determined by immunofluorescence. LKB1-WT and mutants localized mainly to the nucleus, while STRAD was diffusely expressed in the cell (Figure 7A). Upon transfection of STRAD, LKB1-WT re-localized to the cytoplasm together with STRAD (Figure 7B). The STRAD mutant in which the Thr329 and Thr419 LKB1 phosphorylation sites are altered to alanine was still able to translocate LKB1 to the cytoplasm, indicating that phosphorylation of STRAD by LKB1 is not essential for this process. The nuclear localization of LKB1-KD and of the SL26 mutant did not alter upon STRAD transfection. This implied that the cytoplasmic re-localization of LKB1 was dependent both on LKB1 kinase activity and on its ability to associate with STRAD. Figure 7.STRAD determines the cytoplasmic subcellular localization of LKB1, which is dependent on the kinase activity of LKB1 and its ability to associate with STRAD. Phosphorylation of STRAD by LKB1 is not essential for this process. (A) Myc-tagged LKB1-WT, -KD, -SL26 and flag-STRAD were transfected into COS cells. The localization of proteins was determined by incubation with α-myc/TRITC–goat α-mouse or α-STRAD–biotin/FITC–streptavidin and visualized by fluorescence microscopy. (B) Co-transfection of STRAD with LKB1-WT results in translocation of the LKB1-WT–STRAD complex to the cytoplasm. The STRAD mutant T329A/T419A is also able to re-localize LKB1-WT. LKB1-KD and LKB1-SL26 are not able to translocate to the cytoplasm upon forced expression of STRAD. Detection was performed as above. Download figure Download PowerPoint STRAD is an essential co-factor for LKB1-mediated G1 cell cycle arrest Previously, forced expression of LKB1-WT was shown to induce a G1 cell cycle arrest in LKB1-deficient G361 melanoma cells (Tiainen et al., 1999). Since our results predict that STRAD is important for LKB1 function, we investigated its effect on this LKB1-induced growth arrest. Expression of LKB1-WT induced a very potent G1 arrest which could not be further enhanced by STRAD (Figure 8A). As predicted, transient transfection of STRAD did not affect the cell cycle, since no endogenous LKB1 is present in G361 cells. Interestingly, both kinase-inactive LKB1 and the SL26 mutant failed to induce G1 arrest. This suggested not only that LKB1 kinase activity was required for its growth-suppressive activities, but also that LKB1 had to be able to associate with its adaptor STRAD. Western blot analysis confirmed the presence of endogenous STRAD in G361 cells (data not shown). We therefore hypothesized that endogenous STRAD cooperated with exogenous LKB1 in mediating G1 cell cycle arrest. To examine this in detail, we generated STRAD-specific small interfering RNA by taking advantage of the pSUPER system (Brummelkamp et al., 2002). Several siRNA sequences were tested by co-transfection of flag-STRAD and the indicated pSUPER (pS) constructs in HEK-293T cells. pSUPER-STRAD4 completely eliminated the expression of co-transfected STRAD (Figure 8B). We analysed the ability of LKB1-WT to induce G1 cell cycle arrest upon co-transfection with pSUPER-STRAD4, and found that removal of STRAD by RNA interference abolished the LKB1-directed growth arrest (Figure 8C).

The BAG3 (BLC2-associated athanogene 3) gene codes for an antiapoptotic protein located on the sarcomere Z-disc. Mutations in BAG3 are associated with dilated cardiomyopathy (DCM), but only a small number of cases have been reported to date, and the natural history of BAG3 cardiomyopathy is poorly understood. This study sought to describe the phenotype and prognosis of BAG3 mutations in a large multicenter DCM cohort. The study cohort comprised 129 individuals with a BAG3 mutation (62% males, 35.1 ± 15.0 years of age) followed at 18 European centers. Localization of BAG3 in cardiac tissue was analyzed in patients with truncating BAG3 mutations using immunohistochemistry. At first evaluation, 57.4% of patients had DCM. After a median follow-up of 38 months (interquartile range: 7 to 95 months), 68.4% of patients had DCM and 26.1% who were initially phenotype-negative developed DCM. Disease penetrance in individuals >40 years of age was 80% at last evaluation, and there was a trend towards an earlier onset of DCM in men (age 34.6 ± 13.2 years vs. 40.7 ± 12.2 years; p = 0.053). The incidence of adverse cardiac events (death, left ventricular assist device, heart transplantation, and sustained ventricular arrhythmia) was 5.1% per year among individuals with DCM. Male sex, decreased left ventricular ejection fraction. and increased left ventricular end-diastolic diameter were associated with adverse cardiac events. Myocardial tissue from patients with a BAG3 mutation showed myofibril disarray and a relocation of BAG3 protein in the sarcomeric Z-disc. DCM caused by mutations in BAG3 is characterized by high penetrance in carriers >40 years of age and a high risk of progressive heart failure. Male sex, decreased left ventricular ejection fraction, and enlarged left ventricular end-diastolic diameter are associated with adverse outcomes in patients with BAG3 mutations.