Immunotherapy with chimeric antigen receptor (CAR)-expressing T cells that target the disialoganglioside GD2 expressed on tumor cells may be a therapeutic option for patients with high-risk neuroblastoma.In an academic, phase 1-2 clinical trial, we enrolled patients (1 to 25 years of age) with relapsed or refractory, high-risk neuroblastoma in order to test autologous, third-generation GD2-CAR T cells expressing the inducible caspase 9 suicide gene (GD2-CART01).A total of 27 children with heavily pretreated neuroblastoma (12 with refractory disease, 14 with relapsed disease, and 1 with a complete response at the end of first-line therapy) were enrolled and received GD2-CART01. No failure to generate GD2-CART01 was observed. Three dose levels were tested (3-, 6-, and 10×106 CAR-positive T cells per kilogram of body weight) in the phase 1 portion of the trial, and no dose-limiting toxic effects were recorded; the recommended dose for the phase 2 portion of the trial was 10×106 CAR-positive T cells per kilogram. Cytokine release syndrome occurred in 20 of 27 patients (74%) and was mild in 19 of 20 (95%). In 1 patient, the suicide gene was activated, with rapid elimination of GD2-CART01. GD2-targeted CAR T cells expanded in vivo and were detectable in peripheral blood in 26 of 27 patients up to 30 months after infusion (median persistence, 3 months; range, 1 to 30). Seventeen children had a response to the treatment (overall response, 63%); 9 patients had a complete response, and 8 had a partial response. Among the patients who received the recommended dose, the 3-year overall survival and event-free survival were 60% and 36%, respectively.The use of GD2-CART01 was feasible and safe in treating high-risk neuroblastoma. Treatment-related toxic effects developed, and the activation of the suicide gene controlled side effects. GD2-CART01 may have a sustained antitumor effect. (Funded by the Italian Medicines Agency and others; ClinicalTrials.gov number, NCT03373097.).

Abstract Paediatric-type diffuse high-grade gliomas (pDHGG) are a group of molecularly and clinically defined tumor entities of the central nervous system. The investigation of the spatial organization of pDHGG tissues may provide new insights to decipher their heterogeneous nature and identify vulnerabilities in their aggressive behaviour. Here we exploit Imaging Mass Cytometry (IMC), a spatial biology approach enabling multiplex tissue phenotyping at single-cell resolution. We used 16 total formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues from 4 patients including 1 Diffuse hemispheric glioma H3G34-mutant (DHG-H3G34), 1 Diffuse pediatric-type high-grade glioma H3-wildtype and IDH-wildtype (DHGG-WT) and 2 Diffuse midline glioma H3K27-altered (DMG-H3K27, 1 H3.3K27M and 1 H3.1K27M). Classical pathology assessment and DNA methylation profile were also performed. For IMC staining, 2 metal-tag custom-designed antibody panels (tumour and immune) of 31 antibodies were used. The panels include antibodies for differentiated and stem-cell markers, extracellular matrices, immune markers and H3K27M and H3.3G34R variants. An IMC analysis pipeline was developed: images are extracted in tiff format from the proprietary MCD files produced by Hyperion instrument, filtered to remove hot pixels via top-hat and OpenCV in Python, segmented using steinbock and analysed using the IMC Data Analysis toolbox in R, using docker. A total of 209 mm2 of tissue were analysed. IMC analysis showed that DHG-H3G34 displays a higher heterogeneity in terms of cell phenotypes compared to the other tumor entities. Moreover, immune infiltrate of T, B cells, NK and monocytes was observed in the DHG-H3G34 and DHGG-WT tissues, while the DMG-H3K27 had low/no immune infiltrate with the H3.3K27M showing higher PDL-1 expression. Analysis of longitudinal and multi-region samples highlighted trajectories of tumor evolution and identification of extracellular matrix niches in tumor core versus the infiltrative front. Our study provides novel insights into pDHGG complex biology by investigating their tissue architecture, spatial organization and cell-cell interactions.

Abstract The association between pediatric high-grade gliomas (HGG) and cancer predisposition syndromes (CPS) remains inadequately elucidated in the existing literature, while next-generation sequencing (NGS) is increasingly utilized for diagnostic support. In this retrospective analysis, we evaluated a cohort of 95 consecutive pediatric patients with HGG reclassified according to the latest 2021 WHO classification, diagnosed and treated at the Bambino Gesù Children’s Hospital between 2011 and 2023. All patients underwent genetic germline testing with NGS technology to detect the presence of germline variants predisposing to cancer and were included in this study. Diagnosis of pHGG H3-IDH wild-type was performed in 23 patients (24.2%), diffuse midline glioma in 46 patients (48.4%), astrocytoma IDH-mutant in 7 patients (7.4%), anaplastic pleomorphic xanthoastrocytoma in 4 patients (4.2%), adult type HGG in 4 patients (4.2%), neuroepithelial tumor PATZ1 fusion-positive in 3 patients (3.2%), diffuse hemispheric glioma H3 G34-mutant in 2 patients (2.1%), infant-type hemisheric glioma in 2 patients (2.1%), other rare histologies in 4 patients (4.2%). Oncological family history was investigated up to the third generation for all patients and was positive in 43/95 (45.3%) cases. We identified a total of 65 variants in 95 patients, distributed as follows: 48 variants of uncertain significance (73.8%), 10 likely pathogenic (15.4%), and 7 pathogenic variants (10.8%). Notably, our findings reveal that pathogenic/likely pathogenic variants were detected in about 17% of the entire study population, higher than the 10% incidence reported in the existing literature. The high rate of mutations in CPS associated genes described in our work, leads to consider performing NGS even in the absence of clinical or anamnestic criteria suggestive of it. However, ethical and social issues are to be considered when we propose and investigate patients for CPS. Moreover, further research are needed to determine the role of variants of uncertain significance.

Abstract BACKGROUND Standard salvage regimen for medulloblastoma’s relapse is currently lacking. An evolving alternative approach is metronomic chemotherapy, which aims to interfere with tumor angiogenesis. We report our experience on a modified combinatorial metronomic chemotherapic/antiangiogenic approach, the Medulloblastoma European Multitarget Metronomic Anti-Angiogenic Trial (MEMMAT) regimen. Our study aimed to test efficacy and tolerance of that approach in pediatric patients with relapsed/refractory medulloblastoma treated in outpatient unit. METHODS The study was conducted from January 2017 to December 2022 at Bambino Gesù Children’s Hospital in Rome. MEMMAT-like regimen consisted of daily oral thalidomide, fenofibrate, celecoxib, and alternating 21-day cycles of low-dose oral etoposide and cyclophosphamide supplemented by intravenous bevacizumab and intrathecal topotecan. RESULTS Fourteen patients met the eligibility criteria. At diagnosis, six patients (43%) presented a localized disease, the other eight patients (57%) metastatic one; eight patients had the first recurrence and six had multiple recurrences at the start of MEMMAT-like therapy. At relapse, all the recurrences had a metastatic pattern. Methylation profiling classification showed three subgroups 3, six subgroups 4, three with SHH subgroup, and two WNT. The median overall survival after the recurrence that prompted to the use of MEMMAT like regimen, for the whole group, was 17,9 months (range, 8-32 months), with 79% (60%,100%) at 12 months and 19% (5,7%-64%) at 24 months; the mean progression-free survival (PFS) at 12 and 24 months was 57% (36%-90%) and 26% (10%-66%). When the one-year PFS rate was evaluated according to the MEMMAT-like number of treatment lines (after the first relapse or third and beyond), we found respectively 62% (37%-100%) and 50% (22%100%). CONCLUSIONS The metronomic outpatient MEMMAT-like combination is feasible, well tolerated, and can lead to sustained control of relapse in medulloblastoma. The best setting seems to be after the first relapse to achieve a higher PFS.

Optimal immune function is crucial in preventing cancer development and growth and for the success of anti-cancer therapies. Here, we characterized the peripheral immunological status of 83 steroids-naïve pediatric patients with central nervous system neoplasia at the disease onset. Tumors were classified into low-grade gliomas (LGG), high-grade gliomas (HGG), medulloblastoma, and other tumors. We revealed that glioma patients showed an altered lymphocyte pool. T-cells of HGG patients shifted from naïve to effector memory phenotype. LGG patients exhibited T-cell central memory expansion and higher T-cell activation. Interestingly, HGG patients displayed reduced thymic function. Furthermore, LGG and HGG patients showed reduced activated B-cells and suboptimal B-cell formation. Our data demonstrate that glioma patients have reduced lymphopoiesis at the disease onset, which could contribute to the systemic lymphopenia characterizing these patients. This study offers novel insights into the immunological status of brain tumor patients which may help in designing more effective treatments.

: Differentiating pediatric posterior fossa (PF) tumors such as medulloblastoma (MB), ependymoma (EP), and pilocytic astrocytoma (PA) remains relevant, because of important treatment and prognostic implications. Diffusion kurtosis imaging (DKI) has not yet been investigated for discrimination of pediatric PF tumors. Estimating diffusion values from whole-tumor-based (VOI) segmentations may improve diffusion measurement repeatability compared to conventional region-of-interest (ROI) approaches. Our purpose was to compare repeatability between ROI and VOI DKI-derived diffusion measurements and assess DKI accuracy in discriminating among pediatric PF tumors.