Abstract Mantle cell lymphoma (MCL) is an incurable B-cell malignancy with an overall poor prognosis, particularly for patients that progress on targeted therapies. Novel, more durable treatment options are needed for patients with MCL. Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) is overexpressed in MCL and plays an important oncogenic role in this disease via epigenetic and posttranslational modification of cell cycle regulators, DNA repair genes, components of prosurvival pathways, and RNA splicing regulators. The mechanism of targeting PRMT5 in MCL remains incompletely characterized. Here, we report on the antitumor activity of PRMT5 inhibition in MCL using integrated transcriptomics of in vitro and in vivo models of MCL. Treatment with a selective small-molecule inhibitor of PRMT5, PRT-382, led to growth arrest and cell death and provided a therapeutic benefit in xenografts derived from patients with MCL. Transcriptional reprograming upon PRMT5 inhibition led to restored regulatory activity of the cell cycle (p-RB/E2F), apoptotic cell death (p53-dependent/p53-independent), and activation of negative regulators of B-cell receptor-PI3K/AKT signaling (PHLDA3, PTPROt, and PIK3IP1). We propose pharmacologic inhibition of PRMT5 for patients with relapsed/refractory MCL and identify MTAP/CDKN2A deletion and wild-type TP53 as biomarkers that predict a favorable response. Selective targeting of PRMT5 has significant activity in preclinical models of MCL and warrants further investigation in clinical trials.

Abstract Mantle cell lymphoma (MCL) is an incurable B cell malignancy, comprising 5% of non-Hodgkin lymphomas diagnosed annually. MCL is associated with a poor prognosis due to emergence of resistance to immuno-chemotherapy and targeted agents. The average overall survival of patients with MCL is 4-6 years and for the majority of patients who progress on targeted agents, survival remains at a dismal 3-8 months. There is a major unmet need to identify new therapeutic approaches that are well tolerated to improve treatment outcomes and quality of life. The type II protein arginine methyltransferase enzyme, PRMT5 is overexpressed and promotes growth and survival of MCL. Inhibition of PRMT5 with a novel, SAM-competitive class of inhibitors drives anti-tumor activity in MCL cell lines and patient derived xenograft (PDX) models derived from patients with relapse or refractory disease. Selective inhibition of PRMT5 with PRT-382 (Prelude Therapeutics) in these models and MCL cell lines leads to disruption of constitutive PI3K/AKT signaling, dephosphorylation and nuclear translocation of FOXO1, and enhanced recruitment of this tumor suppressor protein to target genes. By performing chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP seq) analysis, we identified over 800 newly emerged FOXO1-bound genomic loci, including multiple pro-apoptotic BCL2 family proteins (BAX, BAK1, BIK, BBC3, BMF and NOXA1). FOXO1 localization and transcriptional differences were confirmed by ChIP PCR and RT-PCR respectively. Protein levels were measured with Western blotting. BAX was identified as the most common direct target of FOXO1-transriptional activity that was upregulated on both a transcript and protein level. This led us to hypothesize that PRMT5 inhibition could potentially drive a therapeutic vulnerability to the BCL-2 inhibitor venetoclax. Single agent and combination treatment with venetoclax and PRT382 was performed in nine MCL lines. Of the nine lines, four were considered relatively resistant to PRT-382 and five resistant to venetoclax. Synergy scores, determined from MTS assays, showed significant levels of synergy in the majority of MCL lines tested. CCMCL1 and UPN1, BCL-2 negative MCL lines, and Maver1, which is highly resistant to PRMT5i, were the only cell lines to not show synergy. The cell line with the highest levels of synergy, Z-138, expressed high levels of BCL-2 and is ibrutinib resistant. Overall, there was a strong positive correlation between BCL-2 expression and synergy score (r= -0.8956, p=0.0064). The synergy seen was confirmed to be through the intrinsic apoptotic pathway based on caspase activity. To determine a mechanism of action, BAX and BAK1 were knocked down in four cell lines, three that displayed synergy and one that was resistant. This suggests that BAX expression is essential for synergy between PRMT5 and BCL2 inhibition to occur. Knock down of BAK1, the other effector of the BCL2 family of proteins, did not show protection suggesting that BAX is necessary and sufficient for this therapeutic synergy to occur. We also determined that p53 status did not correlate to the response seen (p=0.477), supporting that this mechanism is occurring through FOXO1 transcriptional regulation. In vivo evaluation in two preclinical MCL models showed therapeutic synergy with combination venetoclax/PRT382 treatment. Mice were treated with sub-therapeutic doses of venetoclax and/or PRT382 and disease burden was assessed weekly via flow cytometry. Combination treatment with well-tolerated doses of venetoclax and PRMT5 inhibitors in the MCL in vivo models showed synergistic anti-tumor activity. Both PDX models showed an extension of life with combination treatment (P<0.001) and delayed disease progression (P<0.05). This data provides mechanistic rationale while demonstrating therapeutic synergy in this preclinical study and justifies further consideration of this combination strategy targeting PRMT5 and BCL2 in MCL in the clinical setting. Disclosures Zhang: Prelude Therapeutics: Current Employment. Vaddi: Prelude Therapeutics: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company. Elemento: AstraZeneca: Research Funding; Janssen: Research Funding; Johnson and Johnson: Research Funding; One Three Biotech: Consultancy, Other: Current equity holder; Volastra Therapeutics: Consultancy, Other: Current equity holder, Research Funding; Eli Lilly: Research Funding; Freenome: Consultancy, Other: Current equity holder in a privately-held company; Owkin: Consultancy, Other: Current equity holder; Champions Oncology: Consultancy. Scherle: Prelude Therapeutics: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company. Paik: Forkhead BioTherapeutics: Research Funding. Baiocchi: Prelude Therapeutics: Consultancy; viracta: Consultancy, Current holder of stock options in a privately-held company; Codiak Biosciences: Research Funding; Atara Biotherapeutics: Consultancy.

Mantle cell lymphoma (MCL) is an incurable B cell malignancy, defined by the t(11;14) translocation and comprises 3-6% of non-Hodgkin lymphomas diagnosed annually. MCL is associated with a poor prognosis due to emergence of resistance to immuno-chemotherapy and targeted agents. Due to the late median age of diagnosis, aggressive chemotherapy and stem cell transplantation are often not realistic options. The average overall survival of patients with MCL is 5 years and for the majority of patients who progress on targeted agents like ibrutinib, survival remains at a dismal 3-8 months. There is a major unmet need to identify new therapeutic approaches that are well tolerated by elderly patients to improve treatment outcomes and quality of life. Our group has identified the type II protein arginine methyltransferase enzyme, PRMT5, to be dysregulated in MCL and to promote growth and survival by supporting the cell cycle, PRC2 activity, and signaling via the BCR and PI3K/AKT pathways. We have developed first-in-class selective inhibitors of PRMT5 and, in collaboration with Prelude Therapeutics, we have demonstrated that novel SAM-competitive PRMT5 inhibitors provide potent anti-tumor activity in aggressive preclinical models of human MCL. Selective inhibition of PRMT5 in these models and MCL cell lines leads to disruption of constitutive PI3K/AKT signaling, dephosphorylation and nuclear translocation of FOXO1, and enhanced recruitment of this tumor suppressor protein to chromatin. We identified 136 newly emerged FOXO1-bound genomic loci following 48 hours of PRMT5 inhibition in the CCMCL1 MCL line by performing chromatin immunoprecipitation-seq analysis. These genes were markedly upregulated in CCMCL1 cells treated with the PRMT5 inhibitor PRT382 as determined by RNA-seq analysis. Among those genes, we identified and confirmed FOXO1 recruitment to the promoter of BAX, a pro-apoptotic member of the BCL2 family of proteins. Treatment of MCL cell lines (Granta-519, CCMCL1, Z-138, and SEFA) with the selective PRMT5 inhibitor PRT382 (10, 100nM) led to upregulation of BAX protein levels and induction of programmed cell death as measured by annexin V/PI staining and flow cytometry. We hypothesized that induction of BAX would trigger a therapeutic vulnerability to the BCL2 inhibitor venetoclax, and that combination PRMT5/BCL2 inhibitor therapy would drive synergistic cell death in MCL. Single agent and combination treatment with venetoclax and PRT382 was performed in eight MCL lines including a new cell line generated from our ibrutinib-refractory PDX model (SEFA) and IC50 and synergy scores were calculated. The Z-138 line was most sensitive to venetoclax (IC50<10nM) while CCMCL-1, SP53, JeKo-1, and Granta-519 demonstrated relative resistance (IC50>1uM). All lines reached an IC50 <1uM when co-treated with PRT382, with IC50 values ranging from 20 - 500nM. Combination treatments showed high levels of synergy (scores > 20) in 4 lines and moderate synergy (scores 10-20) in 2 lines. The two lines with the highest levels of synergy, Z-138 and SEFA, express high levels of BCL-2 and are Ibrutinib resistant. Overall there was a strong positive correlation between BCL2 expression and synergy score (r=0.707), and no correlation between PRMT5 expression and synergy score (r=0.084). In vivo evaluation in two preclinical MCL models (Granta-519 NSG mouse flank and an ibrutinib-resistant MCL PDX) showed therapeutic synergy with combination venetoclax/PRT382 treatment. In both models, mice were treated with sub-therapeutic doses of venetoclax and/or PRT543 (Granta) or PRT382 (IR-MCL PDX) and tumor burden assessed weekly via flank mass measurement (Granta) or flow cytometry (IR-MCL-PDX). Combination treatment with well-tolerated doses of venetoclax and PRMT5 inhibitors in both MCL in vivo models showed synergistic anti-tumor activity without evidence of toxicity. This preclinical data provides mechanistic rationale while demonstrating therapeutic synergy and lack of toxicity in this preclinical study and justifies further consideration of this combination strategy targeting PRMT5 and BCL2 in MCL in the clinical setting. PRT543, a selective PRMT5 inhibitor, has been advanced into clinical studies for the treatment of patients with solid tumors and hematologic malignancies, including MCL (NCT03886831). Disclosures Zhang: Prelude Therapeutics: Employment. Vaddi:Prelude Therapeutics: Employment. Scherle:Prelude Therapeutics: Employment. Baiocchi:Prelude: Consultancy.

Abstract Introduction: Ibrutinib is widely used for relapsed/refractory mantle cell lymphoma (MCL), however nearly 1/3 of patients have primary resistance and the remaining patients will inevitably acquire resistance with poor overall survival. There is an urgent need for novel therapies targeting pro-survival signaling pathways triggered by ibrutinib resistance. Pharmacologic inhibition of Protein Arginine Methyltransferase 5 (PRMT5) represents a novel therapeutic approach to overcome ibrutinib resistant MCL (IR-MCL). PRMT5 has many essential functions in normal and malignant B cells, however in the context of IR-MCL the mechanisms of PRMT5 inhibitor mediated cell death have not been described. Genomic co-deletions of MTAP/CDKN2A are commonly detected in IR-MCL cells. MTAP deletion and subsequent accumulation of the metabolite MTA, sensitizes cells to further inhibition of PRMT5. Although the published literature defines this therapeutic rationale for targeting PRMT5 in cancers with co-deletion of MTAP/CDKN2A, the literature lacks studies specifically targeting PRMT5 in IR-MCL. Methods: Here we report the primary mechanism of PRMT5 inhibitor mediated cell death in the context of IR-MCL, utilizing a combination of Whole Exome Sequencing (WES), RNA-seq, protein expression, and cell cycle analysis (PI-DNA staining with flow cytometry) in 8 MCL cell lines and 3 patient derived xenografts (PDXs) of IR-MCL. Pharmacologic inhibition of PRMT5 was performed with two selective compounds: PRT-382 and C220 (Prelude Therapeutics). Inducible CRISPR/CAS9-gRNA was used to selectively knock out MTAP and CDKN2A. Results: Comparing MCL cell lines with primary ibrutinib resistance, we found an inverse correlation between PRT-382 ic50 and ibrutinib ic50 (Spearman: r = -0.94, p = 0.017). In MCL cell lines, low expression of MTAP also correlated with lower global Symmetric Di-Methyl Arginine (SDMA) and enhanced sensitivity to C220 respectively (Pearson: r = 0.84, p = 0.01; r = 0.87, p = 0.01). Genomic deletion of MTAP in a cell line with primary ibrutinib resistance (Jeko MTAP-WT) enhanced sensitivity to PRMT5i, whereas MTAP knock-in (KI) in CCMCL, an MTAP-null cell line, decreased sensitivity to PRMT5i. The treatment of Jeko-MTAP-KI and CCMCL-MTAP-KO with MTA, further confirmed that genomic deletion of MTAP confers enhanced vulnerability to PRMT5i in MCL cell lines. In a PDX generated in our lab from an MCL patient with acquired IR, treatment with PRT-382 decreased tumor infiltration of multiple organs and ki-67 compared to ibrutinib or control (H&E and IHC staining). To mechanistically address the nature of the anti-tumor activity of PRMT5i in IR-MCL, we treated PDX mice with PRT-382 or vehicle control for 2 weeks to obtain ex-vivo samples for NGS methods. Splenic MCL tumor cells (Hu-CD19+) where subjected to transcriptomic profiling by RNA-seq (n=3 per Tx group). RNA-seq revealed 1014 down and 1124 up differentially expressed genes (DEGs) (q < 0.01, |log2FC| > 0.05). Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) identified activation of the p53 pathway (NES = 1.73), with repression of E2F targets, G2M checkpoints, Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT), and PRMT5 targets among the top gene sets modulated with PRMT5i (NES = -2.51, -2.26, -2.06, -1.79). Comparing genomic alterations across MCL cell lines and 3 PDXs of IR-MCL, co-deletion of MTAP/CDKN2A and/or a functional/WT copy of TP53 defines a therapeutic vulnerability to PRMT5i in 9 out of 11 cases (82%). In MCL, PRMT5i resulted in p53-dependent G1/S cell cycle arrest and p53-dependent DNA damage induced apoptosis by transcriptional activation of the p53 target genes (CDKN1A, BBC3, BAX, PHLDA3, andSESN1). Western blot analysis confirmed E2F target gene repression (TK1, CCNA2, CHK1, CDK1) and accumulation of DNA damage response proteins (cleaved PARP, cleaved CASP3, p-H2AX) that are further enhanced with combination of doxorubicin. Conclusion: Pharmacologic inhibition of PRMT5 with the clinical-grade, novel small molecule inhibitor (PRT543, Prelude Therapeutics) merits further investigation in ongoing clinical trials (NCT03886831, clinicaltrials.gov), specifically for the treatment of IR-MCL with deletion of MTAP and prior to the genomic mutation of TP53. We are currently exploring novel combinations to maximize the therapeutic potential of PRMT5 inhibition in this disease. Disclosures Byrd: Vincerx Pharmaceuticals: Current equity holder in publicly-traded company, Membership on an entity's Board of Directors or advisory committees; Novartis, Trillium, Astellas, AstraZeneca, Pharmacyclics, Syndax: Consultancy, Honoraria; Newave: Membership on an entity's Board of Directors or advisory committees. Vaddi: Prelude Therapeutics: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company. Scherle: Prelude Therapeutics: Current Employment, Current equity holder in publicly-traded company. Baiocchi: Prelude Therapeutics: Consultancy; viracta: Consultancy, Current holder of stock options in a privately-held company; Codiak Biosciences: Research Funding; Atara Biotherapeutics: Consultancy.

Mantle cell lymphoma (MCL) is an incurable B-cell non-Hodgkin's lymphoma. MCL patients who relapse on targeted therapies have a particularly poor prognosis. Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5), an enzyme that drives symmetric dimethylation of arginine (SDMA) residues, is overexpressed in MCL and promotes MCL growth and survival. Thus, PRMT5 has emerged as an attractive therapeutic target in MCL. We developed a small molecule PRMT5 inhibitor (PRT-382) that exhibits significant anti-MCL activity in cell lines (50-100 nM) and in vivo preclinical MCL murine models (10 mg/kg, daily, four days on; 3 days off). Despite the anti-tumor activity of PRMT5 inhibition, we have observed some animals develop drug resistance leading to rapid progression of MCL despite continued treatment with PRT-382. While treatment with PRT-382 significantly prolonged the survival of our MCL patient derived xenograft (PDX) model (83D vs. 48D, p-value: 0.0045), one mouse developed a rapid and much greater expansion of MCL cells both in the peripheral blood and in multiple organs when it reached early removal criteria at day 90. Despite the significantly increased tumor burden in this mouse while on PRMT5 inhibitory therapy, SDMA reduction in MCL tumor cells was still achieved in comparison to the vehicle control treated mice. MCL tumor cells from this PRMT5 inhibitor refractory mouse and PRMT5 inhibitor naïve mice were re-engrafted and treated with PRT-382. Compared to mice engrafted with treatment naïve cells, the mice engrafted with PRMT5 inhibitor refractory cells had decreased survival (p-value: 0.004). Thus, in vivo resistance was retained allowing generation of additional samples for mechanistic studies. In addition to in vivo models of resistance, some MCL cell lines (Maver, Mino, UPN1, and Jeko) show primary resistance to PRMT5 inhibition based on high IC50s of PRT-382 (mean: 800; range: 300-2000 nM) compared to the sensitivity to this drug in other MCL cell lines (mean: 80; range: 50-100 nM). Prolonged culture of four PRT-382 sensitive MCL lines (CCMCL, Rec-1, SP53, and Z-138) with drug escalation produced cell lines with acquired PRT-382 resistance with IC50s 3 to 5 times (200-500 nM) that of parental lines. We found this PRMT5 inhibitor resistance persisted after prolonged culture (30d) in the absence of drug. As observed in the MCL PDX PRMT5 inhibitor refractory mice, SDMA reduction was still achieved at the original PRT-382 doses. Utilizing single cell RNA sequencing (scRNA-seq) and bulk RNA-sequencing, these multiple in vivo and in vitro PRMT5 inhibitor resistant samples were evaluated in comparison with their parental/untreated counterparts to identify compensatory pro-survival pathways amplified with PRMT5 inhibitor resistance. ScRNA-seq analysis on MCL PDX samples demonstrated a strong shift in global gene expression depending on treatment duration and condition. Upregulation of Insulin Receptor, PI3K, MAPK, and MTOR signaling were identified using Ingenuity Pathway Analysis (p-value threshold of 0.001 and z-score of 1.1) based on differentially expressed genes with PRMT5 inhibitor treatment in the resistant cell lines and PDX in comparison to their sensitive or parental counterparts. In vitro drug combination analysis has demonstrated synergy inhibiting PRMT5 (PRT-382) in combination with PI3K/MTORC1 and 2 (Omipalisib), MTORC1 (Temsirolimus), and EIF1A (Silvestrol) in MCL cell lines with primary (Mino) and acquired (Rec-1, SP53, and Z-138) resistance to PRMT5 inhibition. We are currently mechanistically validating these pathways in our in vitro models and invivo preclinical MCL models.

Background: Hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH) is a rare but frequently fatal autoinflammatory syndrome characterized by dysregulated immune activation, excessive production of proinflammatory cytokines and hyperactivation of T cells and macrophages leading to tissue damage. Primary HLH occurs due to predisposing genetic mutations in the perforin/granzyme pathway, while secondary HLH can be triggered by infections, rheumatologic disorders, or malignancies. HLH has a poor overall prognosis despite appropriate therapy, and new avenues targeting pathologic disease mechanisms are urgently needed. The protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) enzyme has been identified as an important mediator in inflammatory T cell subsets in autoimmune disease and graft versus host disease. We hypothesized that PRMT5 activity is relevant to inflammation loops that drive autoinflammation observed in HLH. Methods: We explored inhibition of type II protein arginine methyltransferase enzyme, PRMT5, in a murine model of secondary HLH. HLH was triggered in C57BL/6-J mice (Jackson Laboratories) by repeated injections of CpG 1826 (Integrated DNA Technologies) and an IL-10 receptor-blocking antibody (clone 1B1.3A; Bio X Cell) on days 0, 2, 4, and 7. Injected mice were left untreated or were treated with ruxolitinib 90 mg/kg (validated treatment of HLH) orally twice daily, starting on Day 4, or increasing doses of oral inhibitor of PRMT5, PRT382 (0.25, 1 or 2 mg/kg daily), starting on Day 0. Mice were weighed daily. On day 9, mice were euthanized and analyzed for spleen and liver weight, serum IFNγ levels and immune profiling of lymphoid and myeloid splenocyte subsets. Splenocytes were left unstimulated, or stimulated with lipopolysaccharide (LPS, myeloid cell stimulation) or CD3/CD28-directed antibodies (T cell stimulation) and analyzed by flow cytometry. Data analysis was performed by unsupervised ViSNE clustering in Cytobank software. Statistical analysis was performed by unpaired t test. Results: We observed that 1 mg/kg PRT382 lessened the hallmarks of secondary HLH, compared to the untreated HLH cohort, including weight loss (21% reduction, p-value 0.2746), the development of splenomegaly (71% reduction, p-value <0.001) and hepatomegaly (61% reduction, p-value <0.05), similarly to ruxolitinib (p-values <0.01, <0.001, and 0.0795, respectively). Furthermore, mice with untreated HLH showed a 17X increase in serum IFNγ levels compared to controls (p-value <0.01), while mice treated with ruxolitinib showed a 10X increase (p-value <0.05 compared to controls, 0.2577 compared to untreated HLH), and mice treated with 1 mg/kg PRT382 showed undetectable serum IFNγ (p-value 0.2104 compared to controls, <0.01 compared to untreated HLH). Flow cytometric analysis of mouse splenocytes showed that HLH stimulated the expansion of neutrophils (CD11b+/Ly6Clo/Ly6G+) and inflammatory monocytes (CD11b+/Ly6C+/Ly6G-). Ruxolitinib partially counteracted this expansion. PRT382 inhibited expansion of these myeloid cell subsets in a dose-dependent manner and also limited production of IFNγ and TNFα by myeloid cells in response to stimulation with LPS in presence of Golgi blockade with Brefeldin A. Furthermore, PRT382 limited the upregulation of CD25 on the surface of T cells in response to T cell stimulation, although no change in cytokine production by T cells was observed. Conclusions: PRMT5 inhibition counteracts pro-inflammatory features of pathologic hyper-inflammation driven by myeloid immune cell subsets in a model of secondary HLH. This may represent a novel avenue for urgently needed immune modulatory targeted treatment of HLH. Studies of PRMT5 expression and targeting in models of primary HLH are underway.

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare and aggressive blood cancer comprising 5% of all non-Hodgkin lymphomas diagnosed annually. The median age of diagnosis is 68 years old, and while many patients initially respond to frontline treatment, relapse is common. To date, MCL remains incurable. There is an unmet need to develop novel therapeutic strategies for the treatment of patients with MCL. Our group has identified protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) as a key driver of MCL pathogenesis. PRMT5 symmetrically dimethylates arginine residues on a number of proteins (p53, E2F1, p65) and histones (H4R3, H3R8, H2AR3), which support tumorigenesis. Selectively inhibiting PRMT5 has shown significant anti-tumor activity in preclinical MCL models, and a Phase 1 clinical trial with PRT543 (Prelude), a novel PRMT5 inhibitor, is underway. While exploring pathways that converge with PRMT5 activity as potential avenues for combination treatment, we identified the intrinsic apoptotic pathway as an attractive target in MCL. BCL2 family proteins either promote or inhibit intrinsic apoptosis at the outer mitochondrial membrane through a dynamic set of binding interactions. Prior work has shown PRMT5 inhibition to drive the expression of multiple pro-death BCL2 family gene products (BAX, BAK, and BBC3[PUMA]) in MCL. We hypothesized that combining PRMT5 inhibition with BH3 mimetics, compounds that target pro-survival BCL2 proteins, would induce synergistic cell death in MCL. Selective PRMT5 inhibition with PRT382 inhibits the viability of MCL cell lines with an IC50 below 1uM in eight of nine lines (IC50 44.8nM - 1905.5nM). We chose six cell lines to test combination treatment ranging in sensitivity to BH3 mimetics and expression of BCL2 family proteins (CCMCL1, Z-138, UPN1, Granta 519, Mino, and Maver1). BH3 mimetics navitoclax (BCL2, BCLxL, and BCLw inhibitor), A852 (BCLxL inhibitor), and PRT1419 (MCL1 inhibitor) were found to have IC50s below 1uM in four, one, and three of the six cell lines respectively. Synergistic decreases in viability were tested via MTS assay and analyzed with the Loewe model of synergy. Mino, which showed sensitivity to all three mimetics, exhibited a synergistic reduction in viability with combination PRT382 treatment. Granta 519 and Z-138 exhibited a similar effect with the combination of PRT382 and navitoclax or A852. These observations were confirmed through BH3 profiling which measures functional apoptotic priming by quantifying mitochondrial depolarization after exposure to pro-apoptotic peptides. This assay supported MCL cell line variable dependence on BCL2, BCLxL, BCLw and MCL1, and increased sensitivity to BCL2 family protein targeting with PRMT5 inhibition. MCL tumor cells from patient derived xenograft models were tested ex vivo after treatment with 10mg/kg of the PRMT5 inhibitor PRT382 or vehicle. iBH3 flow-based analysis showed increased sensitivity to pan BCL2, BCLxL, and MCL1 inhibition. Combinatorial treatment was tested in vivo using the PDX.AA.MCL model of ibrutinib resistant MCL. PRMT5 inhibition was achieved with PRT808 drugged chow (32.7 mg/kg) given five days on, two days off. Navitoclax (50mg/kg) and PRT1419 (30mg/kg) were dosed once weekly via oral gavage. Single agent PRT1419 provided no significant improvement over control mice as measured by circulating disease burden and survival. Navitoclax and PRT808 single agent as well as PRT808+PRT1419 regimens significantly slowed disease progression. PRT808+Nav showed the greatest reduction in disease progression and greatest survival advantage. Hematotoxicity was monitored via CBC and showed increasing thrombocytopenia as disease progressed. Of note, navitoclax dosing alone or in combination did not induce additional platelet loss. Our results provide rationale for combining BH3 mimetics and PRMT5 inhibition in clinical trials as a novel treatment strategy for MCL. Figure 1View largeDownload PPTFigure 1View largeDownload PPT Close modal

Mantle cell lymphoma (MCL) is an incurable B cell malignancy, comprising 5% of non-Hodgkin lymphomas diagnosed annually. MCL is associated with a poor prognosis due to emergence of resistance to immuno-chemotherapy and targeted agents. The average overall survival of patients with MCL is 4-6 years and for the majority of patients who progress on targeted agents, survival remains at a dismal 3-8 months. There is a major unmet need to identify new therapeutic approaches that are well tolerated to improve treatment outcomes and quality of life. The type II protein arginine methyltransferase enzyme, PRMT5 is overexpressed and promotes growth and survival of MCL. Inhibition of PRMT5 with a novel, SAM-competitive class of inhibitors drives anti-tumor activity in MCL cell lines and patient derived xenograft models derived from patients with relapse or refractory disease. Selective inhibition of PRMT5 in these models and MCL cell lines leads to disruption of constitutive PI3K/AKT signaling, dephosphorylation and nuclear translocation of FOXO1, and enhanced recruitment of this tumor suppressor protein to target genes. By performing chromatin immunoprecipitation-seq analysis, we identified over 800 newly emerged FOXO1-bound genomic loci, among which pro-apoptotic BH3 family members including multiple pro-apoptotic BCL2 family proteins. BAX was identified as the most common direct target of FOXO1-transriptional activity which led us to hypothesize that PRMT5 inhibition could potentially drive a therapeutic vulnerability to the BCL-2 inhibitor venetoclax. Single agent and combination treatment with venetoclax and PRT382 was performed in nine MCL lines and IC50 and synergy scores showed significant levels of synergy in the majority of MCL lines tested. CCMCL1, a BCL-2 negative MCL line, and Maver1, which is highly resistant to PRMT5i, were the only cell lines to not show synergy. The cell line with the highest levels of synergy, Z-138, expressed high levels of BCL-2 and is ibrutinib resistant. Overall, there was a strong positive correlation between BCL-2 expression and synergy score (r = -0.8956, p = 0.0064). In vivo evaluation in two preclinical MCL models showed therapeutic synergy with combination venetoclax/PRT382 treatment. Mice were treated with sub-therapeutic doses of venetoclax and/or PRT382 and disease burden was assessed weekly via flow cytometry. Combination treatment with well-tolerated doses of venetoclax and PRMT5 inhibitors in the MCL in vivo models showed synergistic anti-tumor activity. Both PDX models showed an extension of life with combination treatment (P < 0.001) and delayed disease progression (P < 0.05). This preclinical data provides mechanistic rationale while demonstrating therapeutic synergy in this preclinical study and justifies further consideration of this combination strategy targeting PRMT5 and BCL2 in MCL in the clinical setting. EA – previously submitted to EHA 2021. The research was funded by: The College of Medicine at The Ohio State University, USA; The NIH, USA; Prelude Therapeutics, USA; Keywords: Genomics, Epigenomics, and Other -Omics, Molecular Targeted Therapies, Combination Therapies Conflicts of interests pertinent to the abstract Y. Zhang Employment or leadership position: Prelude Therapeutics P. Scherle Employment or leadership position: Prelude Therapeutics K. Vaddi Employment or leadership position: Prelude Therapeutics R. A. Baiocchi Consultant or advisory role: Prelude Therapeutics Research funding: Prelude Therapeutics

Abstract Mantle cell lymphoma (MCL) is an aggressive and incurable blood cancer comprising 5% of all non-Hodgkin lymphomas diagnosed annually. The median age of diagnosis is 68yo, and while many patients initially respond to frontline treatment, relapse is common. There is an unmet need to develop novel therapeutic strategies for the treatment of MCL. Our group has identified protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) as a key driver of MCL pathogenesis. PRMT5 symmetrically dimethylates arginine residues on a number of proteins (P53, E2F1, P65) and histones (H4R3, H3R8, H2AR3), which support tumorigenesis. Selectively inhibiting PRMT5 has shown significant anti-tumor activity in preclinical MCL models, and a Phase 1 clinical trial with PRT543 (Prelude), a novel PRMT5 inhibitor, is underway. While exploring pathways that converge with PRMT5 activity as potential avenues for combination treatment, we identified the intrinsic apoptotic pathway as an attractive target in MCL. BCL2 family proteins either promote or inhibit intrinsic apoptosis at the outer mitochondrial membrane through a dynamic set of binding interactions. Prior work has shown PRMT5 inhibition to drive the expression of multiple pro-death BCL2 family gene products (BAX, BAK, and BBC3/PUMA) in MCL. We hypothesized that combining PRMT5 inhibition with BH3 mimetics, compounds that target pro-survival BCL2 proteins, would induce synergistic cell death in MCL. Selective PRMT5 inhibition with PRT382 inhibits the viability of MCL cell lines with an IC50 below 1uM in eight of nine lines (IC50 44.8nM - 1905.5nM). BH3 mimetics navitoclax (BCL2, BCLXL, and BCLw inhibitor), A852 (BCLXL inhibitor), and AMG176 (MCL1 inhibitor) were found to have IC50s below 1uM in five, two, and four of the nine cell lines respectively. We chose six cell lines to test combination treatment ranging in sensitivity to BH3 mimetics and expression of BCL2 family proteins (CCMCL1, Z-138, UPN1, Granta 519, Mino, and Maver1). Synergistic decreases in viability were tested via MTS assay and analyzed with the Loewe model of synergy. Mino, which showed sensitivity to all three mimetics, exhibited a synergistic reduction in viability with combination PRT382 treatment. Granta 519 and Z-138 exhibited a similar effect with the combination of PRT382 and navitoclax or A852. These observations were confirmed through BH3 profiling, supporting MCL cell line dependence on BCL2, BCLXL, BCLw and MCL1, and increased sensitivity to BCL2 family protein targeting with PRMT5 inhibition. Two patient derived xenograft models were tested ex vivo after treatment with 10mg/kg of the PRMT5 inhibitor PRT382 or vehicle. iBH3 flow-based analysis revealed increased sensitivity of ex vivo PDX cells to pan BCL2, BCLXL, and MCL1 inhibition. These results provide rationale for combining BH3 mimetics and PRMT5 inhibition in clinical trials as a novel treatment strategy for MCL. Citation Format: Claire Hinterschied, Fiona Brown, Janani Ravikrishnan, JoBeth Helmig-Mason, Kris Vaddi, Peggy Scherle, Jennifer Woyach, Selina Chen-Kiang, Oliver Elemento, Jihye Paik, Robert Baiocchi. PRMT5 inhibition alters mitochondrial dynamics in mantle cell lymphoma, creating vulnerability to BH3 mimetic compounds [abstract]. In: Proceedings of the American Association for Cancer Research Annual Meeting 2022; 2022 Apr 8-13. Philadelphia (PA): AACR; Cancer Res 2022;82(12_Suppl):Abstract nr 1031.

Individuals with a functional T cell impairment, including the elderly, people living with human immunodeficiency virus (HIV), patients with inherited immune deficiencies, and those receiving iatrogenic immune suppression (organ transplant recipients or sufferers of autoimmune diseases) are at increased risk of developing aggressive lymphomas driven by the oncogenic Epstein-Barr virus (EBV). EBV is a ubiquitous herpes virus that infects >90% of adult humans. EBV can cause a self-limiting acute infectious mononucleosis, characterized by lytic viral replication, which is marked by the expression of lytic proteins such as BZLF1, and potent T cell-driven immune responses. EBV ultimately establishes a life-long latent persistence in the memory B cell compartment. The virus avoids complete eradication due to the ability of the latent infection to evade immune responses by limiting the expression of immunogenic viral proteins, inducing T cell senescence, Th1 cell differentiation blockade, and mobilization of regulatory T cells. Latent EBV drives lymphoproliferative disease (EBV LPD) development in the immunosuppressed setting by contributing to the immortalization of B cells. EBV LPD is frequently aggressive and has no unified standard-of-care treatment. Relapsed/refractory disease has a poor prognosis, and development of novel therapies is urgently needed. The expression of viral antigens in EBV(+) lymphoma cells makes immune-based therapies an attractive experimental option for treating relapsed/refractory EBV LPD. Restoration of EBV-specific T cell responses against BZLF1 is known to correlate with recovery in patients with EBV-driven post-transplant lymphoproliferative disease. Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5), a methyltransferase enzyme with driver activity in multiple hematologic and solid malignancies, is overexpressed in EBV LPD. PRT382 is a small molecule inhibitor of PRMT5 that has been successfully used in in-vitro and in-vivo models of hematologic malignancies. Our preliminary data showed that in vitro treatment with PRT382 arrests the growth of EBV-transformed lymphoblastoid B cell lines (EBV LCLs) derived from six healthy donors. PRT382 also enhanced gene transcription (up to 16X, p<0.05) and protein expression of the highly immunogenic lytic EBV protein BZLF1 in EBV LCLs in a dose-dependent manner. BZLF1 is known to drive EBV viral genome replication during the early steps of the lytic cycle. We observed a global loss of EBV genomic DNA methylation in EBV LCLs treated with increasing doses of PRT382 (p<0.0001) and a simultaneous increase in EBV genome copy number (up to 16X, p<0.05) per cell, suggesting that PRT382 may contribute to induction of the early steps of the EBV lytic cycle. We also observed increased transcription of EBV lytic genes BMRF1 and BALF4. The effects of PRMT5 inhibition on EBV gene transcription and protein levels appear to be dependent on Mek/Erk/c-Jun intracellular signaling within EBV LCLs. Furthermore, we observed enhanced susceptibility of EBV LCL targets treated with PRT382 to cytotoxic killing by EBV-specific T cells, suggesting that increased expression of EBV immunogenic epitopes such as BZLF1, driven by PRMT5 inhibition, may contribute to direct T cell-mediated cytotoxicity (reproduced with EBV LCLs derived from 3 donors). Finally, PRT382 significantly prolonged survival in NSG mice engrafted with EBV LCLs, while contributing to an increase in circulating EBV copy number (p<0.01), a decrease of EBV genome methylation (p<0.001) and increase in BZLF1 expression in the malignant EBV(+) B cells harbored by these mice. Studies of the combined therapeutic effects of PRMT5 inhibition and EBV-specific T cells in mouse models of EBV LPD are ongoing. Gene expression profiling is also currently underway to evaluate the impact of PRMT5 inhibition on EBV and human genes. Our preliminary data convincingly establishes PRMT5 inhibition as a novel and potent tool for induction of expression of highly immunogenic viral proteins, such as BZLF1, in a model of EBV LPD with latency III EBV infection, which is characteristic of EBV-driven lymphoma of immunosuppressed states. This enables us to generate a powerful platform for exploring enhanced tumor immunogenicity and for testing and comparison of various EBV-targeting cellular therapy products.