Background Toll-like receptors (TLRs) are critical components for host pathogen recognition and variants in genes participating in this response influence susceptibility to infections. Recently, TLR1 gene polymorphisms have been found correlated with whole blood hyper-inflammatory responses to pathogen-associated molecules and associated with sepsis-associated multiorgan dysfunction and acute lung injury (ALI). We examined the association of common variants of TLR1 gene with sepsis-derived complications in an independent study and with serum levels for four inflammatory biomarkers among septic patients. Methodology/Principal Findings Seven tagging single nucleotide polymorphisms of the TLR1 gene were genotyped in samples from a prospective multicenter case-only study of patients with severe sepsis admitted into a network of intensive care units followed for disease severity. Interleukin (IL)-1β, IL-6, IL-10, and C-reactive protein (CRP) serum levels were measured at study entry, at 48 h and at 7th day. Alleles -7202G and 248Ser, and the 248Ser-602Ile haplotype were associated with circulatory dysfunction among severe septic patients (0.001≤p≤0.022), and with reduced IL-10 (0.012≤p≤0.047) and elevated CRP (0.011≤p≤0.036) serum levels during the first week of sepsis development. Additionally, the -7202GG genotype was found to be associated with hospital mortality (p = 0.017) and ALI (p = 0.050) in a combined analysis with European Americans, suggesting common risk effects among studies. Conclusions/Significance These results partially replicate and extend previous findings, supporting that variants of TLR1 gene are determinants of severe complications during sepsis.

Acute respiratory distress syndrome (ARDS) is a lung inflammatory process caused mainly by sepsis. Most previous studies that identified genetic risks for ARDS focused on candidates with biological relevance. We aimed to identify novel genetic variants associated with ARDS susceptibility and to provide complementary functional evidence of their effect in gene regulation.We did a case-control genome-wide association study (GWAS) of 1935 European individuals, using patients with sepsis-associated ARDS as cases and patients with sepsis without ARDS as controls. The discovery stage included 672 patients admitted into a network of Spanish intensive care units between January, 2002, and January, 2017. The replication stage comprised 1345 individuals from two independent datasets from the MESSI cohort study (Sep 22, 2008-Nov 30, 2017; USA) and the VISEP (April 1, 2003-June 30, 2005) and MAXSEP (Oct 1, 2007-March 31, 2010) trials of the SepNet study (Germany). Results from discovery and replication stages were meta-analysed to identify association signals. We then used RNA sequencing data from lung biopsies, in-silico analyses, and luciferase reporter assays to assess the functionallity of associated variants.We identified a novel genome-wide significant association with sepsis-associated ARDS susceptibility (rs9508032, odds ratio [OR] 0·61, 95% CI 0·41-0·91, p=5·18 × 10-8) located within the Fms-related tyrosine kinase 1 (FLT1) gene, which encodes vascular endothelial growth factor receptor 1 (VEGFR-1). The region containing the sentinel variant and its best proxies acted as a silencer for the FLT1 promoter, and alleles with protective effects in ARDS further reduced promoter activity (p=0·0047). A literature mining of all previously described ARDS genes validated the association of vascular endothelial growth factor A (VEGFA; OR 0·55, 95% CI 0·41-0·73; p=4·69 × 10-5).A common variant within the FLT1 gene is associated with sepsis-associated ARDS. Our findings support a role for the vascular endothelial growth factor signalling pathway in ARDS pathogenesis and identify VEGFR-1 as a potential therapeutic target.Instituto de Salud Carlos III, European Regional Development Funds, Instituto Tecnológico y de Energías Renovables.

Despite the limited genetic heterogeneity of Spanish populations, substantial evidences support that historical African influences have not affected them uniformly. Accounting for such population differences might be essential to reduce spurious results in association studies of genetic factors with disease. Using ancestry informative markers (AIMs), we aimed to measure the African influences in Spanish populations and to explore whether these might introduce statistical bias in population-based association studies.We genotyped 93 AIMs in Spanish (from the Canary Islands and the Iberian Peninsula) and Northwest Africans, and conducted population and individual-based clustering analyses along with reference data from the HapMap, HGDP-CEPH, and other sources. We found significant differences for the Northwest African influence among Spanish populations from as low as ≈ 5% in Spanish from the Iberian Peninsula to as much as ≈ 17% in Canary Islanders, whereas the sub-Saharan African influence was negligible. Strikingly, the Northwest African ancestry showed a wide inter-individual variation in Canary Islanders ranging from 0% to 96%, reflecting the violent way the Islands were conquered and colonized by the Spanish in the XV century. As a consequence, a comparison of allele frequencies between Spanish samples from the Iberian Peninsula and the Canary Islands evidenced an excess of markers with significant differences. However, the inflation of p-values for the differences was adequately controlled by correcting for genetic ancestry estimates derived from a reduced number of AIMs.Although the African influences estimated might be biased due to marker ascertainment, these results confirm that Northwest African genetic footprints are recognizable nowadays in the Spanish populations, particularly in Canary Islanders, and that the uneven African influences existing in these populations might increase the risk for false positives in association studies. Adjusting for population stratification assessed with a few dozen AIMs would be sufficient to control this effect.

Summary Background Genetic susceptibility to asthma is currently linked to a handful of genes which have a limited ability to predict the overall disease risk, suggesting the existence of many other genes involved in disease development. Accumulated evidence from association studies in genes related by biological pathways could reveal novel asthma genes. Objective To reveal novel asthma susceptibility genes by means of a pathway‐based association study. Methods Based on summary data from a previous a genomewide association study ( GWAS ) of asthma, we first identified significant biological pathways using a gene‐set enrichment analysis. We then mapped all tested single nucleotide polymorphisms ( SNP s) on the genes contributing to significant pathways and prioritized those with a disproportionate number of nominal significant associations for further studies. For those prioritized genes, association studies were performed for selected SNP s in independent case–control samples ( n = 1765) using logistic regression models, and results were meta‐analysed with those from the GWAS . Results Two biological processes were significantly enriched: the cytokine–cytokine receptor interaction ( P = 0.002) and the Wnt signalling ( P = 0.012). From the 417 genes interacting in these two pathways, 10 showed an excess of nominal associations, including a known asthma susceptibility locus (encoding SMAD family member 3) and other novel candidate genes. From the latter, association studies of 14 selected SNP s evidenced replication in a locus near the frizzled class receptor 6 ( FZD 6 ) gene ( P = 9.90 × 10 −4 ), which had a consistent direction of effects with the GWAS findings (meta‐analysed odds ratio = 1.49; P = 5.87 × 10 −6 ) and was in high linkage disequilibrium with expression quantitative trait loci in lung tissues. Conclusions and Clinical Relevance This study revealed the importance of two biological pathways in asthma pathogenesis and identified a novel susceptibility locus near Wnt signalling genes.

Sepsis is the most common cause of acute lung injury (ALI), leading to organ dysfunction and death in critically ill patients.Previous studies associated variants of interleukin-1 receptor-associated kinase genes (IRAKs) with differential immune responses to pathogens and with outcomes during sepsis, and revealed that increased expression levels of the IRAK3 gene were correlated with poor outcomes during sepsis.Here we explored whether common variants of the IRAK3 gene were associated with susceptibility to, and outcomes of, severe sepsis.After our discovery of polymorphism, we genotyped a subset of seven single-nucleotide polymorphisms (SNPs) in 336 population-based control subjects and 214 patients with severe sepsis, collected as part of a prospective study of adults from a Spanish network of intensive care units.Whereas IRAK3 SNPs were not associated with susceptibility to severe sepsis, rs10506481 showed a significant association with the development of ALI among patients with sepsis (P 5 0.007).The association remained significant after adjusting for multiple comparisons, population stratification, and clinical variables (odds ratio, 2.50; 95% confidence interval, 1.15-5.47;P 5 0.021).By imputation, we revealed three additional SNPs independently associated with ALI (P , 0.01).One of these (rs1732887) predicted the disruption of a putative human-mouse conserved transcription factor binding site, and demonstrated functional effects in vitro (P 5 0.017).Despite the need for replication in independent studies, our data suggest that common SNPs in the IRAK3 gene may be determinants of sepsis-induced ALI.

Acute lung injury (ALI) is a severe inflammatory process of the lung. The only proven life-saving support is mechanical ventilation (MV) using low tidal volumes (LVT) plus moderate to high levels of positive end-expiratory pressure (PEEP). However, it is currently unknown how they exert the protective effects. To identify the molecular mechanisms modulated by protective MV, this study reports transcriptomic analyses based on microarray and microRNA sequencing in lung tissues from a clinically relevant animal model of sepsis-induced ALI. Sepsis was induced by cecal ligation and puncture (CLP) in male Sprague-Dawley rats. At 24 hours post-CLP, septic animals were randomized to three ventilatory strategies: spontaneous breathing, LVT (6 ml/kg) plus 10 cmH2O PEEP and high tidal volume (HVT, 20 ml/kg) plus 2 cmH2O PEEP. Healthy, non-septic, non-ventilated animals served as controls. After 4 hours of ventilation, lung samples were obtained for histological examination and gene expression analysis using microarray and microRNA sequencing. Validations were assessed using parallel analyses on existing publicly available genome-wide association study findings and transcriptomic human data. The catalogue of deregulated processes differed among experimental groups. The 'response to microorganisms' was the most prominent biological process in septic, non-ventilated and in HVT animals. Unexpectedly, the 'neuron projection morphogenesis' process was one of the most significantly deregulated in LVT. Further support for the key role of the latter process was obtained by microRNA studies, as four species targeting many of its genes (Mir-27a, Mir-103, Mir-17-5p and Mir-130a) were found deregulated. Additional analyses revealed 'VEGF signaling' as a central underlying response mechanism to all the septic groups (spontaneously breathing or mechanically ventilated). Based on this data, we conclude that a co-deregulation of 'VEGF signaling' along with 'neuron projection morphogenesis', which have been never anticipated in ALI pathogenesis, promotes lung-protective effects of LVT with high levels of PEEP.

The purpose of this study was to investigate whether common variants across the nuclear factor erythroid 2-like 2 (NFE2L2) gene contribute to the development of the acute respiratory distress syndrome (ARDS) in patients with severe sepsis. NFE2L2 is involved in the response to oxidative stress, and it has been shown to be associated with the development of ARDS in trauma patients.We performed a case-control study of 321 patients fulfilling international criteria for severe sepsis and ARDS who were admitted to a Spanish network of post-surgical and critical care units, as well as 871 population-based controls. Six tagging single-nucleotide polymorphisms (SNPs) of NFE2L2 were genotyped, and, after further imputation of additional 34 SNPs, association testing with ARDS susceptibility was conducted using logistic regression analysis.After multiple testing adjustments, our analysis revealed 10 non-coding SNPs in tight linkage disequilibrium (0.75 ≤ r (2) ≤ 1) that were associated with ARDS susceptibility as a single association signal. One of those SNPs (rs672961) was previously associated with trauma-induced ARDS and modified the promoter activity of the NFE2L2 gene, showing an odds ratio of 1.93 per T allele (95 % confidence interval, 1.17-3.18; p = 0.0089).Our findings support the involvement of NFE2L2 gene variants in ARDS susceptibility and reinforce further exploration of the role of oxidant stress response as a risk factor for ARDS in critically ill patients.

Numerous candidate gene and linkage studies have identified loci associated with asthma susceptibility. Recently, the analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) from the entire genome by means of genome-wide association studies (GWASs) has provided new insights about asthma pathogenesis. However, these GWASs have revealed a handful of firm asthma susceptibility genes, explaining a small proportion of the disease heritability.1Meyers D.A. Bleecker E.R. Holloway J.W. Holgate S.T. Asthma genetics and personalised medicine.Lancet Respir Med. 2014; 2: 405-415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (78) Google Scholar Genetic risk can vary among different populations. In previous GWASs Spanish subjects were poorly represented. We hypothesized that a GWAS of asthma in Spanish subjects examining the comprehensive catalogue of genetic variation from the 1000 Genomes Project could reveal new susceptibility genes. Here we performed the first GWAS of asthma in a Spanish population using a 3-stage design analyzing a total of 1180 cases and 1915 control subjects. A workflow with the study design is shown in Fig 1, and Methods are described in this article's Online Repository at www.jacionline.org. Demographic and clinical features of the samples are shown in Table E1 in this article's Online Repository at www.jacionline.org. Association analysis of 6,467,565 genetic variants with asthma in the discovery stage from the Genetics of Asthma (GOA) study in the Spanish population showed no major inflation effects caused by population stratification (genomic control value λGC = 1.038, see Fig E1 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Although none of the variants were associated at the genome-wide level, we identified 337 variants spanning 68 independent loci with suggestive significance at a P value of 5.0 × 10−5 or less (see Fig E1). For replication, we focused on 19 loci with suggestive significance both for genotyped and imputed variants and that were not identified in previous studies (ie, IL33 and IL1RL1-IL18R1).2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar, 3Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar From those loci, with independence of the significance level of the imputed variants, we prioritized 1 genotyped variant for subsequent genotyping in replication sample 1 (see Table E2 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Only 2 SNPs were nominally associated with asthma with the same direction of effects as in the discovery stage (rs17199249 and rs9866261, see Table E3 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). The SNP rs17199249 is located near bone morphogenetic protein receptor type 2 gene (BMPR2; see Fig E2 in this article's Online Repository at www.jacionline.org), and its minor allele (G allele) was a risk factor for asthma susceptibility in both the discovery (odds ratio [OR], 1.09; P = 3.03 × 10−5) and replication sample 1 (OR, 1.30; P = .039) studies. The rs9866261 is an intronic variant from ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 9 gene (ADAMTS9; see Fig E2) with a minor allele (G allele) that is associated with risk for asthma both in the discovery (OR, 1.56; P = 2.71 × 10−5) and replication sample 1 (OR, 1.27; P = .026) studies. We followed up those 2 SNPs for replication in a third sample. At this stage, the association of rs9866261 from ADAMTS9 was replicated (OR, 1.93; P = .007; Table I). No heterogeneity was detected across the 3 stages (P = .165, Cochran Q test) and a fixed-effects meta-analysis attained near genome-wide significance (OR, 1.45; P = 1.31 × 10−7; Table I).Table IAssociation results of the 2 SNPs followed up in all 3 stages of the studyStagers17199249 (BMPR2)rs9866261 (ADAMTS9)MAF casesMAF control subjectsOR (95% CI)∗ORs refer to the minor allele of each polymorphism (G allele).P valueMAF casesMAF control subjectsOR (95% CI)∗ORs refer to the minor allele of each polymorphism (G allele).P valueDiscovery phase (352 cases/537 control subjects)0.1120.1031.09 (1.05-1.14)3.03 × 10−50.1640.1121.56 (1.27-1.92)2.71 × 10−5Replication 1 (482 cases/1209 control subjects)0.1100.0861.30 (1.01-1.67).0390.1580.1251.27 (1.03-1.92).026Replication 2 (346 cases/169 control subjects)0.0840.1070.78 (0.50-1.20).2570.1260.0701.93 (1.20-3.09).007Meta-analysis†Results from a fixed-effect meta-analysis are shown because no heterogeneity was found among studies based on the Cochran Q test (P value >.12). (1180 cases/1915 control subjects)——1.09 (1.03-1.16)3.25 × 10−3——1.45 (1.26-1.66)1.31 × 10−7BMPR2, Bone morphogenetic protein receptor type 2; MAF, minor allele frequency.∗ ORs refer to the minor allele of each polymorphism (G allele).† Results from a fixed-effect meta-analysis are shown because no heterogeneity was found among studies based on the Cochran Q test (P value >.12). Open table in a new tab BMPR2, Bone morphogenetic protein receptor type 2; MAF, minor allele frequency. Finally, we identified in the bibliography 55 SNPs from 35 loci that were associated with asthma at a P value of less than 5.0 × 10−8 in previous studies (see Table E4 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). We found evidence of replication for 14 of those SNPs (1.99 × 10−6 ≤ P value ≤ .038, see Table E5 in this article's Online Repository at www.jacionline.org), 12 of which had consistent effects and were located in 6 firm susceptibility loci (IL1RL1-IL18R1, RAD50-IL13, IL33, LRRC32, ORMDL3-GSDMB, and IKZF3). ADAMTS9 is highly expressed in the lungs. This disintegrin and metalloproteinase is involved in the extracellular matrix turnover of versican, among other proteoglycans, a process that has a key role in embryogenesis, tissue morphogenesis, and maintenance. Increased production of large extracellular matrix versican has been implicated in asthma pathogenesis,4Nihlberg K. Andersson-Sjoland A. Tufvesson E. Erjefalt J.S. Bjermer L. Westergren-Thorsson G. Altered matrix production in the distal airways of individuals with asthma.Thorax. 2010; 65: 670-676Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar disease severity,4Nihlberg K. Andersson-Sjoland A. Tufvesson E. Erjefalt J.S. Bjermer L. Westergren-Thorsson G. Altered matrix production in the distal airways of individuals with asthma.Thorax. 2010; 65: 670-676Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 5Weitoft M. Andersson C. Andersson-Sjoland A. Tufvesson E. Bjermer L. Erjefalt J. et al.Controlled and uncontrolled asthma display distinct alveolar tissue matrix compositions.Respir Res. 2014; 15: 67Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar and airway remodeling contributing to the persistent airway obstruction and decrease in lung function observed in asthmatic patients.6Chiappara G. Gagliardo R. Siena A. Bonsignore M.R. Bousquet J. Bonsignore G. et al.Airway remodelling in the pathogenesis of asthma.Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2001; 1: 85-93Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar The SNP rs9866261 or SNPs in high linkage disequilibrium (LD) with it are not expression quantitative trait loci, but this SNP is in high LD (r2 = 0.80) with rs9311896, which is located in a regulatory region of the gene in fetal lung tissue, as indicated by DNase I–hypersensitive experiments and by the presence of enhancer histone marks according to ENCODE data. Despite this evidence, ADAMTS9 has never been associated with asthma or any related traits by using GWASs or candidate-gene association studies. This could be due to the fact that this SNP was described for the first time by the 1000 Genomes Project. Therefore it is not present in HapMap, the reference data used for imputation in most of previous GWASs of asthma, including the 2 largest meta-analyses.2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar, 3Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar However, 2 SNPs in high LD with rs9866261 (r2 ≥ 0.8) were tested in the GABRIEL consortium2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar but were not associated with asthma in that meta-analysis (P = .343 for rs4688470 and P = .400 for rs9311896). This result could be due to the different ancestral composition of the case-control sample analyzed in our study, which included greater African ancestry compared with other European populations (see Fig E3 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). ADAMTS9 has been previously associated with waist-hip ratio, type 2 diabetes, age-related macular degeneration, and anthropometric traits based on GWAS findings and in secondary analyses with obesity, cholesterol, and fasting insulin.7Heid I.M. Jackson A.U. Randall J.C. Winkler T.W. Qi L. Steinthorsdottir V. et al.Meta-analysis identifies 13 new loci associated with waist-hip ratio and reveals sexual dimorphism in the genetic basis of fat distribution.Nat Genet. 2010; 42: 949-960Crossref PubMed Scopus (718) Google Scholar, 8Fritsche L.G. Chen W. Schu M. Yaspan B.L. Yu Y. Thorleifsson G. et al.Seven new loci associated with age-related macular degeneration.Nat Genet. 2013; 45: 433-439Crossref PubMed Scopus (615) Google Scholar, 9Liu C.T. Monda K.L. Taylor K.C. Lange L. Demerath E.W. Palmas W. et al.Genome-wide association of body fat distribution in African ancestry populations suggests new loci.PLoS Genet. 2013; 9: e1003681Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar This result is not surprising given that there are other firm susceptibility genes, such as SMAD3, that have been implicated both in patients with asthma2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar, 10Ferreira M.A. Matheson M.C. Tang C.S. Granell R. Ang W. Hui J. et al.Genome-wide association analysis identifies 11 risk variants associated with the asthma with hay fever phenotype.J Allergy Clin Immunol. 2014; 133: 1564-1571Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (148) Google Scholar and those with type 2 diabetes.11Dong C. Tang L. Liu Z. Bu S. Liu Q. Wang Q. et al.Landscape of the relationship between type 2 diabetes and coronary heart disease through an integrated gene network analysis.Gene. 2014; 539: 30-36Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar Similarly, the association of ADAMTS9 with obesity and cholesterol levels supports the genetic and epidemiologic data linking both traits with asthma.12Visness C.M. London S.J. Daniels J.L. Kaufman J.S. Yeatts K.B. Siega-Riz A.M. et al.Association of childhood obesity with atopic and nonatopic asthma: results from the National Health and Nutrition Examination Survey 1999-2006.J Asthma. 2010; 47: 822-829Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar, 13Al-Shawwa B. Al-Huniti N. Titus G. Abu-Hasan M. Hypercholesterolemia is a potential risk factor for asthma.J Asthma. 2006; 43: 231-233Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar We cannot rule out that the association with asthma can be confounded by obesity because no body mass index data are available among control subjects in the GOA studies. However, among cases from all 3 stages, the SNP rs9866261 was not associated with body mass index (P = .354). This study has some limitations regarding the selection of control subjects. In the discovery stage no information regarding history of asthma or other respiratory diseases was available, and the control subjects differed in age distribution compared with the cases. This could lead to misclassification of asthma cases as control subjects, reducing the statistical power to detect an association. In the replication studies sex representation, age distribution, or both also differed by case-control status. However, we confirmed the association of 12 SNPs from 6 genes identified in previous GWASs, reinforcing the validity of the findings from our study. The most significant associations corresponded to the IL1RL1-IL18R1 and IL33 loci, where several variants would be significant, even after applying a conservative Bonferroni adjustment for multiple testing (0.05/55, P < 9.0 × 10−4). The lack of replication of some of the loci previously associated with asthma could be due to the different asthma subphenotype analyzed, the fact that some of previous associations are population-specific (ie, PYHIN1 in African Americans),3Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar the existence of different LD patterns among populations, or our limited statistical power. In conclusion, we identified a suggestive genome-wide significant association of ADAMTS9 with asthma in Spanish subjects. Replication in independent studies will be needed to establish the generalizability of this finding. Download .doc (.19 MB) Help with doc files Online Repository TextFig E2View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Fig E3View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)

Please note: The publisher is not responsible for the content or functionality of any supporting information supplied by the authors. Any queries (other than missing content) should be directed to the corresponding author for the article.