Summary Background Genetic susceptibility to asthma is currently linked to a handful of genes which have a limited ability to predict the overall disease risk, suggesting the existence of many other genes involved in disease development. Accumulated evidence from association studies in genes related by biological pathways could reveal novel asthma genes. Objective To reveal novel asthma susceptibility genes by means of a pathway‐based association study. Methods Based on summary data from a previous a genomewide association study ( GWAS ) of asthma, we first identified significant biological pathways using a gene‐set enrichment analysis. We then mapped all tested single nucleotide polymorphisms ( SNP s) on the genes contributing to significant pathways and prioritized those with a disproportionate number of nominal significant associations for further studies. For those prioritized genes, association studies were performed for selected SNP s in independent case–control samples ( n = 1765) using logistic regression models, and results were meta‐analysed with those from the GWAS . Results Two biological processes were significantly enriched: the cytokine–cytokine receptor interaction ( P = 0.002) and the Wnt signalling ( P = 0.012). From the 417 genes interacting in these two pathways, 10 showed an excess of nominal associations, including a known asthma susceptibility locus (encoding SMAD family member 3) and other novel candidate genes. From the latter, association studies of 14 selected SNP s evidenced replication in a locus near the frizzled class receptor 6 ( FZD 6 ) gene ( P = 9.90 × 10 −4 ), which had a consistent direction of effects with the GWAS findings (meta‐analysed odds ratio = 1.49; P = 5.87 × 10 −6 ) and was in high linkage disequilibrium with expression quantitative trait loci in lung tissues. Conclusions and Clinical Relevance This study revealed the importance of two biological pathways in asthma pathogenesis and identified a novel susceptibility locus near Wnt signalling genes.

Numerous candidate gene and linkage studies have identified loci associated with asthma susceptibility. Recently, the analysis of single nucleotide polymorphisms (SNPs) from the entire genome by means of genome-wide association studies (GWASs) has provided new insights about asthma pathogenesis. However, these GWASs have revealed a handful of firm asthma susceptibility genes, explaining a small proportion of the disease heritability.1Meyers D.A. Bleecker E.R. Holloway J.W. Holgate S.T. Asthma genetics and personalised medicine.Lancet Respir Med. 2014; 2: 405-415Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (78) Google Scholar Genetic risk can vary among different populations. In previous GWASs Spanish subjects were poorly represented. We hypothesized that a GWAS of asthma in Spanish subjects examining the comprehensive catalogue of genetic variation from the 1000 Genomes Project could reveal new susceptibility genes. Here we performed the first GWAS of asthma in a Spanish population using a 3-stage design analyzing a total of 1180 cases and 1915 control subjects. A workflow with the study design is shown in Fig 1, and Methods are described in this article's Online Repository at www.jacionline.org. Demographic and clinical features of the samples are shown in Table E1 in this article's Online Repository at www.jacionline.org. Association analysis of 6,467,565 genetic variants with asthma in the discovery stage from the Genetics of Asthma (GOA) study in the Spanish population showed no major inflation effects caused by population stratification (genomic control value λGC = 1.038, see Fig E1 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Although none of the variants were associated at the genome-wide level, we identified 337 variants spanning 68 independent loci with suggestive significance at a P value of 5.0 × 10−5 or less (see Fig E1). For replication, we focused on 19 loci with suggestive significance both for genotyped and imputed variants and that were not identified in previous studies (ie, IL33 and IL1RL1-IL18R1).2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar, 3Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar From those loci, with independence of the significance level of the imputed variants, we prioritized 1 genotyped variant for subsequent genotyping in replication sample 1 (see Table E2 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Only 2 SNPs were nominally associated with asthma with the same direction of effects as in the discovery stage (rs17199249 and rs9866261, see Table E3 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). The SNP rs17199249 is located near bone morphogenetic protein receptor type 2 gene (BMPR2; see Fig E2 in this article's Online Repository at www.jacionline.org), and its minor allele (G allele) was a risk factor for asthma susceptibility in both the discovery (odds ratio [OR], 1.09; P = 3.03 × 10−5) and replication sample 1 (OR, 1.30; P = .039) studies. The rs9866261 is an intronic variant from ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif, 9 gene (ADAMTS9; see Fig E2) with a minor allele (G allele) that is associated with risk for asthma both in the discovery (OR, 1.56; P = 2.71 × 10−5) and replication sample 1 (OR, 1.27; P = .026) studies. We followed up those 2 SNPs for replication in a third sample. At this stage, the association of rs9866261 from ADAMTS9 was replicated (OR, 1.93; P = .007; Table I). No heterogeneity was detected across the 3 stages (P = .165, Cochran Q test) and a fixed-effects meta-analysis attained near genome-wide significance (OR, 1.45; P = 1.31 × 10−7; Table I).Table IAssociation results of the 2 SNPs followed up in all 3 stages of the studyStagers17199249 (BMPR2)rs9866261 (ADAMTS9)MAF casesMAF control subjectsOR (95% CI)∗ORs refer to the minor allele of each polymorphism (G allele).P valueMAF casesMAF control subjectsOR (95% CI)∗ORs refer to the minor allele of each polymorphism (G allele).P valueDiscovery phase (352 cases/537 control subjects)0.1120.1031.09 (1.05-1.14)3.03 × 10−50.1640.1121.56 (1.27-1.92)2.71 × 10−5Replication 1 (482 cases/1209 control subjects)0.1100.0861.30 (1.01-1.67).0390.1580.1251.27 (1.03-1.92).026Replication 2 (346 cases/169 control subjects)0.0840.1070.78 (0.50-1.20).2570.1260.0701.93 (1.20-3.09).007Meta-analysis†Results from a fixed-effect meta-analysis are shown because no heterogeneity was found among studies based on the Cochran Q test (P value >.12). (1180 cases/1915 control subjects)——1.09 (1.03-1.16)3.25 × 10−3——1.45 (1.26-1.66)1.31 × 10−7BMPR2, Bone morphogenetic protein receptor type 2; MAF, minor allele frequency.∗ ORs refer to the minor allele of each polymorphism (G allele).† Results from a fixed-effect meta-analysis are shown because no heterogeneity was found among studies based on the Cochran Q test (P value >.12). Open table in a new tab BMPR2, Bone morphogenetic protein receptor type 2; MAF, minor allele frequency. Finally, we identified in the bibliography 55 SNPs from 35 loci that were associated with asthma at a P value of less than 5.0 × 10−8 in previous studies (see Table E4 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). We found evidence of replication for 14 of those SNPs (1.99 × 10−6 ≤ P value ≤ .038, see Table E5 in this article's Online Repository at www.jacionline.org), 12 of which had consistent effects and were located in 6 firm susceptibility loci (IL1RL1-IL18R1, RAD50-IL13, IL33, LRRC32, ORMDL3-GSDMB, and IKZF3). ADAMTS9 is highly expressed in the lungs. This disintegrin and metalloproteinase is involved in the extracellular matrix turnover of versican, among other proteoglycans, a process that has a key role in embryogenesis, tissue morphogenesis, and maintenance. Increased production of large extracellular matrix versican has been implicated in asthma pathogenesis,4Nihlberg K. Andersson-Sjoland A. Tufvesson E. Erjefalt J.S. Bjermer L. Westergren-Thorsson G. Altered matrix production in the distal airways of individuals with asthma.Thorax. 2010; 65: 670-676Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar disease severity,4Nihlberg K. Andersson-Sjoland A. Tufvesson E. Erjefalt J.S. Bjermer L. Westergren-Thorsson G. Altered matrix production in the distal airways of individuals with asthma.Thorax. 2010; 65: 670-676Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 5Weitoft M. Andersson C. Andersson-Sjoland A. Tufvesson E. Bjermer L. Erjefalt J. et al.Controlled and uncontrolled asthma display distinct alveolar tissue matrix compositions.Respir Res. 2014; 15: 67Crossref PubMed Scopus (47) Google Scholar and airway remodeling contributing to the persistent airway obstruction and decrease in lung function observed in asthmatic patients.6Chiappara G. Gagliardo R. Siena A. Bonsignore M.R. Bousquet J. Bonsignore G. et al.Airway remodelling in the pathogenesis of asthma.Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2001; 1: 85-93Crossref PubMed Scopus (126) Google Scholar The SNP rs9866261 or SNPs in high linkage disequilibrium (LD) with it are not expression quantitative trait loci, but this SNP is in high LD (r2 = 0.80) with rs9311896, which is located in a regulatory region of the gene in fetal lung tissue, as indicated by DNase I–hypersensitive experiments and by the presence of enhancer histone marks according to ENCODE data. Despite this evidence, ADAMTS9 has never been associated with asthma or any related traits by using GWASs or candidate-gene association studies. This could be due to the fact that this SNP was described for the first time by the 1000 Genomes Project. Therefore it is not present in HapMap, the reference data used for imputation in most of previous GWASs of asthma, including the 2 largest meta-analyses.2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar, 3Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar However, 2 SNPs in high LD with rs9866261 (r2 ≥ 0.8) were tested in the GABRIEL consortium2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar but were not associated with asthma in that meta-analysis (P = .343 for rs4688470 and P = .400 for rs9311896). This result could be due to the different ancestral composition of the case-control sample analyzed in our study, which included greater African ancestry compared with other European populations (see Fig E3 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). ADAMTS9 has been previously associated with waist-hip ratio, type 2 diabetes, age-related macular degeneration, and anthropometric traits based on GWAS findings and in secondary analyses with obesity, cholesterol, and fasting insulin.7Heid I.M. Jackson A.U. Randall J.C. Winkler T.W. Qi L. Steinthorsdottir V. et al.Meta-analysis identifies 13 new loci associated with waist-hip ratio and reveals sexual dimorphism in the genetic basis of fat distribution.Nat Genet. 2010; 42: 949-960Crossref PubMed Scopus (718) Google Scholar, 8Fritsche L.G. Chen W. Schu M. Yaspan B.L. Yu Y. Thorleifsson G. et al.Seven new loci associated with age-related macular degeneration.Nat Genet. 2013; 45: 433-439Crossref PubMed Scopus (615) Google Scholar, 9Liu C.T. Monda K.L. Taylor K.C. Lange L. Demerath E.W. Palmas W. et al.Genome-wide association of body fat distribution in African ancestry populations suggests new loci.PLoS Genet. 2013; 9: e1003681Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar This result is not surprising given that there are other firm susceptibility genes, such as SMAD3, that have been implicated both in patients with asthma2Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1489) Google Scholar, 10Ferreira M.A. Matheson M.C. Tang C.S. Granell R. Ang W. Hui J. et al.Genome-wide association analysis identifies 11 risk variants associated with the asthma with hay fever phenotype.J Allergy Clin Immunol. 2014; 133: 1564-1571Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (148) Google Scholar and those with type 2 diabetes.11Dong C. Tang L. Liu Z. Bu S. Liu Q. Wang Q. et al.Landscape of the relationship between type 2 diabetes and coronary heart disease through an integrated gene network analysis.Gene. 2014; 539: 30-36Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar Similarly, the association of ADAMTS9 with obesity and cholesterol levels supports the genetic and epidemiologic data linking both traits with asthma.12Visness C.M. London S.J. Daniels J.L. Kaufman J.S. Yeatts K.B. Siega-Riz A.M. et al.Association of childhood obesity with atopic and nonatopic asthma: results from the National Health and Nutrition Examination Survey 1999-2006.J Asthma. 2010; 47: 822-829Crossref PubMed Scopus (144) Google Scholar, 13Al-Shawwa B. Al-Huniti N. Titus G. Abu-Hasan M. Hypercholesterolemia is a potential risk factor for asthma.J Asthma. 2006; 43: 231-233Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar We cannot rule out that the association with asthma can be confounded by obesity because no body mass index data are available among control subjects in the GOA studies. However, among cases from all 3 stages, the SNP rs9866261 was not associated with body mass index (P = .354). This study has some limitations regarding the selection of control subjects. In the discovery stage no information regarding history of asthma or other respiratory diseases was available, and the control subjects differed in age distribution compared with the cases. This could lead to misclassification of asthma cases as control subjects, reducing the statistical power to detect an association. In the replication studies sex representation, age distribution, or both also differed by case-control status. However, we confirmed the association of 12 SNPs from 6 genes identified in previous GWASs, reinforcing the validity of the findings from our study. The most significant associations corresponded to the IL1RL1-IL18R1 and IL33 loci, where several variants would be significant, even after applying a conservative Bonferroni adjustment for multiple testing (0.05/55, P < 9.0 × 10−4). The lack of replication of some of the loci previously associated with asthma could be due to the different asthma subphenotype analyzed, the fact that some of previous associations are population-specific (ie, PYHIN1 in African Americans),3Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (618) Google Scholar the existence of different LD patterns among populations, or our limited statistical power. In conclusion, we identified a suggestive genome-wide significant association of ADAMTS9 with asthma in Spanish subjects. Replication in independent studies will be needed to establish the generalizability of this finding. Download .doc (.19 MB) Help with doc files Online Repository TextFig E2View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Fig E3View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)

Asthma is a chronic inflammatory disease associated with genetic and environmental factors. The HLA locus is the most polymorphic and gene-dense region of the human genome and has been associated with a large number of infectious and autoimmune diseases.1Gregersen P.K. Behrens T.W. Genetics of autoimmune diseases–disorders of immune homeostasis.Nat Rev Genet. 2006; 7: 917-928Crossref PubMed Scopus (154) Google Scholar Before the advent of genome-wide association studies (GWAS), HLA-DRB1 and HLA-DQB1 genes were independently associated with asthma and related traits in several candidate gene association studies.2Ober C. Hoffjan S. Asthma genetics 2006: the long and winding road to gene discovery.Genes Immun. 2006; 7: 95-100Crossref PubMed Scopus (530) Google Scholar The importance of these genes in the pathogenesis of asthma has recently been corroborated by both individual and meta-analyzed GWAS.3Hirota T. Takahashi A. Kubo M. Tsunoda T. Tomita K. Doi S. et al.Genome-wide association study identifies three new susceptibility loci for adult asthma in the Japanese population.Nat Genet. 2011; 43: 893-896Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar, 4Li X. Howard T.D. Zheng S.L. Haselkorn T. Peters S.P. Meyers D.A. et al.Genome-wide association study of asthma identifies RAD50-IL13 and HLA-DR/DQ regions.J Allergy Clin Immunol. 2010; 125: 328-335.e11Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (271) Google Scholar, 5Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1543) Google Scholar In spite of the evidence, the interpretation of these associations can be problematic because of the complex relationship between the allele at single-nucleotide polymorphisms (SNPs) and the variation at classical HLA alleles. Interestingly, classic alleles associate with stronger effects than individual SNPs and constitute the most likely functional variants.6Dilthey A. Leslie S. Moutsianas L. Shen J. Cox C. Nelson M.R. et al.Multi-population classical HLA type imputation.PLoS Comput Biol. 2013; 9: e1002877Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar Here, we aimed to test the association of SNPs from HLA-DRB1 and HLA-DQB1 with asthma in Spanish samples, and to uncover the classic alleles that are involved in the susceptibility to the disease. In the discovery stage, DNA samples from 574 physician-diagnosed asthmatic patients from the Genetics of Asthma (GOA) study in the Spanish population were compared with samples of 1186 nonasthmatic subjects obtained from the Spanish National DNA Biobank (www.bancoadn.org).7Pino-Yanes M. Sanchez-Machin I. Cumplido J. Figueroa J. Torres-Galvan M.J. Gonzalez R. et al.IL-1 receptor-associated kinase 3 gene (IRAK3) variants associate with asthma in a replication study in the Spanish population.J Allergy Clin Immunol. 2012; 129: 573-575.e10Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar An independent sample of 568 asthma cases and 787 controls was used for replication. For further description of the study design, see Fig E1, Online Repository text, and Table E1 in this article's Online Repository at www.jacionline.org. A total of 22 SNPs capable of predicting classic alleles from HLA-DRB1 and HLA-DQB1 in European populations were genotyped in the discovery sample using a combination of different methods (see Table E2 in this article's Online Repository at www.jacionline.org).8Leslie S. Donnelly P. McVean G. A statistical method for predicting classical HLA alleles from SNP data.Am J Hum Genet. 2008; 82: 48-56Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (138) Google Scholar Their performance on predicting HLA-DRB1 and HLA-DQB1 classic alleles was first assessed by genotyping 313 DNA samples from healthy Spanish individuals with paired data for classic alleles at a 4-digit resolution (Luminex, Austin, Tex). To impute classic alleles, we used a reference data set with more than 2500 samples of European ancestry with dense SNP data and classical HLA allele typing.6Dilthey A. Leslie S. Moutsianas L. Shen J. Cox C. Nelson M.R. et al.Multi-population classical HLA type imputation.PLoS Comput Biol. 2013; 9: e1002877Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar We used a new probabilistic approach (HLP*IMP:02), which delivers increased accuracy on European samples, even under conditions of reduced SNP coverage.6Dilthey A. Leslie S. Moutsianas L. Shen J. Cox C. Nelson M.R. et al.Multi-population classical HLA type imputation.PLoS Comput Biol. 2013; 9: e1002877Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar The imputed alleles for the training sample were compared with the observed classic alleles at 2-digit and 4-digit resolution. Only those classic alleles that attained 80% or more sensitivity, specificity, and positive and negative predictive values and that were common in the training sample (frequency ≥5%) were tested for association. The association of SNPs with asthma in the discovery sample was tested using logistic regression models and included previously obtained ancestry scores as covariates to adjust for population stratification.7Pino-Yanes M. Sanchez-Machin I. Cumplido J. Figueroa J. Torres-Galvan M.J. Gonzalez R. et al.IL-1 receptor-associated kinase 3 gene (IRAK3) variants associate with asthma in a replication study in the Spanish population.J Allergy Clin Immunol. 2012; 129: 573-575.e10Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar In this stage, we performed multiple testing adjustments for SNPs and classic alleles by means of 105 permutations in which case-control labels were swapped while maintaining the haplotype structure. Seventeen SNPs were successfully genotyped and passed quality control checks (see Online Repository text and Table E2). Four of them were associated with asthma in the discovery sample after multiple comparison adjustments (1.24 ≤ odds ratio [OR] ≤ 1.94, 2.8 × 10−7 ≤ P ≤ .002) (see Table E3 and Fig E2 in this article's Online Repository at www.jacionline.org) and 2 of them were nominally significant in replication samples (P ≤ .008) (Table I). A meta-analysis confirmed the consistency of the effects for the association of rs3135388 and rs6457617 with asthma (P = 7.8 × 10−5 and 3.0 × 10−5, respectively) (Table I), and conditional regression analysis in the overall sample revealed their independent association (P = 1.3 × 10−4 for rs3135388 and P = 1.5 × 10−4 for rs6457617), consistent with their weak linkage disequilibrium (r2 = 0.06).Table ISummary of association testing of HLA-DQB1 and HLA-DRB1 SNPs and classic alleles with asthma susceptibilityrs#/geneEffect alleleDiscovery sample (n = 1760)Replication sample (n = 1355)Meta-analysis (n = 3115)OR (95% CI)P valueOR (95% CI)P valueQ testP value∗Cochran's Q test for heterogeneity.OR (95% CI)FEP valueREP valuers2395175A1.94 (1.51-2.49)2.8 × 10−7†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.0.99 (0.72-1.35).931.0011.39 (0.72-2.70)‡Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.6.6 × 10−54.5 × 10−6rs3135388A0.66 (0.50-0.87).002†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.0.63 (0.41-0.97).008†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis..9760.66 (0.54-0.81)§Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.7.8 × 10−5†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.9.4 × 10−5rs6457617T1.25 (1.08-1.44).003†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.1.26 (1.07-1.48).005†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis..9471.25 (1.13-1.39)§Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.3.0 × 10−5†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.3.6 × 10−5rs7764856A1.24 (1.07-1.45).005†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.1.00 (0.84-1.19).973.0631.13 (1.01-1.27)§Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test..029.028HLA-DQB1∗Cochran's Q test for heterogeneity.060.67 (0.56-0.80)1.0 × 10−5†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.0.97 (0.91-1.02).249‖Classical allele data were available only for a subset of 785 samples.1.3 × 10−40.81 (0.57-1.16)‡Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.4.5 × 10−31.2 × 10−4HLA-DRB1∗Cochran's Q test for heterogeneity.150.64 (0.49-0.84).001†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.0.87 (0.80-0.95).001†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.‖Classical allele data were available only for a subset of 785 samples..0260.77 (0.57-1.03)‡Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.1.2 × 10−41.3 × 10−4†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.HLA-DRB1∗Cochran's Q test for heterogeneity.15:010.65 (0.49-0.86).002†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.0.66 (0.49-0.90).008†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis..9180.66 (0.53-0.81)§Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.6.7 × 10−5†Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.8.0 × 10−5FE, Fixed-effects; RE, random-effects.∗ Cochran's Q test for heterogeneity.† Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.‡ Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.§ Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.‖ Classical allele data were available only for a subset of 785 samples. Open table in a new tab FE, Fixed-effects; RE, random-effects. In silico analysis of expression quantitative trait loci (eQTLs) revealed the role of associated SNPs as eQTLs for HLA-DRB1 and/or HLA-DRB5 in lymphoblastoid cells derived from European individuals (see Table E4 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). The SNP rs3135388 was also located on an enhancer histone mark site in B-lymphocyte cells and a transcription factor binding site as demonstrated by empirical data from the Encyclopedia of DNA Elements (ENCODE) (www.genome.gov). In addition, our results for rs6457617 constitute a replication of a GWAS hit for asthma in Japanese.3Hirota T. Takahashi A. Kubo M. Tsunoda T. Tomita K. Doi S. et al.Genome-wide association study identifies three new susceptibility loci for adult asthma in the Japanese population.Nat Genet. 2011; 43: 893-896Crossref PubMed Scopus (267) Google Scholar Interestingly, the 2 associated SNPs showed consistent effects with those reported for lipid traits (see Table E5 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Quality assessment of the imputation of the 76 classic alleles detected in the training sample (see Table E6 in this article's Online Repository at www.jacionline.org) revealed that 14 of the 25 common alleles passed our quality criteria and were followed-up for association analysis using logistic regression models. Three classic alleles were associated with asthma in the discovery sample after multiple testing adjustments (see Table E7 in this article's Online Repository at www.jacionline.org): HLA-DQB1*06, HLA-DRB1*15, and HLA-DRB1*15:01 (.001 ≤ P ≤ 1.0 × 10−5). However, only 2 of them replicated at nominal significance: HLA-DRB1*15 and HLA-DRB1*15:01 (P = .001 and .008, respectively). A meta-analysis confirmed a consistent protective effect of HLA-DRB1*15:01 for asthma across all the samples (OR, 0.66; 95% CI, 0.53-0.81; P = 6.7 × 10−5). Interestingly, HLA-DRB1*15:01 has previously been associated with an increased risk for multiple sclerosis and narcolepsy. This result is consistent with other susceptibility genes that have been shown to have opposite effects in asthma and autoimmune diseases (Table E5).9Li X. Ampleford E.J. Howard T.D. Moore W.C. Torgerson D.G. Li H. et al.Genome-wide association studies of asthma indicate opposite immunopathogenesis direction from autoimmune diseases.J Allergy Clin Immunol. 2012; 130: 861-868.e7Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar, 10Noguchi E. Sakamoto H. Hirota T. Ochiai K. Imoto Y. Sakashita M. et al.Genome-wide association study identifies HLA-DP as a susceptibility gene for pediatric asthma in Asian populations.PLoS Genet. 2011; 7: e1002170Crossref PubMed Scopus (104) Google Scholar However, this study is the first revealing such an effect for a classic HLA allele. Because a previous study has found an association between SNPs from the HLA region and sensitization to specific allergens,11Hinds D.A. McMahon G. Kiefer A.K. Do C.B. Eriksson N. Evans D.M. et al.A genome-wide association meta-analysis of self-reported allergy identifies shared and allergy-specific susceptibility loci.Nat Genet. 2013; 45: 907-911Crossref PubMed Scopus (189) Google Scholar we performed a post hoc analysis for sensitization to the 3 most common specific allergens within the asthma cases (see Online Repository text), and identified SNP rs2395175 as associated with the presence of sensitization to dust mites, pollens, and animal epithelia in the discovery sample (P ≤ .004), with both harmful and protective associations, depending on the allergen (see Table E8 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). However, only the association with animal epithelia sensitization was replicated in independent samples (P ≤ .003), showing a large effect size in the meta-analysis (OR, 2.00; 95% CI; 1.43-2.81; P = 5.6 × 10−5) (Table II). This SNP was also an eQTL for HLA-DRB1 and/or HLA-DRB5 in lymphoblastoid cells (Table E4).Table IISummary of association testing of the SNP rs2395175 with allergic sensitization against dust mites, pollens, and animal epitheliaAllergenDiscovery sampleReplication sampleMeta-analysisSample size∗Number of individuals with positive and negative sensitization (sensitized: nonsensitized).OR (95% CI)P valueSample size∗Number of individuals with positive and negative sensitization (sensitized: nonsensitized).OR (95% CI)P valueSample size∗Number of individuals with positive and negative sensitization (sensitized: nonsensitized).Q testP value†Cochran's Q test for heterogeneity.OR (95% CI)FEP valueREP valueDust mites253:1732.69 (1.58-4.59)2.7 × 10−4‡Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.437:1101.18 (0.64-2.20).597690:283.0481.81 (0.81-4.06)§Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test..002.002Pollens163:2620.46 (0.27-0.79).004‡Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.224:3441.06 (0.64-1.76).830387:606.0290.70 (0.31-1.57)§Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test..069.042Animal epithelia128:2822.07 (1.28-3.35).003‡Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.219:3491.94 (1.20-3.12).007‡Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.347:631.8422.00 (1.43-2.81)‖Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test.5.6 × 10−5‡Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.6.7 × 10−5‡Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.FE, Fixed-effects; RE, random-effects.∗ Number of individuals with positive and negative sensitization (sensitized: nonsensitized).† Cochran's Q test for heterogeneity.‡ Significant P values in individual samples and those that revealed a consistent effect in the meta-analysis.§ Effect and interval derived from the RE model as suggested by the Q test.‖ Effect and interval derived from the FE model as suggested by the Q test. Open table in a new tab FE, Fixed-effects; RE, random-effects. Our study has 2 main limitations. First, it had more than 80% statistical power for variants with an OR of more than 1.3, but not for smaller effect sizes (see Fig E3 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). Second, association testing of the full spectrum of classic alleles at these 2 genes was impracticable, both because of sample size limitations and because of the imperfect predictive ability of the SNPs retained for classic allele imputation. Consequently, we analyzed only 56% of common classic alleles in this population (see Online Repository text). It is possible that we missed other interesting associations, as suggested by the fact that a weighted score including the 2 SNPs associated with asthma explained slightly higher phenotypic variance than did a model including the classic alleles (Nagelkerke's R2 = 0.14 vs 0.10, respectively). In summary, a deeper examination of HLA genes has revealed a classic allele that shows pleiotropic effects for asthma and other immune-related diseases and likely constitutes a putative causal variant. Analysis of SNPs also revealed shared genetic risk factors between asthma and lipid levels. Finally, we provided evidence supporting the role of HLA polymorphisms in specific allergic sensitization. We thank Alexander Dilthey, Gonçalo Abecasis, and Christian Fuchsberger for their help with software tools, Servicio de Apoyo Informático a la Investigación (ULL) for the HPC support, and Katherine K. Nishimura for proofreading the manuscript. Download .doc (.33 MB) Help with doc files Online Repository DataFig E2View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)Fig E3View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT)

Asthma is a chronic inflammatory disorder mainly characterized by reversible airflow obstruction, bronchial hyperresponsiveness, and dyspnea. The functional alterations in airway smooth muscle usually observed in asthmatic patients have been associated with increased expression of the smooth muscle myosin light chain kinase isoform (smMLCK).1Benayoun L. Druilhe A. Dombret M.C. Aubier M. Pretolani M. Airway structural alterations selectively associated with severe asthma.Am J Respir Crit Care Med. 2003; 167: 1360-1368Crossref PubMed Scopus (680) Google Scholar This constitutes a key cytoskeleton effector of the smooth muscle contractile machinery and is encoded by the myosin light chain kinase (MYLK) gene. Two MYLK single nucleotide polymorphisms (SNPs), which are common in Africans (>30%) but rare in Europeans (≤1%), have been associated with asthma in African American and Afro-Caribbean subjects.2Flores C. Ma S.F. Maresso K. Ober C. Garcia J.G. A variant of the myosin light chain kinase gene is associated with severe asthma in African Americans.Genet Epidemiol. 2007; 31: 296-305Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar, 3Gao L. Grant A.V. Rafaels N. Stockton-Porter M. Watkins T. Gao P. et al.Polymorphisms in the myosin light chain kinase gene that confer risk of severe sepsis are associated with a lower risk of asthma.J Allergy Clin Immunol. 2007; 119: 1111-1118Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (49) Google Scholar However, none of the MYLK variants have attained the strict Bonferroni-corrected level of genome-wide significance in a genome-wide association study (GWAS) of asthma. This discrepancy might arise from the low coverage of this region on commercial arrays, the genetic specificities of the populations studied, or both because risk factors in one population might not generalize to another.4Galanter J.M. Gignoux C.R. Torgerson D.G. Roth L.A. Eng C. Oh S.S. et al.Genome-wide association study and admixture mapping identify different asthma-associated loci in Latinos: the Genes-environments & Admixture in Latino Americans study.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 295-305Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar Here we aimed to fine map the association of SNPs from the MYLK gene with asthma in case-control studies from Spanish (n = 3219) and Latino (n = 4650) populations. In the discovery stage DNA samples from 606 patients with physician-diagnosed asthma from the Genetics of Asthma (GOA) study in the Spanish population (GOA I) were compared with 1258 nonasthmatic subjects. Top associated SNPs were then replicated in 2 independent Spanish studies: GOA II and the Genetics of Asthma study in the Spanish population from Malaga (GOAM). GOA II included 248 asthmatic cases and 537 control subjects genotyped with the Axiom Genome-Wide CEU 1 Array (Affymetrix, Santa Clara, Calif), whereas GOAM comprised 320 asthma cases and 250 control subjects genotyped by using TaqMan allelic discrimination assays (Life Technologies, Carlsbad, Calif). Further replication was assessed in 2 Latino studies using existing genome-wide genotyping data: the Genetics of Asthma in Latino Americans (GALA I) study,4Galanter J.M. Gignoux C.R. Torgerson D.G. Roth L.A. Eng C. Oh S.S. et al.Genome-wide association study and admixture mapping identify different asthma-associated loci in Latinos: the Genes-environments & Admixture in Latino Americans study.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 295-305Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar consisting of 529 cases and 347 control subjects, and the Genes-Environments & Admixture in Latino Americans (GALA II) study,5Torgerson D.G. Gignoux C.R. Galanter J.M. Drake K.A. Roth L.A. Eng C. et al.Case-control admixture mapping in Latino populations enriches for known asthma-associated genes.J Allergy Clin Immunol. 2012; 130: 76-82.e12Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (16) Google Scholar including 1893 cases and 1881 control subjects. Detailed descriptions of the study design and sample characteristics can be found in Fig E1, Tables E1 and E2, and the Methods section in this article's Online Repository at www.jacionline.org. In the discovery stage a total of 29 tagging SNPs (tSNPs) were selected from HapMap II to analyze variants with a minor allele frequency (MAF) of 5% or greater from the MYLK gene in European subjects. Genotyping was performed with the iPLEX Gold assay on the MassARRAY system (Sequenom, San Diego, Calif). A total of 26 SNPs passed quality control (after removing monomorphic SNPs or with a P value of 1.7 × 10−3 or less for Hardy-Weinberg equilibrium [HWE] in control subjects, see Table E3 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). After imputation, 272 SNPs with MAFs of 5% or greater and a squared correlation between imputed and true genotypes (Rsq) of 0.3 or greater were kept for association testing by using logistic regression models (88% of the total variants with MAFs of ≥5% in Europeans). Principal components were used as covariates to adjust for population stratification, as previously described.6Pino-Yanes M. Corrales A. Acosta-Herrera M. Perez-Rodriguez E. Cumplido J. Campo P. et al.HLA-DRB1*15:01 allele protects from asthma susceptibility.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 1201-1203Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Google Scholar Three significantly associated SNPs were observed after Bonferroni correction (P ≤ 1.8 × 10−4). Two intronic SNPs, rs77820417 and rs78442149, in perfect linkage disequilibrium (LD; r2 = 1) and with MAFs of 9% showed the most significant associations (for both SNPs: odds ratio [OR] of 2.71 [95% CI, 1.79-4.11] for the minor allele, P = 2.78 × 10−6; Fig 1 and see Table E4 in this article's Online Repository at www.jacionline.org). We followed up SNP rs77820417 for replication in 4 independent studies. Association was significant in GOAM (OR, 2.32; 95% CI, 1.23-4.36; P = 4.17 × 10−3), GALA I (OR, 1.73; 95% CI, 1.03-2.93; P = .040), and GALA II (OR, 1.31; 95% CI, 1.05-1.64; P = .019) but not GOA II (OR, 0.88; 95% CI, 0.48-1.61; P = .669). Because of the heterogeneity of effects among studies (P = .007, Cochran Q test), a random-effects meta-analysis of the 7869 subjects was performed, confirming the strong association of rs77820417 with asthma susceptibility (OR, 1.66; 95% CI, 1.14-2.42; P = 1.57 × 10−7; Table I). We further explored the association of rs77820417 with asthma exacerbations in the GALA II study, as defined by the presence of 1 or more asthma-related events (hospitalizations, emergency department visits, and oral steroid use) over the 12 months before recruitment and adjusting for the use of medication during the same period. The A allele, which is associated with asthma risk, was also associated with increased risk of asthma exacerbations (OR, 1.80; 95% CI, 1.08-2.99; P = .023). The associated SNP is located within the MYLK gene region encoding the smMLCK isoform, which participates in smooth muscle cell contractility. smMLCK activation is a critical step in cytoskeletal rearrangement, providing dynamic regulation of cell shape, cell motility, and adhesion, which are involved in the remodeling processes underlying asthma.7Garcia J.G. Lazar V. Gilbert-McClain L.I. Gallagher P.J. Verin A.D. Myosin light chain kinase in endothelium: molecular cloning and regulation.Am J Respir Cell Mol Biol. 1997; 16: 489-494Crossref PubMed Scopus (174) Google ScholarTable ISummary of association testing of rs77820417 with asthma susceptibilityStudySample size (cases/control subjects)MAFOR (95% CI)P valueGOA I1864 (606/1258)0.0902.71 (1.79-4.11)2.78 × 10−6GOA II785 (248/537)0.0840.88 (0.48-1.61).669GOAM570 (320/250)0.0522.32 (1.23-4.36)4.17 × 10−3GALA I876 (529/347)0.0731.73 (1.03-2.93).040GALA II3774 (1893/1881)0.0441.31 (1.05-1.64).019Meta-analysis7869 (3596/4273)—1.66 (1.14-2.42)1.57 × 10−7P values of .05 or less, indicating statistical significance, are shown in boldface. Open table in a new tab P values of .05 or less, indicating statistical significance, are shown in boldface. To date, GWASs have firmly identified susceptibility genes underlying asthma risk, although most of the studies were performed by using HapMap-based inferences, where the coverage for genetic variation is limited compared with the information provided by the 1000 Genomes Project (1KGP). In fact, neither the top hit observed in the current study nor its proxy (rs78442149) were tested for association in the GABRIEL (http://www.cng.fr/gabriel/results.html) or EVE consortia, the largest GWAS meta-analyses in asthma performed in Europeans8Moffatt M.F. Gut I.G. Demenais F. Strachan D.P. Bouzigon E. Heath S. et al.A large-scale, consortium-based genomewide association study of asthma.N Engl J Med. 2010; 363: 1211-1221Crossref PubMed Scopus (1508) Google Scholar and multiethnic groups.9Torgerson D.G. Ampleford E.J. Chiu G.Y. Gauderman W.J. Gignoux C.R. Graves P.E. et al.Meta-analysis of genome-wide association studies of asthma in ethnically diverse North American populations.Nat Genet. 2011; 43: 887-892Crossref PubMed Scopus (628) Google Scholar No other variants from 1KGP are in moderate LD with those 2 SNPs (highest r2 = 0.25). However, 1 MYLK variant was associated with asthma in the GABRIEL consortium (rs7633133, P = 1.01 × 10−7; Fig 1). This SNP shows an MAF of 1% in 1KGP European subjects and therefore was not tested in our study. In the EVE consortium, although no MYLK SNP showed an outstanding significance (minimum P = .01, Fig 1), a 4-fold enrichment of significant associations was observed in Latino subjects (P = 7.03 × 10−5, Fisher exact test) but not in European or African American subjects (P = .720 and P = 1.0, respectively; see Table E5 and the Methods section in this article's Online Repository at www.jacionline.org). One striking aspect of our study is the large effect sizes found for the association of rs77820417 with asthma susceptibility and exacerbations, which is only comparable with the effect reported for an SNP in GSDMB with early childhood asthma with severe exacerbations.10Bonnelykke K. Sleiman P. Nielsen K. Kreiner-Moller E. Mercader J.M. Belgrave D. et al.A genome-wide association study identifies CDHR3 as a susceptibility locus for early childhood asthma with severe exacerbations.Nat Genet. 2014; 46: 51-55Crossref PubMed Scopus (409) Google Scholar However, this effect size might be confounded by the large sex and age differences among cases and control subjects in the discovery sample. Despite this, the validation across multiple studies of both children and adults with different sex balance suggests that the result from the discovery study is not a false-positive result. The catalog of asthma susceptibility genes could be more comprehensive if imputation based on 1KGP data were exploited to meta-analyze existing GWAS data. In addition, analysis of diverse populations also contributes with new susceptibility loci because many GWAS hits are not transferable to all populations.4Galanter J.M. Gignoux C.R. Torgerson D.G. Roth L.A. Eng C. Oh S.S. et al.Genome-wide association study and admixture mapping identify different asthma-associated loci in Latinos: the Genes-environments & Admixture in Latino Americans study.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 295-305Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (11) Google Scholar In fact, higher North African ancestry is detected in southwestern Europe and is decreased in northern latitudes.11Botigue L.R. Henn B.M. Gravel S. Maples B.K. Gignoux C.R. Corona E. et al.Gene flow from North Africa contributes to differential human genetic diversity in southern Europe.Proc Natl Acad Sci U S A. 2013; 110: 11791-11796Crossref PubMed Scopus (131) Google Scholar Therefore novel susceptibility loci for asthma could be revealed in populations of Spanish descent. In summary, we identified an MYLK SNP association with asthma in subjects of Spanish descent, showing suggestive genome-wide significance. Future studies will be needed to confirm its importance in other populations. We thank Servicio de Apoyo Informático a la Investigación, ULL (SAII) for the HPC support; the GALA investigators, recruiters, participants, and study coordinators; and the EVE consortium for granting access to summary data. This study was conducted by using 5 case-control studies with unrelated subjects reporting at least 4 grandparents of Spanish or Latino origin. Demographic and clinical data are summarized in Tables E1 and E2 for the Spanish and Latino studies, respectively. All local institutional review boards and ethics committees approved the studies, and participants/parents provided written assent/consent, respectively. This study included patients with 2 generations of Spanish descent. The group of cases included participants who fulfilled the Global Initiative for Asthma guidelines for diagnosis and classification of asthma (http://www.ginasthma.com) and were collected from respiratory medicine and allergy departments in hospitals from Spain as part of GOA I.E1Pino-Yanes M. Sanchez-Machin I. Cumplido J. Figueroa J. Torres-Galvan M.J. Gonzalez R. et al.IL-1 receptor-associated kinase 3 gene (IRAK3) variants associate with asthma in a replication study in the Spanish population.J Allergy Clin Immunol. 2012; 129 (e1-10): 573-575Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (18) Google Scholar This study included 607 patients with a physician's diagnosis of asthma who were using specific medication for asthma symptoms and were older than 5 years. We recorded basic demographic data (age, sex, and smoking habits), age at diagnosis of the disease, asthma severity, family history of asthma and allergic diseases, allergic symptoms (rhinitis, atopic dermatitis, and food and drug allergy), basal pulmonary function measurements, and medication use for symptomatic treatment. Atopy was confirmed by the presence of a positive skin prick test response (a wheal with a diameter 3 mm greater than that elicited by the saline control) to one of 7 common allergens, including dust mite, epithelium, pollen, fungi, food, latex, and others or by specific serum IgE levels of greater than 0.35 IU/mL. Allergens evaluated for specific IgE were dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides farinae, Glycyphagus species, Blomia tropicalis, Acarus siro, Tyrophagus putrescentiae, Lepidoglyphus destructor, and Euroglyphus maynei), epithelia (Felis domesticus, Canis familiaris, Equus caballus, and Oryctolagus cuniculus), pollen (Olea europaea, Salsola species, Lolium perenne, Artemisia vulgaris, Parietaria species, Platanus species, Chenopodium species, Plantago species, Rumex species, and Cupressus species), fungi (Penicillium notatum, Alternaria alternata, Aspergillus fumigatus, and Cladosporium herbarum), food (cow's milk, hen's egg, peanut, soybean, wheat, fish, shrimp, crabs, lobster, clams, oysters, mussels, banana, chestnut, and kiwi), latex, and cockroach (Blattella germanica). Control samples were obtained from the Spanish National DNA Biobank (http://www.bancoadn.org), a member of the Public Population Project in Genomics Consortium (http://www.p3gobservatory.org). After signing an informed consent form, donors self-declared general health status, physical activity, transportation and nutrition habits, employment and qualification, demographics, tobacco smoking history, alcohol consumption, genealogic information, residence, and mother's language of preference. In addition, personal and family histories of diseases, including infectious, cancerous, blood and circulatory, endocrine, mental and behavioral, respiratory (including asthma symptoms), immunologic (including allergies), bone, congenital, skin and digestive, and eye and hearing disorders, were documented. No information from medical records was incorporated or revised, and no medical testing was performed on donors. We minimized the presence of atopy among control subjects by excluding those participants self-reporting personal or family history of allergic or pulmonary diseases. We also minimized the differences in ancestry composition against cases by only including samples from patients with at least 4 grandparents born in Spain. A total of 1271 DNA samples from unrelated subjects were finally selected as controls for the discovery study. However, because the number of samples fulfilling these requirements was limited in the Spanish National DNA Biobank, the final design resulted in large differences in age and sex composition, with older age and higher proportion of male subjects among control subjects than among cases (see Table E1). Genotype data for SNPs with MAFs of 5% or greater for subjects with ancestry from northern and western Europe (CEU) were downloaded from the HapMap II project.E2Frazer K.A. Ballinger D.G. Cox D.R. Hinds D.A. Stuve L.L. Gibbs R.A. et al.A second generation human haplotype map of over 3.1 million SNPs.Nature. 2007; 449: 851-861Crossref PubMed Scopus (3621) Google Scholar We selected the region in chromosome 3 comprising hg19 positions 123329143 to 123605149 to get the full transcript of MYLK (NM_053025) and to include 2 kb of its flanking regions. Haplotypes of MYLK were reconstructed for the CEU data by using PHASE v2.1E3Stephens M. Smith N.J. Donnelly P. A new statistical method for haplotype reconstruction from population data.Am J Hum Genet. 2001; 68: 978-989Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6472) Google Scholar under default parameters. The tSNP selection was performed on haplotypes showing a frequency of 1% or greater to provide a haplotype r2 value of 0.85 or greater using the multiple-marker selection algorithm implemented in TagIT 3.03 software.E4Weale M.E. Depondt C. Macdonald S.J. Smith A. Lai P.S. Shorvon S.D. et al.Selection and evaluation of tagging SNPs in the neuronal-sodium-channel gene SCN1A: implications for linkage-disequilibrium gene mapping.Am J Hum Genet. 2003; 73: 551-565Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar The final set of tSNPs consisted of 29 SNPs. DNA extracted from blood (GFX kit; GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) or saliva (Oragene DNA; DNA GenotekInc, Ottawa, Ontario, Canada) was whole genome amplified with the Illustra GenomiPhiV2 DNA Amplification Kit (GE Healthcare, Pittsburgh, Pa). The concentration was quantified by using a SYBR Green I–based DNA quantification method (Molecular Probes, Eugene, Ore). Genotyping was performed with the iPLEX Gold assay on MassARRAY at the University of Chicago Sequencing Facility and was blind to disease status. We included duplicated samples (approximately 6%) to monitor genotyping quality. Genotype calls were performed automatically by using TYPER 3.4 software (Sequenom, San Diego, Calif). Summary quality control measures were generated by using SNPing,E5Sun X. Ma S.F. Wade M.S. Flores C. Pino-Yanes M. Moitra J. et al.Functional variants of the sphingosine-1-phosphate receptor 1 gene associate with asthma susceptibility.J Allergy Clin Immunol. 2010; 126 (e1-3): 241-249Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (35) Google Scholar and monomorphic SNPs and those that deviated from HWE within control subjects after multiple comparison adjustment (P ≤ 1.7 × 10−3 [α-corrected = .05/29]) were excluded from the analyses (see Table E2). After removing samples with genotype call rates of less than 80%, 606 cases and 1258 control subjects were retained for association testing. Ninety-three ancestry informative markers of population structure within Europe were also genotyped with the iPLEX Gold assay to reduce the risk for false-positive results, allowing correcting for major population stratification effects among European and Spanish populations.E6Pino-Yanes M. Corrales A. Basaldua S. Hernandez A. Guerra L. Villar J. et al.North African influences and potential bias in case-control association studies in the Spanish population.PLoS One. 2011; 6: e18389Crossref PubMed Scopus (24) Google Scholar, E7Price A.L. Butler J. Patterson N. Capelli C. Pascali V.L. Scarnicci F. et al.Discerning the ancestry of European Americans in genetic association studies.PLoS Genet. 2008; 4: e236Crossref PubMed Scopus (264) Google Scholar Principal component analysis with EIGENSOFT 4.2E8Price A.L. Patterson N.J. Plenge R.M. Weinblatt M.E. Shadick N.A. Reich D. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies.Nat Genet. 2006; 38: 904-909Crossref PubMed Scopus (6963) Google Scholar was used to derive the scores for the first principal component to be used as ancestry estimates in cases and control subjects. MaCH 1.0E9Li Y. Willer C.J. Ding J. Scheet P. Abecasis G.R. MaCH: using sequence and genotype data to estimate haplotypes and unobserved genotypes.Genet Epidemiol. 2010; 34: 816-834Crossref PubMed Scopus (1504) Google Scholar was used for SNP imputation by using as reference the Phase 1 data for European samples (May 2011) deposited in 1KGP.E10Abecasis G.R. Auton A. Brooks L.D. DePristo M.A. Durbin R.M. Handsaker R.E. et al.An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.Nature. 2012; 491: 56-65Crossref PubMed Scopus (5751) Google Scholar Association testing was performed by using Mach2datE9Li Y. Willer C.J. Ding J. Scheet P. Abecasis G.R. MaCH: using sequence and genotype data to estimate haplotypes and unobserved genotypes.Genet Epidemiol. 2010; 34: 816-834Crossref PubMed Scopus (1504) Google Scholar for SNPs showing MAFs of 5% or greater, ensuring that tested SNPs had good-quality imputation scores (Rsq > 0.3). Imputed variants with MAFs of less than 5% were filtered out for several reasons: (1) the selection of tSNPs was based on HapMap II information to cover variants with frequencies of 5% or greater but not rarer variants; (2) observations in diverse populations suggest that genotype imputation errors produce the greatest power reduction for rarer variantsE11Huang L. Wang C. Rosenberg N.A. The relationship between imputation error and statistical power in genetic association studies in diverse populations.Am J Hum Genet. 2009; 85: 692-698Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (56) Google Scholar; and (3) the discovery sample has low statistical power to detect associations of low-frequency variants (<5%). For example, by using Quanto (http://biostats.usc.edu/Quanto.html) and assuming an OR of 2 and a Bonferroni-corrected P value of 1.8 × 10−4, the statistical power of the discovery study was 55% for MAFs of 3%, whereas it was 87% for MAFs of 5%. Representation of association results was then performed with LocusZoom 1.1E12Pruim R.J. Welch R.P. Sanna S. Teslovich T.M. Chines P.S. Gliedt T.P. et al.LocusZoom: regional visualization of genome-wide association scan results.Bioinformatics. 2010; 26: 2336-2337Crossref PubMed Scopus (1697) Google Scholar based on LD data from hg19 deposited in 1KGP. Functional annotation on the plots was performed with UCSC Genome Browser data for dbSNP build 142. Regulatory variants were assessed with the Variant Annotation Integrator tool based on ChIP-seq experimentsE13Rosenbloom K.R. Sloan C.A. Malladi V.S. Dreszer T.R. Learned K. Kirkup V.M. et al.ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update.Nucleic Acids Res. 2013; 41: D56-D63Crossref PubMed Scopus (581) Google Scholar for 161 factors from the ENCODE Project. Multiple comparison adjustment was performed by using Bonferroni correction for the number of SNPs tested (P < 1.8 × 10−4 [α-corrected = .05/272]). SNPs with the most significant association after multiple comparisons adjustment were followed up in replication studies. GOA II included a total of 248 asthma samples collected during 2011 and 2012 from the same centers as in GOA I. Recruitment protocols of asthma cases in GOA II and GOA I were the same (including that the diagnosis of asthma was made by a physician, patients had an active use of specific medication for asthma symptoms according to severity, and their age was >5 years), and the clinical characterization of asthma and atopy was similar.E14Pino-Yanes M. Corrales A. Acosta-Herrera M. Perez-Rodriguez E. Cumplido J. Campo P. et al.HLA-DRB1*15:01 allele protects from asthma susceptibility.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 1201-1203Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6) Google Scholar Control subjects included a total of 537 DNA samples from subjects who self-reported having at least 2 generations of ancestors born in Spain and without personal or family history of chronic diseases. These subjects were obtained from the Spanish National Genotyping Center, Santiago de Compostela Node (CeGen, http://www.cegen.org), consisting of unrelated healthy adult subjects collected from hospitals across Spain by Fundacion Publica Galega de Medicina Xenomica (FPGMX, http://fundacion.xenomica.org). After signing an informed consent form, donors self-declared general health status, demographics, residence, and personal and family history of infectious, cancerous, mental, cardiovascular, or immunologic diseases were documented. No information from medical records was incorporated or revised, and no medical testing was performed on these control subjects. Samples were genome-wide genotyped on the Axiom Genome-Wide Human CEU Array (Affymetrix, Santa Clara, Calif) by using the services provided by the National Genotyping Center (CeGen), Universidad de Santiago de Compostela Node, as described elsewhere.E14Pino-Yanes M. Corrales A. Acosta-Herrera M. Perez-Rodriguez E. Cumplido J. Campo P. et al.HLA-DRB1*15:01 allele protects from asthma susceptibility.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 1201-1203Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6) Google Scholar Genotype calls were obtained simultaneously for all cases and control subjects by using the Axiom GT1 algorithm on the Affymetrix Genotyping Console (GTC), according to the manufacturer's recommendations. Quality of data was assessed for dish quality control and the metrics recommended by the manufacturer, call rate (≥95%), MAF of 1% or greater, genotype missing rate differences between cases and control subjects (P > 1 × 10−5), HWE P values of greater than 1 × 10−6 in control subjects, concordance between genetically predicted and reported sex, and showing no relatedness (PI_HAT < 0.2). A total of 484,597 variants passed all quality control filters and had 99.3% of mean genotype concordance among duplicated samples. The genomic inflation factor of this study was 1.038 adjusting for the 2 first principal components EIGENSOFT.E8Price A.L. Patterson N.J. Plenge R.M. Weinblatt M.E. Shadick N.A. Reich D. Principal components analysis corrects for stratification in genome-wide association studies.Nat Genet. 2006; 38: 904-909Crossref PubMed Scopus (6963) Google Scholar GIANT v.3 haplotypes from the integrated Phase I release of 1KGPE10Abecasis G.R. Auton A. Brooks L.D. DePristo M.A. Durbin R.M. Handsaker R.E. et al.An integrated map of genetic variation from 1,092 human genomes.Nature. 2012; 491: 56-65Crossref PubMed Scopus (5751) Google Scholar were used as references to impute untyped SNPs by using MinimacE15Howie B. Fuchsberger C. Stephens M. Marchini J. Abecasis G.R. Fast and accurate genotype imputation in genome-wide association studies through pre-phasing.Nat Genet. 2012; 44: 955-959Crossref PubMed Scopus (1223) Google Scholar for the entirety of chromosome 3, which was previously phased with SHAPEIT version 2.E16Delaneau O. Coulonges C. Zagury J.F. Shape-IT: new rapid and accurate algorithm for haplotype inference.BMC Bioinformatics. 2008; 9: 540Crossref PubMed Scopus (107) Google Scholar The SNP rs77820417 showed an imputation quality score (Rsq) of 0.39. Association testing was performed by means of logistic regression models using Mach2dat.E9Li Y. Willer C.J. Ding J. Scheet P. Abecasis G.R. MaCH: using sequence and genotype data to estimate haplotypes and unobserved genotypes.Genet Epidemiol. 2010; 34: 816-834Crossref PubMed Scopus (1504) Google Scholar GOAM consisted of 320 asthmatic cases collected from allergy departments in 2 Spanish centers from the Canary Islands and Malaga fulfilling the Global Initiative for Asthma guidelines for diagnosis and classification of asthma and 250 control subjects collected from the Department of Allergy in the Carlos Haya Hospital (Malaga, Spain).E14Pino-Yanes M. Corrales A. Acosta-Herrera M. Perez-Rodriguez E. Cumplido J. Campo P. et al.HLA-DRB1*15:01 allele protects from asthma susceptibility.J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 1201-1203Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (6) Google Scholar Asthmatic patients had physician-diagnosed disease with active specific medication for asthmatic symptoms according to severity and were 5 years or older. Patients were demographically and clinically characterized as in GOA I and GOA II. Atopy was confirmed by evaluating allergens that are common in Malaga and included dust mites (D pteronyssinus and L destructor), epithelia (F domesticus and C familiaris), pollen (O europaea, Salsola species, L perenne, Phleum pratense, A vulgaris, Parietaria species, Platanus species, Chenopodium species, Plantago species, and Cupressus species), fungi (A alternata and A fumigatus), and latex. Control subjects were ascertained for asthma and atopy while accompanying the patients at routine visits to the allergy department. These subjects were unrelated to cases and were demographically and clinically characterized for the presence of a personal or family history of asthma and atopy. Although none of these control subjects were given a diagnosis of asthma at the time of enrollment, 130 of them reported having a personal or family history of atopy. Genotyping of rs77820417 was assessed by using TaqMan allelic discrimination assays (Applied Biosystems, Foster City, Calif), with automated calls generated by using a 7500 Fast Real-Time