Iron overload diseases of genetic origin are an ever changing world, due to major advances in genetics and molecular biology. Five major categories are now established: HFE-related or type1 hemochromatosis, frequently found in Caucasians, and four rarer diseases which are type 2 (A and B) hemochromatosis (juvenile hemochromatosis), type 3 hemochromatosis (transferrin receptor 2 hemochromatosis), type 4 (A and B) hemochromatosis (ferroportin disease), and a(hypo)ceruloplasminemia. Increased duodenal iron absorption and enhanced macrophagic iron recycling, both due to an impairment of hepcidin synthesis, account for the development of cellular excess in types 1, 2, 3, and 4B hemochromatosis whereas decreased cellular iron egress is involved in the main form of type 4A) hemochromatosis and in aceruloplasminemia. Non-transferrin bound iron plays an important role in cellular iron excess and damage. The combination of magnetic resonance imaging (for diagnosing visceral iron overload) and of genetic testing has drastically reduced the need for liver biopsy. Phlebotomies remain an essential therapeutic tool but the improved understanding of the intimate mechanisms underlying these diseases paves the road for innovative therapeutic approaches.

BackgroundElevated serum ferritin levels are frequently encountered in clinical situations and once iron overload or inflammation has been ruled out, many cases remain unexplained.Genetic causes of hyperferritinemia associated to early cataract include mutations in the iron responsive element in the 5' untranslated region of the L ferritin mRNA, responsible for the hereditary hyperferritinemia cataract syndrome. Design and MethodsWe studied 91 probands with hyperferritinemia comprising 25 family cases belonging to families with at least two cases of unexplained hyperferritinemia, and 66 isolated cases.In the families, we also analyzed 30 relatives.Hyperferritinemia was considered as unexplained when transferrin saturation was below 45% and/or serum iron below 25 µmol/L and/or no tissue iron excess was detected, when inflammation had been ruled out and when iron responsive element mutation was absent.We carried out sequencing analysis of the FTL gene coding the L ferritin. ResultsA novel heterozygous p.Thr30Ile mutation in the NH2 terminus of L ferritin subunit was identified in 17 probands out of the cohort.The mutation was shown to cosegregate with hyperferritinemia in all the 10 families studied.No obvious clinical symptom was found associated with the presence of the mutation.This unique mutation is associated with an unusually high percentage of ferritin glycosylation. ConclusionsThis missense mutation of FTL represents a new cause of genetic hyperferritinemia without iron overload.We hypothesized that the mutation increases the efficacy of L ferritin secretion by increasing the hydrophobicity of the N terminal "A" α helix.

Hereditary hemochromatosis is a heterogeneous group of genetic disorders characterized by parenchymal iron overload. It is caused by defective expression of liver hepcidin, the main regulator of iron homeostasis. Iron stimulates the gene encoding hepcidin (HAMP) via the bone morphogenetic protein (BMP)6 signaling to SMAD. Although several genetic factors have been found to cause late-onset hemochromatosis, many patients have unexplained signs of iron overload. We investigated BMP6 function in these individuals.We sequenced the BMP6 gene in 70 consecutive patients with a moderate increase in serum ferritin and liver iron levels who did not carry genetic variants associated with hemochromatosis. We searched for BMP6 mutations in relatives of 5 probands and in 200 healthy individuals (controls), as well as in 2 other independent cohorts of hyperferritinemia patients. We measured serum levels of hepcidin by liquid chromatography-tandem mass spectrometry and analyzed BMP6 in liver biopsy specimens from patients by immunohistochemistry. The functions of mutant and normal BMP6 were assessed in transfected cells using immunofluorescence, real-time quantitative polymerase chain reaction, and immunoblot analyses.We identified 3 heterozygous missense mutations in BMP6 (p.Pro95Ser, p.Leu96Pro, and p.Gln113Glu) in 6 unrelated patients with unexplained iron overload (9% of our cohort). These mutations were detected in less than 1% of controls. p.Leu96Pro also was found in 2 patients from the additional cohorts. Family studies indicated dominant transmission. Serum levels of hepcidin were inappropriately low in patients. A low level of BMP6, compared with controls, was found in a biopsy specimen from 1 patient. In cell lines, the mutated residues in the BMP6 propeptide resulted in defective secretion of BMP6; reduced signaling via SMAD1, SMAD5, and SMAD8; and loss of hepcidin production.We identified 3 heterozygous missense mutations in BMP6 in patients with unexplained iron overload. These mutations lead to loss of signaling to SMAD proteins and reduced hepcidin production. These mutations might increase susceptibility to mild-to-moderate late-onset iron overload.

Iron disorders of genetic origin are mainly composed of iron overload diseases, the most frequent being HFE-related hemochromatosis. Hepcidin deficiency underlies iron overload in HFE-hemochromatosis as well as in several other genetic iron excess disorders, such as hemojuvelin or hepcidin-related hemochromatosis and transferrin receptor 2-related hemochromatosis. Deficiency of ferroportin, the only known cellular protein iron exporter, produces iron overload in the typical form of ferroportin disease. By contrast, genetically enhanced hepcidin production, as observed in matriptase-2 deficiency, generates iron-refractory iron deficiency anemia. Diagnosis of these iron storage disorders is usually established noninvasively through combined biochemical, imaging and genetic approaches. Moreover, improved knowledge of the molecular mechanisms accounting for the variations of iron stores opens the way of novel therapeutic approaches aiming to restore normal iron homeostasis. In this review, we will summarize recent findings about these various genetic entities that have been identified owing to an exemplary interplay between clinicians and basic scientists.

Background & AimsFerroportin disease is characterized by iron overload. It has an autosomal-dominant pattern of inheritance and has been associated with mutations in the SLC40A1 gene, which encodes the cellular iron exporter ferroportin. Since the first description in 2001, about 30 mutations have been reported; the heterogeneity of ferroportin disease phenotypes has led to the hypothesis that the nature of the mutation affects the function of the protein in different ways. We studied genotypes and phenotypes of a large cohort of patients with ferroportin disease.MethodsWe studied clinical, biochemical, imaging, histologic, and genetic data from 70 affected subjects from 33 families with 19 mutations.ResultsWe found that ferroportin disease, at the time of diagnosis, has limited consequences in the absence of cofactors. Data indicated that transferrin saturation, which correlated with fibrosis and levels of alanine aminotransferase, might be a marker of disease severity. Although the study was performed in a large number of families, we observed incomplete penetrance and no correlation between genotypes and phenotypes.ConclusionsMembers of families with ferroportin disease should be screened for biochemical parameters of iron metabolism as well as genotype to detect silent mutations that might cause disease with acquired or genetic cofactors. Patients should be followed up long term to identify potential complications of the disease. Ferroportin disease is characterized by iron overload. It has an autosomal-dominant pattern of inheritance and has been associated with mutations in the SLC40A1 gene, which encodes the cellular iron exporter ferroportin. Since the first description in 2001, about 30 mutations have been reported; the heterogeneity of ferroportin disease phenotypes has led to the hypothesis that the nature of the mutation affects the function of the protein in different ways. We studied genotypes and phenotypes of a large cohort of patients with ferroportin disease. We studied clinical, biochemical, imaging, histologic, and genetic data from 70 affected subjects from 33 families with 19 mutations. We found that ferroportin disease, at the time of diagnosis, has limited consequences in the absence of cofactors. Data indicated that transferrin saturation, which correlated with fibrosis and levels of alanine aminotransferase, might be a marker of disease severity. Although the study was performed in a large number of families, we observed incomplete penetrance and no correlation between genotypes and phenotypes. Members of families with ferroportin disease should be screened for biochemical parameters of iron metabolism as well as genotype to detect silent mutations that might cause disease with acquired or genetic cofactors. Patients should be followed up long term to identify potential complications of the disease.

Hereditary hemochromatosis (HH) is the most common form of genetic iron loading disease. It is mainly related to the homozygous C282Y/C282Y mutation in the HFE gene that is, however, a necessary but not a sufficient condition to develop clinical and even biochemical HH. This suggests that modifier genes are likely involved in the expressivity of the disease. Our aim was to identify such modifier genes.We performed a genome-wide association study (GWAS) using DNA collected from 474 unrelated C282Y homozygotes. Associations were examined for both quantitative iron burden indices and clinical outcomes with 534,213 single nucleotide polymorphisms (SNP) genotypes, with replication analyses in an independent sample of 748 C282Y homozygotes from four different European centres.One SNP met genome-wide statistical significance for association with transferrin concentration (rs3811647, GWAS p value of 7×10(-9) and replication p value of 5×10(-13)). This SNP, located within intron 11 of the TF gene, had a pleiotropic effect on serum iron (GWAS p value of 4.9×10(-6) and replication p value of 3.2×10(-6)). Both serum transferrin and iron levels were associated with serum ferritin levels, amount of iron removed and global clinical stage (p<0.01). Serum iron levels were also associated with fibrosis stage (p<0.0001).This GWAS, the largest one performed so far in unselected HFE-associated HH (HFE-HH) patients, identified the rs3811647 polymorphism in the TF gene as the only SNP significantly associated with iron metabolism through serum transferrin and iron levels. Because these two outcomes were clearly associated with the biochemical and clinical expression of the disease, an indirect link between the rs3811647 polymorphism and the phenotypic presentation of HFE-HH is likely.

Mortality studies in patients with hemochromatosis give conflicting results especially with respect to extrahepatic causes of death. Our objective was to assess mortality and causes of death in a cohort of patients homozygous for the C282Y mutation in the HFE gene, diagnosed since the availability of HFE testing.We studied 1085 C282Y homozygotes, consecutively diagnosed from 1996 to 2009, and treated according to current recommendations. Mortality and causes of death were obtained from death certificates and compared to those of the general population. Standardized mortality ratios (SMRs) were used to assess specific causes of death and the Cox model was used to identify prognostic factors for death.Patients were followed for 8.3±3.9 years. Overall the SMR was the same as in the general population (0.94 CI: 0.71-1.22). Patients with serum ferritin⩾2000 μg/L had increased liver-related deaths (SMR: 23.9 CI: 13.9-38.2), especially due to hepatic cancer (SMR: 49.1 CI: 24.5-87.9). Patients with serum ferritin between normal and 1000 μg/L had a lower mortality than the general population (SMR: 0.27 CI: 0.1-0.5), due to a decreased mortality, related to reduced cardiovascular events and extrahepatic cancers in the absence of increased liver-related mortality. Age, diabetes, alcohol consumption, and hepatic fibrosis were independent prognostic factors of death.In treated HFE hemochromatosis, only patients with serum ferritin higher than 2000 μg/L have an increased mortality, mainly related to liver diseases. Those with mild iron burden have a decreased overall mortality in relation to reduced cardiovascular and extrahepatic cancer-related events. These results support a beneficial effect of early and sustained management of patients with iron excess, even when mild.

DMT1 is a transmembrane iron transporter involved in iron duodenal absorption and cellular iron uptake. Mutations in the human SLC11A2 gene coding DMT1 lead to microcytic anemia and hepatic iron overload, with unexpectedly low levels of plasma ferritin in the presence of iron stores.We report a patient with a similar phenotype due to two mutations in the SLC11A2 gene, the known p.Gly212Val (G212V) mutation and a novel one, p.Asn491Ser (N491S). To assess the expression of DMT1 in human liver, we studied the expression of the four DMT1 mRNA isoforms by real-time quantitative PCR in control human liver samples. We also studied the effect of G212V and N491S DMT1 mutations on RNA splicing in blood leukocytes and cellular trafficking of dsRed2-tagged-DMT1 protein in the human hepatic cell line HuH7.Our results showed that i) only the isoforms 1B-IRE and 1B-nonIRE were significantly expressed in human liver; ii) the G212V mutation did not seem to affect mRNA splicing and the N491S mutation induced a splicing alteration leading to a truncated protein, which seemed quantitatively of low relevance; and iii) the N491S mutation, in contrast to the G212V mutation, led to abnormal protein trafficking.Our data confirm the major role of DMT1 in the maintenance of iron homeostasis in humans and demonstrate that the N491S mutation, through its deleterious effect on protein trafficking, contributes together with the G212V mutation to the development of anemia and hepatic iron overload.

Ferroportin (FPN) mediates iron export from cells and this function is modulated by serum hepcidin. Mutations in the FPN gene (SLC40A1) lead to autosomal dominant iron overload diseases related either to loss or to gain of function, and usually characterized by normal or low transferrin saturation versus elevated transferrin saturation, respectively. However, for the same mutation, the phenotypic expression may vary from one patient to another. Using in vitro overexpression of wild-type or mutant FPN proteins, we characterized the functional impact of five recently identified FPN gene mutations regarding FPN localization, cell iron status, and hepcidin sensitivity. Our aim was to integrate functional results and biological findings in probands and relatives. We show that while the p.Arg371Gln (R371Q) mutation had no impact on studied parameters, the p.Trp158Leu (W158L), p.Arg88Gly (R88G), and p.Asn185Asp (N185D) mutations caused an iron export defect and were classified as loss-of-function mutations. The p.Gly204Ser (G204S) mutation induced a gain of FPN function. Functional studies are useful to determine whether or not a FPN gene mutation found in an iron overloaded patient is deleterious and to characterize its biological impact, especially when family studies are not fully informative and/or additional confounding factors may affect bio-clinical expression.

Rare genetic iron overload diseases are an evolving field due to major advances in genetics and molecular biology. Genetic iron overload has long been confined to the classical type 1 hemochromatosis related to the HFE C282Y mutation. Breakthroughs in the understanding of iron metabolism biology and molecular mechanisms led to the discovery of new genes and subsequently, new types of hemochromatosis. To date, four types of hemochromatosis have been identified: HFE-related or type1 hemochromatosis, the most frequent form in Caucasians, and four rare types, named type 2 (A and B) hemochromatosis (juvenile hemochromatosis due to hemojuvelin and hepcidin mutation), type 3 hemochromatosis (related to transferrin receptor 2 mutation), and type 4 (A and B) hemochromatosis (ferroportin disease). The diagnosis relies on the comprehension of the involved physiological defect that can now be explored by biological and imaging tools, which allow non-invasive assessment of iron metabolism. A multidisciplinary approach is essential to support the physicians in the diagnosis and management of those rare diseases.