A highly virulent clonal population of Aeromonas hydrophila (vAh) has been the cause of recent motile Aeromonas septicemia epizootic in channel catfish (Ictalurus punctatus) farms in the Southeastern United States. The pathology of the disease caused by vAh has not been studied well yet. Thus, our aim was to determine histopathological and ultrastructural changes in channel catfish following vAh challenge. To accomplish this, catfish fingerlings were challenged with vAh (strain ML09-119) by bath. Six fish per each time point were collected at 1, 3, 5, 6, 24, and 48 h for light microscopy, and six fish were collected at 48 h for transmission electron microscopy (TEM). The first pathological lesions were detected in the spleen and stomach at 1 h post-challenge (HPC) while intestine, gills, kidney, and liver lesions were observed at 24 and 48 HPC. Histopathological examination revealed degenerative changes, necrosis, extensive edema, and inflammation in internal organs. The TEM showed severe tissue destruction with multiple bacterial cells secreting outer membrane vesicles, especially in spleen and gills and far number in the stomach. Degenerated bacterial cells were observed in the intestinal lumen and the phagosomes of phagocytic kidney cells. We identified, for the first time, degranulate eosinophilic granular cells, and dendritic cells like (DC-like) cells in the necrotic intestinal epithelium. These findings suggest that vAh rapidly proliferated and spread through the catfish organs following bath challenge.

Aeromonas veronii is a gram-negative species abundant in aquatic environments that causes disease in humans as well as terrestrial and aquatic animals. In the current study, 41 publicly available A. veronii genomes were compared to investigate distribution of putative virulence genes, global dissemination of pathotypes, and potential mechanisms of virulence. The complete genome of A. veronii strain ML09-123 from an outbreak of motile aeromonas septicemia in farm-raised catfish in the southeastern United States was included. Dissemination of A. veronii strain types was discovered in dispersed geographical locations. Isolate ML09-123 is highly similar to Chinese isolate TH0426, suggesting the two strains have a common origin and may represent a pathotype impacting aquaculture in both countries. Virulence of strain ML09-123 in catfish in a dose-dependent manner was confirmed experimentally. Subsystem category disposition showed the majority of genomes exhibit similar distribution of genomic elements. The type I secretion system (T1SS), type II secretion system (T2SS), type 4 pilus (T4P), and flagellum core elements are conserved in all A. veronii genomes, whereas the type III secretion system (T3SS), type V secretion system (T5SS), type VI secretion system (T6SS), and tight adherence (TAD) system demonstrate variable dispersal. Distribution of mobile elements is dependent on host and geographic origin, suggesting this species has undergone considerable genetic exchange. The data presented here lends insight into the genomic variation of A. veronii and identifies a pathotype impacting aquaculture globally.

A virulent clonal population of Aeromonas hydrophila (VAh) is recognized as the etiological agent in outbreaks of motile aeromonas septicemia (MAS) in catfish aquaculture in the southeastern United States since 2009. Genomic subtraction revealed three outer membrane proteins present in VAh strain ML09-119 but not in low virulence reference A. hydrophila strains: major outer membrane protein OmpA1, TonB-dependent receptor (Tdr), and transferrin-binding protein A (TbpA). Here, the genes encoding ompA1, tdr, and tbpA were cloned from A. hydrophila ML09-119 and expressed in Escherichia coli. The purified recombinant OmpA1, Tdr, and TbpA proteins had estimated molecular weights of 37.26, 78.55, and 41.67 kDa, respectively. Catfish fingerlings vaccinated with OmpA1, Tdr, and TbpA emulsified with non-mineral oil adjuvant were protected against subsequent VAh strain ML09-119 infection with 98.59%, 95.59%, and 47.89% relative percent survival (RPS), respectively. Furthermore, the mean liver, spleen, and anterior kidney bacterial concentrations were significantly lower in catfish vaccinated with the OmpA1 and Tdr than the sham-vaccinated control group. ELISA demonstrated that catfish immunized with OmpA1, Tdr, and TbpA produce significant antibody response by 21 days post-immunization. Therefore, OmpA1 and Tdr proteins could be used as potential candidates for vaccine development against virulent A. hydrophila infection. However, TbpA protein failed to provide strong protection.

Aeromonas veronii is a Gram-negative species ubiquitous in different aquatic environments and capable of causing a variety of diseases to a broad host range. Aeromonas species have the capability to carry and acquire antimicrobial resistance (AMR) elements, and currently multidrug resistant (MDR) Aeromonas isolates are commonly found across the world. A. veronii strain MS-17-88 is a MDR strain isolated from catfish in the southeastern United States. The present study was undertaken to uncover the mechanism of resistance in MDR A. veronii strain MS-17-88 through the detection of genomic features. To achieve this, genomic DNA was extracted, sequenced, and assembled. The A. veronii strain MS-17-88 genome comprised 5,178,226-bp with 58.6% G+C, and it encoded several AMR elements, including imiS, ampS, mcr-7.1, mcr-3, catB2, catB7, catB1, floR, vat(F), tet(34), tet(35), tet(E), dfrA3, and tetR. The phylogeny and resistance profile of a large collection of A. veronii strains, including MS-17-88, were evaluated. Phylogenetic analysis showed a close relationship between MS-17-88 and strain Ae5 isolated from fish in China and ARB3 strain isolated from pond water in Japan, indicating a common ancestor of these strains. Analysis of phage elements revealed 58 intact, 63 incomplete, and 15 questionable phage elements among the 53 A. veronii genomes. The average phage element number is 2.56 per genome, and strain MS-17-88 is one of two strains having the maximum number of identified prophage elements (6 elements each). The profile of resistance against various antibiotics across the 53 A. veronii genomes revealed presence of tet(34), mcr-7.1, mcr-3, and dfrA3 in all genomes (100%). By comparison, sul1 and sul2 were detected in 7.5% and 1.8% of A. veronii genomes. Nearly 77% of strains carried tet(E), and 7.5% of strains carried floR. This result suggested a low abundance and prevalence of sulfonamide and florfenicol resistance genes compared with tetracycline resistance among A. veronii strains. Overall, the present study provides insights into the resistance patterns among 53 A. veronii genomes, which can inform therapeutic options for fish affected by A. veronii.

Edwardsiella ictaluri is a Gram-negative facultative intracellular pathogen causing enteric septicemia of channel catfish (ESC). The disease causes considerable economic losses in the commercial catfish industry in the United States. Although antibiotics are used as feed additive, vaccination is a better alternative for prevention of the disease. Here we report the development and characterization of novel live attenuated E. ictaluri mutants. To accomplish this, several tricarboxylic acid cycle (sdhC, mdh, and frdA) and one-carbon metabolism genes (gcvP and glyA) were deleted in wild type E. ictaluri strain 93-146 by allelic exchange. Following bioluminescence tagging of the E. ictaluri ΔsdhC, Δmdh, ΔfrdA, ΔgcvP, and ΔglyA mutants, their dissemination, attenuation, and vaccine efficacy were determined in catfish fingerlings by in vivo imaging technology. Immunogenicity of each mutant was also determined in catfish fingerlings. Results indicated that all of the E. ictaluri mutants were attenuated significantly in catfish compared to the parent strain as evidenced by 2,265-fold average reduction in bioluminescence signal from all the mutants at 144 h post-infection. Catfish immunized with the E. ictaluri ΔsdhC, Δmdh, ΔfrdA, and ΔglyA mutants had 100% relative percent survival (RPS), while E. ictaluri ΔgcvP vaccinated catfish had 31.23% RPS after re-challenge with the wild type E. ictaluri.

Edwardsiella ictaluri is a Gram-negative facultative intracellular pathogen causing enteric septicemia in channel catfish. Iron is an essential micronutrient needed for bacterial virulence, and to acquire iron, many Gram-negative bacteria secrete ferric iron chelating siderophores. The ferric hydroxamate uptake (Fhu) system consists of four genes (fhuC, fhuD, fhuB, and fhuA), and is involved in the uptake of hydroxamate type siderophores across bacterial membranes. However, the Fhu system and its importance in E. ictaluri virulence have been uninvestigated. Here, we present construction and evaluation of an E. ictaluri ΔfhuC mutant. The E. ictaluri fhuC gene was deleted in-frame by allelic exchange, and the mutant's growth in media and virulence in catfish were determined. Our results indicated that deletion of the E. ictaluri fhuC gene did not affect the growth of E. ictaluri largely in both iron-replete and iron-depleted media. Addition of ferric iron sources into the iron-depleted medium improved the growth of both E. ictaluri ΔfhuC and wild type (WT). Catfish mortalities indicated that E. ictaluri ΔfhuC mutant was attenuated 2.05-fold compared with the parent strain. The catfish immunized with the E. ictaluri ΔfhuC mutant showed a high relative percent survival rate (97.50%) after re-challenge with the WT E. ictaluri strain. Taken together, our data indicates that the fhuC gene contributes to E. ictaluri virulence.

Although several plasmids have been used in Listeria monocytogenes for generating mutants by allelic exchange, construction of L. monocytogenes mutants has been inefficient due to lack of effective selection markers for first and second recombination events. To address this problem, we have developed a new suicide plasmid, pHoss1, by using the pMAD plasmid backbone and anhydrotetracycline selection marker (secY antisense RNA) driven by an inducible Pxyl/tetO promoter. Expression of the secY antisense RNA eliminates merodiploids and selects for the loss of plasmid via a second allelic exchange, which enriches the number of mutants with deleted genes. To assess the effectiveness of pHoss1 for the generation of stable in-frame deletion mutations, we deleted the ispG and ispH genes of L. monocytogenes serotype 4b strain F2365. Results showed that identification of the second allelic exchange mutants was very efficient with 80–100% of the colonies yielding desired deletion mutants. L. monocytogenes' intestinal cell attachment was not altered when ispG and ispH genes were deleted. We expect that this new plasmid will be very useful for construction of marker-free deletion mutants in L. monocytogenes and in other Gram-positive bacteria, including Staphylococcus aureus and Bacillus cereus.

Edwardsiella ictaluri is a Gram-negative intracellular pathogen causing enteric septicemia of channel catfish (ESC). Type six secretion system (T6SS) is a sophisticated nanomachine that delivers effector proteins into eukaryotic host cells as well as other bacteria. In the current work, we in-frame deleted the E. ictalurievpB gene located in the T6SS operon by allelic exchange. The safety and efficacy of EiΔevpB as well as Aquavac-ESC, a commercial vaccine manufactured by Intervet/Merck Animal Health, were evaluated in channel catfish (Ictalurus punctatus) fingerlings and fry by immersion exposure. Our results showed that the EiΔevpB strain was avirulent and fully protective in catfish fingerlings. The EiΔevpB strain was also safe in catfish fry, and immersion vaccination with EiΔevpB at doses 106 and 107 CFU/ml in water resulted in 34.24 and 80.34% survival after wild-type immersion challenge compared to sham-vaccinated fry (1.79% survival). Catfish fry vaccinated with EiΔevpB at doses 106, 107, and 108 CFU/ml in water exhibited dose-dependent protection. When compared with Aquavac-ESC, EiΔevpB provided significantly higher protection in catfish fingerlings and fry (p < 0.05). Results indicate that the EiΔevpB strain is safe and can be used to protect catfish fingerlings and fry against E. ictaluri.

Edwardsiella ictaluri (E. ictaluri), a Gram-negative, intracellular, facultative bacterium, is the causative agent of enteric septicemia of catfish (ESC), which is one of the most significant diseases of farmed channel catfish. Macrophages have a critical role in major defense mechanisms against bacterial infections by migrating to the site of infection, engulfing and killing pathogens, and priming adaptive immune responses. Vaccination of catfish with E. ictaluri live, attenuated vaccine (LAV) strains increased the efficiency of phagocytosis and bacterial killing in catfish peritoneal macrophages compared in vitro with macrophages from non-vaccinated fish. Recently, our group developed several protective LAV strains from E. ictaluri. However, their effects on the antigen uptake and bacterial killing in catfish macrophages have not been evaluated. In this study, we assessed the phagocytic and bactericidal activity of peritoneal macrophages in the uptake of E. ictaluri wild-type (WT) and two LAV strains. We found that phagocytosis of LAV strains was significantly higher compared to their WT counterpart in peritoneal macrophages. Moreover, the uptake of E. ictaluri opsonized with sera from vaccinated catfish was more efficient than when opsonized with sera from sham vaccinated fish. Notably, catfish macrophages did not lose their phagocytic properties at 4o C, as described previously in mammalian and zebrafish models. Also, opsonization of E. ictaluri with inactivated (IN) sera from vaccinated and sham vaccinated catfish decreased significantly phagocytic uptake of bacteria at 32o C, and virtually suppressed endocytosis at 4o C, suggesting the important role of complement-dependent mechanisms in catfish macrophage phagocytosis. In conclusion, our data on enhanced phagocytic capacity and effective killing ability in macrophages of vaccine strains suggested the LAVs' advantage if processed and presented in the form of peptides to specific lymphocytes of an adaptive immune system and emphasize the importance of macrophage-mediated immunity against ESC. Furthermore, we showed the role of complement- dependent mechanisms in the phagocytic uptakes of E. ictaluri in catfish peritoneal macrophages at 4oC and 32oC. Finally, LAV vaccine-induced bacterial phagocytosis and killing properties of peritoneal macrophages emphasized the importance of the innate immune responses in ESC.

Using molecular subtyping techniques, Listeria monocytogenes is divided into three major phylogenetic lineages, and a multiplex PCR method can differentiate five L. monocytogenes subgroups: 1/2a-3a, 1/2c-3c, 1/2b-3b-7, 4b-4d-4e and 4a-4c. In this study, we conducted genome comparisons and evaluated serotype-associated genes for their utility as a multiplex PCR-based method for distinguishing high-risk serotypes 1/2a and 1/2c in lineage I from low-risk serotypes 3a and 3c.Primer sets were developed that are specific for serotype 1/2c (LMOSLCC2372_0308) and serotype 3a (LMLG_0742). These primers were then tested in a multiplex format with primers specific for serotype 1/2a (flaA) to separate serotypes 1/2a, 1/2c, 3a and 3c using 25 strains of lineage I L. monocytogenes.Here, for the first time, we report primers specific for L. monocytogenes serotype 1/2c and serotype 3a, and we demonstrate a multiplex PCR method for separating the four serotypes of lineage I L. monocytogenes.The described multiplex PCR assay consistently showed successful separation of 1/2a and 1/2c strains from 3a and 3c strains. PCR is routinely performed in many diagnostic and epidemiologic investigations for L. monocytogenes, and these primers should increase the feasibility and accessibility of L. monocytogenes serotyping.