Summary

 The circadian clock coordinates behavioral and circadian cues with availability and utilization of nutrients. Proteasomal degradation of clock repressors, such as cryptochrome (CRY)1, maintains periodicity. Whether macroautophagy, a quality control pathway, degrades circadian proteins remains unknown. Here we show that circadian proteins BMAL1, CLOCK, REV-ERBα, and CRY1 are lysosomal targets, and that macroautophagy affects the circadian clock by selectively degrading CRY1. Autophagic degradation of CRY1, an inhibitor of gluconeogenesis, occurs in a diurnal window when rodents rely on gluconeogenesis, suggesting that CRY1 degradation is time-imprinted to maintenance of blood glucose. High-fat feeding accelerates autophagic CRY1 degradation and contributes to obesity-associated hyperglycemia. CRY1 contains several light chain 3 (LC3)-interacting region (LIR) motifs, which facilitate the interaction of cargo proteins with the autophagosome marker LC3. Using mutational analyses, we identified two distinct LIRs on CRY1 that exert circadian glycemic control by regulating CRY1 degradation, revealing LIRs as potential targets for controlling hyperglycemia.

RNA polymerase (Pol) III synthesizes abundant short noncoding RNAs that have essential functions in protein synthesis, secretion, and other processes. Despite the ubiquitous functions of these RNAs, mutations in Pol III subunits cause Pol III-related leukodystrophy, an early-onset neurodegenerative disease. The basis of this neural sensitivity and the mechanisms of disease pathogenesis are unknown. Here we show that mice expressing pathogenic mutations in the largest Pol III subunit, Polr3a, specifically in Olig2-expressing cells, have impaired growth and developmental delay, deficits in cognitive, sensory, and fine sensorimotor function, and hypomyelination in multiple regions of the cerebrum and spinal cord. These phenotypes reflect a subset of clinical features seen in patients. In contrast, the gross motor defects and cerebellar hypomyelination that are common features of severely affected patients are absent in the mice, suggesting a relatively mild form of the disease in this conditional model. Our results show that disease pathogenesis in the mice involves defects that reduce both the number of mature myelinating oligodendrocytes and the ability of these cells to produce a myelin sheath of normal thickness. The findings suggest unique sensitivities of oligodendrogenesis and myelination to perturbations of Pol III transcription.

Abstract RNA polymerase (Pol) III synthesizes abundant short non-coding RNAs that have essential functions in protein synthesis, secretion and other processes. Despite the ubiquitous functions of these RNAs, mutations in Pol III subunits cause Pol III-related leukodystrophy, an early-onset neurodegenerative disease. The basis of this neural sensitivity and the mechanisms of disease pathogenesis are unknown. Here we show that mice expressing pathogenic mutations in the largest Pol III subunit, Polr3a , specifically in Olig2-expressing cells, have impaired growth and developmental delay, deficits in cognitive, sensory and fine sensorimotor function, and hypomyelination in multiple regions of the cerebrum and spinal cord. In contrast, the gross motor defects and cerebellar hypomyelination that are common features of severely affected patients are absent in the mice, suggesting a relatively mild form of the disease in this conditional model. Our results show that disease pathogenesis in the mice involves defects that reduce both the number of mature myelinating oligodendrocytes and the ability of these cells to produce a myelin sheath of normal thickness. Thus, the findings suggest cell-specific roles for Pol III in the development and/or survival of oligodendrocytes as well as their function in myelination. Significance Statement Pathogenic mutations in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a prevalent autosomal recessive form of leukodystrophy. However, understanding of the mechanisms of pathogenesis, including how ubiquitously-expressed Pol III mutations affect primarily the central nervous system, has been limited by the absence of an animal model of the disease. We show that conditional knock-in of pathogenic Polr3a mutations in the Olig2 lineage in mice results in growth, neurobehavioral and hypomyelination phenotypes reflecting a subset of clinical features of Pol III-related leukodystrophy patients. Myelination defects in the mice identify neural-specific roles for Pol III transcription. The phenotypes of Pol III-related leukodystrophic mice enable genetic and pharmacological approaches aimed at mitigating the consequences of this disease in humans.

Summary Successful genome editing in primary human islets could reveal features of the genetic regulatory landscape underlying β cell function and diabetes risk. Here, we describe a CRISPR-based strategy to interrogate functions of predicted regulatory DNA elements using electroporation of a complex of Cas9 ribonucleoprotein (Cas9 RNP) and guide RNAs into primary human islet cells. We successfully targeted coding regions including the PDX1 exon 1, and non-coding DNA linked to diabetes susceptibility. CRISPR/Cas9 RNP approaches revealed genetic targets of regulation by DNA elements containing candidate diabetes risk SNPs, including an in vivo enhancer of the MPHOSPH9 gene. CRISPR/Cas9 RNP multiplexed targeting of two cis -regulatory elements linked to diabetes risk in PCSK1 , which encodes an endoprotease crucial for insulin processing, also demonstrated efficient simultaneous editing of PCSK1 regulatory elements, resulting in impaired β cell PCSK1 regulation and insulin secretion. Multiplex CRISPR/Cas9 RNP provides powerful approaches to investigate and elucidate human islet cell gene regulation in health and diabetes.

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of Polr3 -related neurodegenerative diseases including 4H leukodystrophy. Disease onset occurs from infancy to early adulthood and is associated with a variable range and severity of neurological and non-neurological features. The molecular basis of Polr3 -related disease pathogenesis is unknown. We developed a postnatal whole-body mouse model expressing pathogenic Polr3a mutations to examine the molecular mechanisms by which reduced Pol III transcription results primarily in central nervous system phenotypes. Polr3a mutant mice exhibit behavioral deficits, cerebral pathology and exocrine pancreatic atrophy. Transcriptome and immunohistochemistry analyses of cerebra during disease progression show a reduction in most Pol III transcripts, induction of innate immune and integrated stress responses and cell-type-specific gene expression changes reflecting neuron and oligodendrocyte loss and microglial activation. Earlier in the disease when integrated stress and innate immune responses are minimally induced, mature tRNA sequencing revealed a global reduction in tRNA levels and an altered tRNA profile but no changes in other Pol III transcripts. Thus, changes in the size and/or composition of the tRNA pool have a causal role in disease initiation. Our findings reveal different tissue- and brain region-specific sensitivities to a defect in Pol III transcription.

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of neurodegenerative diseases including 4H leukodystrophy. Disease onset occurs from infancy to early adulthood and is associated with a variable range and severity of neurological and non-neurological features. The molecular basis of disease pathogenesis is unknown. We developed a postnatal whole-body mouse model expressing pathogenic Polr3a mutations to examine the molecular mechanisms by which reduced Pol III transcription results primarily in central nervous system phenotypes. Polr3a mutant mice exhibit behavioral deficits, cerebral pathology and exocrine pancreatic atrophy. Transcriptome and immunohistochemistry analyses of cerebra during disease progression show a reduction in most Pol III transcripts, induction of innate immune and integrated stress responses and cell type-specific gene expression changes reflecting neuron and oligodendrocyte loss and microglial activation. Earlier in the disease when integrated stress and innate immune responses are minimally induced, mature tRNA sequencing revealed a global reduction in tRNA levels and an altered tRNA profile but no changes in other Pol III transcripts. Thus, changes in the size and/or composition of the tRNA pool have a causal role in disease initiation. Our findings reveal different tissue- and brain region-specific sensitivities to a defect in Pol III transcription.

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of

Pathogenic variants in subunits of RNA polymerase (Pol) III cause a spectrum of neurodegenerative diseases including 4H leukodystrophy. Disease onset occurs from infancy to early adulthood and is associated with a variable range and severity of neurological and non-neurological features. The molecular basis of disease pathogenesis is unknown. We developed a postnatal whole-body mouse model expressing pathogenic Polr3a mutations to examine the molecular mechanisms by which reduced Pol III transcription results primarily in central nervous system phenotypes. Polr3a mutant mice exhibit behavioral deficits, cerebral pathology and exocrine pancreatic atrophy. Transcriptome and immunohistochemistry analyses of cerebra during disease progression show a reduction in most Pol III transcripts, induction of innate immune and integrated stress responses and cell type-specific gene expression changes reflecting neuron and oligodendrocyte loss and microglial activation. Earlier in the disease when integrated stress and innate immune responses are minimally induced, mature tRNA sequencing revealed a global reduction in tRNA levels and an altered tRNA profile but no changes in other Pol III transcripts. Thus, changes in the size and/or composition of the tRNA pool have a causal role in disease initiation. Our findings reveal different tissue- and brain region-specific sensitivities to a defect in Pol III transcription.