Abstract Binding and unbinding of transcription regulators at operator sites constitute a primary mechanism for gene regulation. While many cellular factors are known to regulate their binding, little is known on how cells can modulate their unbinding for regulation. Using nanometer-precision single-molecule tracking, we study the unbinding kinetics from DNA of two metal-sensing transcription regulators in living Escherichia coli cells. We find that they show unusual concentration-dependent unbinding kinetics from chromosomal recognition sites in both their apo and holo forms. Unexpectedly, their unbinding kinetics further varies with the extent of chromosome condensation, and more surprisingly, varies in opposite ways for their apo-repressor versus holo-activator forms. These findings suggest likely broadly relevant mechanisms for facile switching between transcription activation and deactivation in vivo and in coordinating transcription regulation of resistance genes with the cell cycle.

Significance MerR-family regulators act on suboptimal promoters to control the transcriptions of genes that help bacteria defend against a diverse set of metals and drugs. How they modulate RNA polymerase (RNAP) activity to control transcription initiation remains unclear, however. Here we show that CueR—a Cu + -responsive MerR-family metalloregulator—biases the kinetic sampling of RNAP binding events that lead to two noninterconverting states: a dead-end complex to repress or an open complex to activate transcription, constituting a branched pathway distinct from the linear pathway prevalent for transcription initiation at optimal promoters. This mechanistic insight contributes new fundamental knowledge to bacterial transcription regulation, and may help develop antibiotics that target this regulation mechanism to compromise bacterial defenses.

Significance Multicomponent efflux pumps confer clinically relevant drug resistance in Gram-negative bacteria. These pumps, once assembled to function, traverse the periplasm linking inner and outer membranes tightly. However, little is known on how these pumps can operate efficiently without compromising periplasmic plasticity. We show here that in Escherichia coli , the tripartite complex CusCBA for Cu + and Ag + efflux exists as a dynamic structure and shifts toward the assembled form in response to metal stress. Unexpectedly, the periplasmic adaptor protein CusB is a key metal-sensing protein that mediates the complex assembly. This adaptor protein-mediated dynamic pump assembly allows the bacterial cell for efficient efflux on cellular demand while still maintaining periplasmic plasticity; it can be broadly relevant to other multicomponent efflux systems.

Significance The field of mechanobiology examines how physical forces modulate cell physiology and has traditionally focused on eukaryotic organisms. Here we show that in bacteria, mechanical stresses can interrupt the structure and function of a molecular assembly used by Gram-negative bacteria to survive and grow in the presence of toxins. This work provides evidence that bacteria, like mammalian cells, can respond to mechanical forces through molecular complexes at the cell surface in ways that are relevant to growth. Our observations further suggest that mechanical forces may be used synergistically with other antimicrobials.

Understanding how cells regulate and transport metal ions is an important goal in the field of bioinorganic chemistry, a frontier research area that resides at the interface of chemistry and biology. This Current Topic reviews recent advances from the authors' group in using single-molecule fluorescence imaging techniques to identify the mechanisms of metal homeostatic proteins, including metalloregulators and metallochaperones. It emphasizes the novel mechanistic insights into how dynamic protein–DNA and protein–protein interactions offer efficient pathways via which MerR-family metalloregulators and copper chaperones can fulfill their functions. This work also summarizes other related single-molecule studies of bioinorganic systems and provides an outlook toward single-molecule imaging of metalloprotein functions in living cells.

Single-molecule tracking (SMT) of fluorescently tagged cytoplasmic proteins can provide valuable information on the underlying biological processes in living cells via subsequent analysis of the displacement distributions; however, the confinement effect originated from the small size of a bacterial cell skews the protein's displacement distribution and complicates the quantification of the intrinsic diffusive behaviors. Using the inverse transformation method, we convert the skewed displacement distribution (for both 2D and 3D imaging conditions) back to that in free space for systems containing one or multiple (non)interconverting Brownian diffusion states, from which we can reliably extract the number of diffusion states as well as their intrinsic diffusion coefficients and respective fractional populations. We further demonstrate a successful application to experimental SMT data of a transcription factor in living E. coli cells. This work allows a direct quantitative connection between cytoplasmic SMT data with diffusion theory for analyzing molecular diffusive behavior in live bacteria.

In bacteria, trigger factor (TF) is the molecular chaperone that interacts with the ribosome to assist the folding of nascent polypeptides. Studies in vitro have provided insights into the function and mechanism of TF. Much is to be elucidated, however, about how TF functions in vivo. Here, we use single-molecule tracking, in combination with genetic manipulations, to study the dynamics and function of TF in living E. coli cells. We find that TF, besides interacting with the 70S ribosome, may also bind to ribosomal subunits and form TF-polypeptide complexes that may include DnaK/DnaJ proteins. The TF-70S ribosome interactions are highly dynamic inside cells, with an average residence time of ∼0.2 s. Our results confirm that the signal recognition particle weakens TF's interaction with the 70S ribosome, and further identify that this weakening mainly results from a change in TF's binding to the 70S ribosome, rather than its unbinding. Moreover, using photoconvertible bimolecular fluorescence complementation, we selectively probe TF2 dimers in the cell and show that TF2 does not bind to the 70S ribosome but is involved in the post-translational interactions with polypeptides. These findings contribute to the fundamental understanding of molecular chaperones in assisting protein folding in living cells.

Metal detoxification is essential for bacteria's survival in adverse environments and their pathogenesis in hosts. Understanding the underlying mechanisms is crucial for devising antibacterial treatments. In the Gram-negative bacterium Escherichia coli, membrane-bound sensor CusS and its response regulator CusR together regulate the transcription of the cus operon that plays important roles in cells' resistance to copper/silver, and they belong to the two-component systems (TCSs) that are ubiquitous across various organisms and regulate diverse cellular functions. In vitro protein reconstitution and associated biochemical/physical studies have provided significant insights into the functions and mechanisms of CusS-CusR and related TCSs. Such studies are challenging regarding multidomain membrane proteins like CusS and also lack the physiological environment, particularly the native spatial context of proteins inside a cell. Here, we use stroboscopic single-molecule imaging and tracking to probe the dynamic behaviors of both CusS and CusR in live cells, in combination with protein- or residue-specific genetic manipulations. We find that copper stress leads to a cellular protein concentration increase and a concurrent mobilization of CusS out of clustered states in the membrane. We show that the mobilized CusS has significant interactions with CusR for signal transduction and that CusS's affinity toward CusR switches on upon sensing copper at the interfacial metal-binding sites in CusS's periplasmic sensor domains, prior to ATP binding and autophosphorylation at CusS's cytoplasmic kinase domain(s). The observed CusS mobilization upon stimulation and its surprisingly early interaction with CusR likely ensure an efficient signal transduction by providing proper conformation and avoiding futile cross talks.