Proper patterning and growth of oral structures including teeth, tongue, and palate rely on epithelial–mesenchymal interactions involving coordinated regulation of signal transduction. Understanding molecular mechanisms underpinning oral–facial development will provide novel insights into the etiology of common congenital defects such as cleft palate. In this study, we report that ablating Wnt signaling in the oral epithelium blocks the formation of palatal rugae, which are a set of specialized ectodermal appendages serving as Shh signaling centers during development and niches for sensory cells and possibly neural crest related stem cells in adults. Lack of rugae is also associated with retarded anteroposterior extension of the hard palate and precocious mid-line fusion. These data implicate an obligatory role for canonical Wnt signaling in rugae development. Based on this complex phenotype, we propose that the sequential addition of rugae and its morphogen Shh, is intrinsically coupled to the elongation of the hard palate, and is critical for modulating the growth orientation of palatal shelves. In addition, we observe a unique cleft palate phenotype at the anterior end of the secondary palate, which is likely caused by the severely underdeveloped primary palate in these mutants. Last but not least, we also discover that both Wnt and Shh signalings are essential for tongue development. We provide genetic evidence that disruption of either signaling pathway results in severe microglossia. Altogether, we demonstrate a dynamic role for Wnt-β-Catenin signaling in the development of the oral apparatus.

Summary Developmental exposure to diethylstilbestrol (DES) causes reproductive tract malformations, affects fertility and increases the risk of clear cell carcinoma of the vagina and cervix in humans. Previous studies on a well-established mouse DES model demonstrated that it recapitulates many features of the human syndrome, yet the underlying molecular mechanism is far from clear. Using the neonatal DES mouse model, the present study uses global transcript profiling to systematically explore early gene expression changes in individual epithelial and mesenchymal compartments of the neonatal uterus. Over 900 genes show differential expression upon DES treatment in either one or both tissue layers. Interestingly, multiple components of the Peroxisome Proliferator-Activated Receptor gamma (PPARγ)-mediated adipogenic/lipid metabolic pathway, including PPARγ itself, are targets of DES in the neonatal uterus. TEM and Oil Red O staining further demonstrate a dramatic increase in lipid deposition in the uterine epithelial cells upon DES exposure. Neonatal DES exposure also perturbs glucose homeostasis in the uterine epithelium. Some of these neonatal DES-induced metabolic changes appear to last into adulthood, suggesting a permanent effect of DES on energy metabolism in uterine epithelial cells. This study extends the list of biological processes that can be regulated by estrogen or DES, and provides a novel perspective for endocrine disruptor induced reproductive abnormalities.

The fate of mouse uterine epithelial progenitor cells is determined between postnatal days 5 to 7. Around this critical time window, exposure to an endocrine disruptor, diethylstilbestrol (DES), can profoundly alter uterine cytodifferentiation. We have shown previously that a homeo domain transcription factor MSX-2 plays an important role in DES-responsiveness in the female reproductive tract (FRT). Mutant FRTs exhibited a much more severe phenotype when treated with DES, accompanied by gene expression changes that are dependent on Msx2. To better understand the role that MSX-2 plays in uterine response to DES, we performed global gene expression profiling experiment in mice lacking Msx2 By comparing this result to our previously published microarray data performed on wild-type mice, we extracted common and differentially regulated genes in the two genotypes. In so doing, we identified potential downstream targets of MSX-2, as well as genes whose regulation by DES is modulated through MSX-2. Discovery of these genes will lead to a better understanding of how DES, and possibly other endocrine disruptors, affects reproductive organ development.

Abstract Non-healing diabetic wound is one of the most common complications for diabetic patients. Chronic hypoxia is among the prominent factors that delay the wound healing process. Therefore, sustained oxygenation to alleviate hypoxia is hypothesized to promote diabetic wound healing. Yet it cannot be achieved by current clinical approaches including hyperbaric oxygen therapy. Herein, we developed a sustained oxygenation system consisting of oxygen-release microspheres and a reactive oxygen species (ROS)-scavenging hydrogel. The hydrogel was used to capture the ROS that is elevated in the diabetic wounds, and that may be generated due to oxygen release. The sustainedly released oxygen augmented survival and migration of keratinocytes and dermal fibroblasts; promoted angiogenic growth factor expression, and angiogenesis in the diabetic wounds; and decreased M1 macrophage density. These effects led to a significant increase of wound closure rate. These findings reveal that sustained oxygenation alone without using drugs is capable of healing diabetic wounds.

Abstract Spermatozoa are one of the few mammalian cells types that cannot be fully derived in vitro , severely limiting the application of modern genomic techniques to study germ cell biology. The current gold standard approach of characterizing single gene knockout mice is slow as generation of each mutant line can take 6-9 months. Here, we describe an in vivo approach to rapid functional screening of germline genes based on a new non-surgical, non-viral in vivo transfection method to deliver nucleic acids into testicular germ cells. By coupling multiplex transfection of short hairpin RNA constructs with pooled amplicon sequencing as a readout, we were able to screen many genes for spermatogenesis function in a quick and inexpensive experiment. We transfected nine mouse testes with a pilot pool of RNAi against well-characterized genes to show that this system is highly reproducible and accurate. With a false negative rate of 18% and a false positive rate of 12%, this method has similar performance as other RNAi screens in the well-described Drosophila model system. In a separate experiment, we screened 26 uncharacterized genes computationally predicted to be essential for spermatogenesis and found numerous candidates for follow up studies. Further, by characterizing the effect of both libraries on neuronal N2a cells, we show that our screening results from testis are tissue-specific. Our calculations indicate that the current implementation of this approach could be used to screen thousands of protein-coding genes simultaneously in a single mouse testis. The experimental protocols and analysis scripts provided will enable other groups to use this procedure to study diverse aspects of germ cell biology ranging from epigenetics to cell physiology. This approach also has great promise as an applied tool for validating diagnoses made from medical genome sequencing, or designing synthetic biological sequences that act as potent and highly specific male contraceptives.

The mammalian ciliary margin is a part of the developing peripheral neural retina that differentiates into the ciliary body and the iris. Canonical WNT signaling plays a critical role in the specification of the ciliary margin at the peripheral retina in the presence of strong FGF signaling in the central retina. The mechanism of how the boundary between the central retina and the ciliary margin is created has not been previously elucidated. Using genetic ablation and epistasis experiments, we show that loss of FGF signaling gradient in the peripheral retina causes expansion of WNT signaling towards the central retina thereby disrupting the neurogenic boundary and compartmentalization of the ciliary margin. Loss of WNT signaling displays a complimentary effect with expansion of FGF signaling into the ciliary marginal space. Using in vivo experiments, we elucidate the FGF signaling cascade involved in development of the ciliary margin. We also identify the surface ectoderm as the source of WNT ligands in eliciting WNT response at the ciliary margin. We show that an interaction between FGF and WNT signaling is required for generation of the ciliary marginal cells. Taken together, our results reveal that a gradient intersection of FGF and WNT signaling is required for specification of the ciliary margin.

ABSTRACT The developing vertebrate eye cup is partitioned into the neural retina (NR), the retinal pigmented epithelium (RPE) and the ciliary margin (CM). By single cell analysis, we showed that a gradient of FGF signaling regulates demarcation and subdivision of the CM and controls its stem cell-like property of self-renewal, differentiation and survival. This regulation by FGF is balanced by an evolutionarily conserved Wnt signaling gradient induced by the lens ectoderm and the periocular mesenchyme, which specifies the CM and the distal RPE. These two morphogen gradients converge in the CM where FGF signaling promotes Wnt signaling by stabilizing β-catenin in a GSK3β-independent manner. We further showed that activation of Wnt signaling converts the NR to either the CM or the RPE depending on the level of FGF signaling. Conversely, activation of FGF transforms the RPE to the NR or CM dependent on Wnt activity. We demonstrated that the default fate of the eye cup is the NR, but synergistic FGF and Wnt signaling promotes CM formation both in vivo and in retinal organoid culture of human iPS cells. Our study reveals that the vertebrate eye develops through phase transition determined by a combinatorial code of FGF and Wnt signaling.