Resumo Objetivo Embora enxertos ósseos autólogos sejam o tratamento mais utilizado para defeitos ósseos, a preparação mais eficaz ainda é obscura. Este estudo animal teve como objetivo comparar diferentes preparações de enxerto ósseo autólogo para o tratamento de defeito ósseo crítico no crânio de ratos. Métodos No total, 122 ratos foram alocados aleatoriamente em três grupos: Simulado, enxerto macerado e enxerto picado. Os espécimes foram submetidos a craniotomias no centro superior do crânio com broca de corte circunferencial de 7 mm de diâmetro. O defeito ósseo crítico produzido foi tratado ou não de acordo com o grupo de alocação do animal. Os ratos foram eutanasiados às 3, 6 ou 12 semanas após a cirurgia e seus crânios foram analisados por histomorfometria, densitometria óssea, nanotomografia computadorizada (nTC) e testes biomecânicos. Resultados A análise histomorfométrica mostrou maior percentual de preenchimento do defeito ósseo crítico no grupo picado e macerado em comparação ao simulado. A avaliação densitométrica evidenciou maior massa óssea em todos os desfechos de análise (p < 0,05) no grupo picado. Os dados de nTC revelaram um aumento ósseo expressivo no grupo picado em comparação aos grupos simulado e macerado. Os testes biomecânicos mostraram maiores valores de deformação, resistência máxima e rigidez relativa no grupo picado em qualquer momento da eutanásia (p < 0,05). Conclusões Nosso estudo mostrou que a preparação de enxerto ósseo picado gerou resultados significativamente melhores do que os enxertos macerados no tratamento de defeitos ósseos críticos no crânio de ratos.