Staphylococcus aureus is a notorious biofilm-producing pathogen that is frequently isolated from implantable medical device infections. As biofilm ages, it becomes more tolerant to antimicrobial treatment leading to treatment failure and necessitating the costly removal of infected devices. In this study, we performed in-solution digestion followed by TMT-based high-throughput mass spectrometry and investigated what changes occur in the proteome of S. aureus biofilm grown for 3-days and 12-days in comparison with 24 h planktonic. It showed that proteins associated with biosynthetic processes, ABC transporter pathway, virulence proteins, and shikimate kinase pathway were significantly upregulated in a 3-day biofilm, while proteins associated with sugar transporter, degradation, and stress response were downregulated. Interestingly, in a 3-day biofilm, we observed numerous proteins involved in the central metabolism pathways which could lead to biofilm growth under diverse environments by providing an alternative metabolic route to utilize energy. In 12-day biofilms, proteins associated with peptidoglycan biosynthesis, sugar transporters, and stress responses were upregulated, whereas proteins associated with ABC transporters, DNA replication, and adhesion proteins were downregulated. Gene Ontology analysis revealed that more proteins are involved in metabolic processes in 3dwb compared with 12dwb. Furthermore, we observed significant variations in the formation of biofilms resulting from changes in the level of metabolic activity in the different growth modes of biofilms that could be a significant factor in S. aureus biofilm maturation and persistence. Collectively, potential marker proteins were identified and further characterized to understand their exact role in S. aureus biofilm development, which may shed light on possible new therapeutic regimes in the treatment of biofilm-related implant-associated infections.

The Gram-positive bacterium Staphylococcus aureus is responsible for serious acute and chronic infections worldwide and is well-known for its biofilm formation ability. Recent findings of biofilms on dry hospital surfaces emphasise the failures in current cleaning practices and disinfection and the difficulty in removing these dry surface biofilms (DSBs). Many aspects of the formation of complex DSB biology on environmental surfaces in healthcare settings remains limited. In the present study, we aimed to determine how the protein component varied between DSBs and traditional hydrated biofilm. To do this, biofilms were grown in tryptic soy broth (TSB) on removable polycarbonate coupons in the CDC biofilm reactor over 12 days. Hydrated biofilm (50% TSB for 48 h, the media was then changed every 48 h with 20% TSB, at 37 °C with 130 rpm). DSB biofilm was produced in 5% TSB for 48 h at 35 °C followed by extended periods of dehydration (48, 66, 42 and 66 h at room temperature) interspersed with 6 h of 5% TSB at 35 °C. Then, we constructed a comprehensive reference map of 12-day DSB and 12-day hydrated biofilm associated proteins of S. aureus using a high-throughput tandem mass tag (TMT)-based mass spectrometry. Further pathway analysis of significantly differentially expressed identified proteins revealed that proteins significantly upregulated in 12-day DSB include PTS glucose transporter subunit IIBC (PtaA), UDP-N-acetylmuramate-L-alanine ligase (MurC) and UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine (MurB) compared to 12-day hydrated biofilm. These three proteins are all linked with peptidoglycan biosynthesis pathway and are responsible for cell-wall formation and thicker EPS matrix deposition. Increased cell-wall formation may contribute to the persistence of DSB on dry surfaces. In contrast, proteins associated with energy metabolisms such as phosphoribosyl transferase (PyrR), glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase (GlmS), galactose-6-phosphate isomerase (LacA), and argininosuccinate synthase (ArgG) were significantly upregulated whereas ribosomal and ABC transporters were significantly downregulated in the 12-day hydrated biofilm compared to DSB. However, validation by qPCR analysis showed that the levels of gene expression identified were only partially in line with our TMT-MS quantitation analysis. For the first time, a TMT-based proteomics study with DSB has shed novel insights and provided a basis for the identification and study of significant pathways vital for biofilm biology in this reference microorganism.

Staphylococcus aureus biofilms are resistant to both antibiotics and disinfectants. As Staphylococci cell walls are an important defence mechanism, we sought to examine changes to the bacterial cell wall under different growth conditions. Cell walls of S. aureus grown as 3-day hydrated biofilm, 12-day hydrated biofilm, and 12-day dry surface biofilm (DSB) were compared to cell walls of planktonic organisms. Additionally, proteomic analysis using high-throughput tandem mass tag-based mass spectrometry was performed. Proteins involved in cell wall synthesis in biofilms were upregulated in comparison to planktonic growth. Bacterial cell wall width (measured by transmission electron microscopy) and peptidoglycan production (detected using a silkworm larva plasma system) increased with biofilm culture duration (p < 0.001) and dehydration (p = 0.002). Similarly, disinfectant tolerance was greatest in DSB, followed by 12-day hydrated biofilm and then 3-day biofilm, and it was least in the planktonic bacteria--suggesting that changes to the cell wall may be a key factor for S. aureus biofilm biocide resistance. Our findings shed light on possible new targets to combat biofilm-related infections and hospital dry surface biofilms.

Capsular contracture (CC) is one of the most common postoperative complications associated with breast implant-associated infections. The mechanisms that lead to CC remain poorly understood. Plasma is an ideal biospecimen for early proteomics biomarker discovery. However, as high-abundance proteins mask signals from low-abundance proteins, identifying novel or specific proteins as biomarkers for a particular disease has been hampered. Here, we employed depletion of high-abundance plasma proteins followed by Tandem Mass Tag (TMT)-based quantitative proteomics to compare 10 healthy control patients against 10 breast implant CC patients. A total of 450 proteins were identified from these samples. Among them, 16 proteins were significantly differentially expressed in which 5 proteins were upregulated and 11 downregulated in breast implant CC patients compared to healthy controls. Gene Ontology enrichment analysis revealed that proteins related to cell, cellular processes and catalytic activity were highest in the cellular component, biological process, and molecular function categories, respectively. Further, pathway analysis revealed that inflammatory responses, focal adhesion, platelet activation, and complement and coagulation cascades were enriched pathways. The differentially abundant proteins from TMT-based quantitative proteomics have the potential to provide important information for future mechanistic studies and in the development of breast implant CC biomarkers.

Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci account for about 80% of infections associated with medical devices and are associated with increased virulence due to their ability to form biofilm. In this study, we aimed to construct a comprehensive reference map followed by significant pathway analysis in the proteome of S. aureus biofilm grown for 3 days compared with 24 h of planktonic culture using a high-resolution Tandem Mass Tag (TMT)-based MS. We identified proteins associated with secondary metabolites, ABC transporters, biosynthesis of amino acids, and response to stress, and amino sugar and nucleotide sugar metabolism were significantly upregulated in 3-day biofilm. In contrast, proteins associated with virulence factors, microbial metabolism in diverse environments, secondary metabolites, translation, and energy metabolism were significantly downregulated. GO functional annotation indicated that more proteins are involved in metabolic processes, catalytic activity, and binding in biofilm, respectively. Among the significantly dysregulated proteins, hyaluronidase (hysA) in conjunction with chitinase may play a significant role in the elimination and/or prevention of biofilm development. This study advances the understanding of the S. aureus subproteome, identifying potential pathways significant to biofilm biology. The insights gained may aid in developing new therapeutic strategies, including antibiofilm agents, for treating biofilm-related infections associated with implantable medical devices.