We define previously unrecognized in vivo pathways of vitamin D3 (D3) metabolism generating novel D3-hydroxyderivatives different from 25-hydroxyvitamin D3 [25(OH)D3] and 1,25(OH)2D3. Their novel products include 20-hydroxyvitamin D3 [20(OH)D3], 22(OH)D3, 20,23(OH)2D3, 20,22(OH)2D3, 1,20(OH)2D3,1,20,23(OH)3D3, and 17,20,23(OH)3D3 and were produced by placenta, adrenal glands, and epidermal keratinocytes. We detected the predominant metabolite [20(OH)D3] in human serum with a relative concentration ~20 times lower than 25(OH)D3. Use of inhibitors and studies performed with isolated mitochondria and purified enzymes demonstrated involvement of the steroidogenic enzyme cytochrome P450scc (CYP11A1) as well as CYP27B1 (1α-hydroxylase). In placenta and adrenal glands with high CYP11A1 expression, the predominant pathway was D3 → 20(OH)D3 → 20,23(OH)2D3 → 17,20,23(OH)3D3 with further 1α-hydroxylation, and minor pathways were D3 → 25(OH)D3 → 1,25(OH)2D3 and D3 → 22(OH)D3 → 20,22(OH)2D3. In epidermal keratinocytes, we observed higher proportions of 22(OH)D3 and 20,22(OH)2D3. We also detected endogenous production of 20(OH)D3, 22(OH) D3, 20,23(OH)2D3, 20,22(OH)2D3, and 17,20,23(OH)3D3 by immortalized human keratinocytes. Thus, we provide in vivo evidence for novel pathways of D3 metabolism initiated by CYP11A1, with the product profile showing organ/cell type specificity and being modified by CYP27B1 activity. These findings define the pathway intermediates as natural products/endogenous bioregulators and break the current dogma that vitamin D is solely activated through the sequence D3 → 25(OH)D3 → 1,25(OH)2D3.—Slominski, A. T., Km, T.-K., Shehabi, H. Z., Semak, I., Tang, E. K. Y., Nguyen, M. N., Benson, H. A. E., Korik, E., Janjetovic, Z., Chen, J., Yates, C. R., Postlethwaite, A., Li, W., Tuckey, R. C. In vivo evidence for a novel pathway of vitamin D3 metabolism initiated by P450scc and modified by CYP27B1. FASEB J. 26, 3901–3915 (2012). www.fasebj.org

RORα and RORγ are expressed in human skin cells that produce the noncalcemic 20-hydroxyvitamin D3 [20(OH)D3] and 20,23-dihydroxyvitamin D3 [20,23(OH)2D3]. Chinese hamster ovary (CHO) cells stably expressing a Tet-on RORα or RORγ expression vector and a ROR-responsive element (RORE)-LUC reporter, and a mammalian 2-hybrid model examining the interaction between the ligand binding domain (LBD) of RORα or RORγ with an LBD-interacting LXXLL-peptide, were used to study ROR-antagonist activities. These assays revealed that 20(OH)D3 and 20,23(OH)2D3 function as antagonists of RORα and RORγ. Moreover, 20(OH)D3 inhibited the activation of the promoter of the Bmal1 and G6pase genes, targets of RORα, and 20(OH)D3 and 20,23(OH)2D3 inhibited Il17 promoter activity in Jurkat cells overexpressing RORα or RORγ. Molecular modeling using crystal structures of the LBDs of RORα and RORγ revealed docking scores for 20(OH)D3, 20,23(OH)2D3 and 1,25(OH)2D3 similar to those of the natural ligands, predicting good binding to the receptor. Notably, 20(OH)D3, 20,23(OH)2D3, and 1,25(OH)2D3 inhibited RORE-mediated activation of a reporter in keratinocytes and melanoma cells and inhibited IL-17 production by immune cells. Our study identifies a novel signaling pathway, in which 20(OH)D3 and 20,23(OH)2D3 act as antagonists or inverse agonists of RORα and RORγ, that opens new possibilities for local (skin) or systemic regulation.-Slominski, A. T., Kim, T.-K., Takeda, Y., Janjetovic, Z., Broz˙yna, A. A., Skobowiat, C., Wang, J., Postlethwaite, A., Li, W., Tuckey, R. C., Jetten, A. M. RORα and ROR γ are expressed in human skin and serve as receptors for endogenously produced noncalcemic 20-hydroxy- and 20,23-dihydroxyvitamin D.

The hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis maintains basal and stress-related homeostasis in vertebrates. Skin expresses all elements of the HPA axis including corticotropin-releasing hormone (CRH), proopiomelanocortin (POMC), ACTH, β-endorphin (β-END) with corresponding receptors, the glucocorticoidogenic pathway, and the glucocorticoid receptor (GR). To test the hypothesis that cutaneous responses to environmental stressors follow the organizational structure of the central response to stress, the activity of the “cutaneous HPA” axis homolog was investigated after exposure to ultraviolet radiation (UVR) wavelengths of UVA (320–400 nm), UVB (280–320 nm), and UVC (100–280 nm) in human skin organ culture and in co-cultured keratinocytes/melanocytes. The level of stimulation of CRH, POMC, MC1R, MC2R, CYP11A1, and CYP11B1 genes was dependent on UV wavelengths and doses, with the highest effects observed for highly energetic UVC and UVB. ELISA and Western assays showed significant production of CRH, POMC, ACTH, and CYP11A1 proteins and of cortisol, with a decrease in GR expression only after UVB and UVC. However, β-END expression was also stimulated by UVA. Immunocytochemistry localized the deposition of the aforesaid antigens predominantly to the epidermis with additional accumulation of CRH, β-END, and ACTH in the dermis. UVR-stimulated CYP11A1 expression was seen in the basal layer of the epidermis and cells of adjacent dermis. Thus, the capacity to activate or change the spatial distribution of the cutaneous HPA axis elements is dependent on highly energetic wavelengths (UVC and UVB), implying a dependence of a local stress response on their noxious activity with overlapping or alternative mechanisms activated by UVA.

Abstract To investigate whether novel pathways of vitamin D3 (D3) and 7-dehydrocholesterol (7DHC) metabolism initiated by CYP11A1 and previously characterized in vitro , occur in vivo , we analyzed samples of human serum and epidermis and pig adrenals for the presence of intermediates and products of these pathways. We extracted human epidermis from 13 individuals and sera from 13 individuals and analyzed them by LC/qTOF-MS alongside the corresponding standards. Pig adrenal glands were also analyzed for these steroids and secosteroids. Epidermal, serum and adrenal samples showed the presence of D3 hydroxy-derivatives corresponding to 20(OH)D3, 22(OH)D3, 25(OH)D3, 1,25(OH) 2 D3, 20,22(OH) 2 D3, 20,23(OH) 2 D3, 20,24(OH) 2 D3, 20,25(OH) 2 D3, 20,26(OH) 2 D3, 1,20,23(OH) 3 D3 and 17,20,23(OH) 3 D3, plus 1,20(OH) 2 D3 which was detectable only in the epidermis. Serum concentrations of 20(OH)D3 and 22(OH)D3 were only 30- and 15-fold lower than 25(OH)D3, respectively and at levels above those required for biological activity as measured in vitro . We also detected 1,20,24(OH) 3 D3, 1,20,25(OH) 3 D3 and 1,20,26(OH) 3 D3 in the adrenals. Products of CYP11A1 action on 7DHC, namely 22(OH)7DHC, 20,22(OH) 2 7DHC and 7-dehydropregnenolone were also detected in serum, epidermis and the adrenal. Thus, we have detected novel CYP11A1-derived secosteroids in the skin, serum and adrenal gland and based on their concentrations and biological activity suggest that they act as hormones in vivo .

// Anna A. Brożyna 1, 2 , Wojciech Jóźwicki 1, 2 , Krzysztof Roszkowski 3 , Jan Filipiak 4 , Andrzej T. Slominski 5, 6 1 Department of Tumour Pathology and Pathomorphology, Oncology Centre-Prof. Franciszek Łukaszczyk Memorial Hospital, Bydgoszcz, Poland 2 Department of Tumour Pathology and Pathomorphology, Faculty of Health Sciences, Nicolaus Copernicus University Collegium Medicum in Bydgoszcz, Bydgoszcz, Poland 3 Department of Oncology, Radiotherapy and Gynecologic Oncology, Faculty of Health Sciences, Nicolaus Copernicus University Collegium Medicum in Bydgoszcz, Bydgoszcz, Poland 4 Department of Chemotherapy, Oncology Centre-Prof. Franciszek Łukaszczyk Memorial Hospital, Bydgoszcz, Poland 5 Departments of Dermatology and Pathology, University of Alabama at Birmingham, Birmingham, AL, USA 6 Laboratory Service of the VA Medical Center at Birmingham, Birmingham, AL, USA Correspondence to: Anna A. Brożyna, e-mail: anna.brozyna@cm.umk.pl Andrzej Slominski, e-mail: aslominski@uabmc.edu Keywords: melanoma, melanin, survival, radiotherapy Received: January 14, 2016      Accepted: February 11, 2016      Published: February 20, 2016 ABSTRACT Melanin possess radioprotective and scavenging properties, and its presence can affect the behavior of melanoma cells, its surrounding environment and susceptibility to the therapy, as showed in vitro experiments. To determine whether melanin presence in melanoma affects the efficiency of radiotherapy (RTH) we evaluated the survival time after RTH treatment in metastatic melanoma patients ( n = 57). In another cohort of melanoma patients ( n = 84), the relationship between melanin level and pT and pN status was determined. A significantly longer survival time was found in patients with amelanotic metastatic melanomas in comparison to the melanotic ones, who were treated with either RTH or chemotherapy (CHTH) and RTH. These differences were more significant in a group of melanoma patients treated only with RTH. A detailed analysis of primary melanomas revealed that melanin levels were significantly higher in melanoma cells invading reticular dermis than the papillary dermis. A significant reduction of melanin pigmentation in pT3 and pT4 melanomas in comparison to pT1 and T2 tumors was observed. However, melanin levels measured in pT3-pT4 melanomas developing metastases (pN1-3, pM1) were higher than in pN0 and pM0 cases. The presence of melanin in metastatic melanoma cells decreases the outcome of radiotherapy, and melanin synthesis is related to higher disease advancement. Based on our previous cell-based and clinical research and present research we also suggest that inhibition of melanogenesis can improve radiotherapy modalities. The mechanism of relationship between melanogenesis and efficacy of RTH requires additional studies, including larger melanoma patients population and orthotopic, imageable mouse models of metastatic melanoma.

Melanoma, originating through malignant transformation of melanin-producing melanocytes, is a formidable malignancy, characterized by local invasiveness, recurrence, early metastasis, resistance to therapy, and a high mortality rate. This review discusses etiologic and risk factors for melanoma, diagnostic and prognostic tools, including recent advances in molecular biology, omics, and bioinformatics, and provides an overview of its therapy. Since the incidence of melanoma is rising and mortality remains unacceptably high, we discuss its inherent properties, including melanogenesis, that make this disease resilient to treatment and propose to use AI to solve the above complex and multidimensional problems. We provide an overview on vitamin D and its anticancerogenic properties, and report recent advances in this field that can provide solutions for the prevention and/or therapy of melanoma. Experimental papers and clinicopathological studies on the role of vitamin D status and signaling pathways initiated by its active metabolites in melanoma prognosis and therapy are reviewed. We conclude that vitamin D signaling, defined by specific nuclear receptors and selective activation by specific vitamin D hydroxyderivatives, can provide a benefit for new or existing therapeutic approaches. We propose to target vitamin D signaling with the use of computational biology and AI tools to provide a solution to the melanoma problem.