Although cytochrome P450 enzymes are the most versatile biocatalysts in nature, there is insufficient comprehension of the molecular mechanism underlying their functional innovation process. Here, by combining ancestral sequence reconstruction, reverse mutation assay, and progressive forward accumulation, we identified 5 founder residues in the catalytic pocket of flavone 6-hydroxylase (F6H) and proposed a “3-point fixation” model to elucidate the functional innovation mechanisms of P450s in nature. According to this design principle of catalytic pocket, we further developed a de novo diffusion model (P450Diffusion) to generate artificial P450s. Ultimately, among the 17 non-natural P450s we generated, 10 designs exhibited significant F6H activity and 6 exhibited a 1.3- to 3.5-fold increase in catalytic capacity compared to the natural CYP706X1. This work not only explores the design principle of catalytic pockets of P450s, but also provides an insight into the artificial design of P450 enzymes with desired functions.

Abstract Although cytochrome P450 enzymes are the most versatile biocatalysts in nature, there is insufficient comprehension of the molecular mechanism underlying their functional innovation process. Here, by combining ancestral sequence reconstruction, reverse mutation assay and structure analysis, we identified five founder residues in the catalytic pocket of flavone 6-hydroxylase (F6H) and proposed a “three-point fixation” model to elucidate the functional innovation mechanisms of P450s in nature. According to this design principle of catalytic pocket, we further developed a de novo diffusion model (P450Diffusion) to generate artificial P450s. Ultimately, among the 17 non-natural P450s we generated, ten designs exhibited significant F6H activity and six exhibited a 1.3- to 3.5-fold increase in catalytic capacity compared to the natural CYP706X1. This work not only explores the design principle of catalytic pockets of P450s, but also provides an insight into the artificial design of P450 enzymes with desired functions.

Abstract Isopentyldiol (IPDO) is an important raw material in cosmetic industry. So far IPDO is exclusively produced through chemical synthesis. Growing interest in natural personal care products has inspired the quest to develop a bio-based process. We previously reported a biosynthetic route that produces IPDO via extending leucine catabolism (route A), the efficiency of which, however, is not satisfactory. To address this issue, we computational designed a novel non-natural IPDO synthesis pathway (Route B) using RetroPath RL, the state of art tool for bio-retrosynthesis based on Artificial Intelligence methods. We compared this new pathway with route A and another two intuitively designed routes for IPDO biosynthesis from various aspects. Route B, which exhibits the highest thermodynamic driving force, least non-native reaction steps and lowest energy requirements appeared to hold the greatest potential for IPDO production. All three newly designed routes were then implemented in E. coli BL21(DE3) strain. Results show that the computationally designed route B can produce 2.2 mg/L IPDO from glucose, whereas no IPDO production from routes C and D. These results highlight the importance and usefulness of in silico design and comprehensive evaluation of the potential efficiencies of candidate pathways in constructing novel non-natural pathways for the production of biochemicals.

The catalytic oxidation of SO2 (COS) by dissolved oxygen in aqueous solution allows to recycle sulfate salt/sulfuric acid from the SO2-containing flue gas, and high-performance catalysts are desired for an efficient COS process. In this study, the chestnut leaves-derived biochars treated by the co-pyrolysis process with KOH/urea exhibited a favorable capability to catalyze the oxidation of SO2 in aqueous solution. The BK-N-8 biochar catalyst was the optimal one due to its moderate nitrogen content and appropriate surface functional groups. It exhibited a fast initial conversion rate from SO2 to SO42− (6.50 μmol g−1 s−1), and an excellent cycling durability for the COS process. The material showed a catalytic activity that surpassed all the reported carbonaceous materials. The surface functionalities were revealed to be the decisive factor for the conversion rate and durability of catalytic capacity. The superiority of the BK-N-8 with pyridinic N-doped aromatic cluster (AC) was further investigated via density-functional-theory calculations. The epoxy groups from O2 dissociation at the edge sites of ACs played a pivotal role for COS process onto biochars. This study provides insightful information for an in-depth understanding of the mechanism of COS process catalyzed by carbonaceous materials.

Abstract Medicinal compounds from plants include bicyclo[3.3.1]nonane derivatives, the majority of which are polycyclic polyprenylated acylphloroglucinols (PPAPs). Prototype molecules are hyperforin, the antidepressant constituent of St. John’s wort, and garcinol, a potential anticancer compound. Their complex structures have inspired innovative chemical syntheses, however, their biosynthesis in plants is still enigmatic. PPAPs are divided into two subclasses, named type A and B. Here we identify both types in Hypericum sampsonii plants and isolate two enzymes that regiodivergently convert a common precursor to pivotal type A and B products. Molecular modelling and substrate docking studies reveal inverted substrate binding modes in the two active site cavities. We identify amino acids that stabilize these alternative binding scenarios and use reciprocal mutagenesis to interconvert the enzymatic activities. Our studies elucidate the unique biochemistry that yields type A and B bicyclo[3.3.1]nonane cores in plants, thereby providing key building blocks for biotechnological efforts to sustainably produce these complex compounds for preclinical development.