Tobacco smoking causes lung cancer1–3, a process that is driven by more than 60 carcinogens in cigarette smoke that directly damage and mutate DNA4,5. The profound effects of tobacco on the genome of lung cancer cells are well-documented6–10, but equivalent data for normal bronchial cells are lacking. Here we sequenced whole genomes of 632 colonies derived from single bronchial epithelial cells across 16 subjects. Tobacco smoking was the major influence on mutational burden, typically adding from 1,000 to 10,000 mutations per cell; massively increasing the variance both within and between subjects; and generating several distinct mutational signatures of substitutions and of insertions and deletions. A population of cells in individuals with a history of smoking had mutational burdens that were equivalent to those expected for people who had never smoked: these cells had less damage from tobacco-specific mutational processes, were fourfold more frequent in ex-smokers than current smokers and had considerably longer telomeres than their more-mutated counterparts. Driver mutations increased in frequency with age, affecting 4–14% of cells in middle-aged subjects who had never smoked. In current smokers, at least 25% of cells carried driver mutations and 0–6% of cells had two or even three drivers. Thus, tobacco smoking increases mutational burden, cell-to-cell heterogeneity and driver mutations, but quitting promotes replenishment of the bronchial epithelium from mitotically quiescent cells that have avoided tobacco mutagenesis. Whole-genome sequencing of normal bronchial epithelium from 16 individuals shows that tobacco smoking increases genomic heterogeneity, mutational burden and driver mutations, whereas stopping smoking promotes replenishment of the epithelium with near-normal cells.

Patient-derived xenograft (PDX) models are widely used in cancer research. To investigate the genomic fidelity of non-small cell lung cancer PDX models, we established 48 PDX models from 22 patients enrolled in the TRACERx study. Multi-region tumor sampling increased successful PDX engraftment and most models were histologically similar to their parent tumor. Whole-exome sequencing enabled comparison of tumors and PDX models and we provide an adapted mouse reference genome for improved removal of NOD scid gamma (NSG) mouse-derived reads from sequencing data. PDX model establishment caused a genomic bottleneck, with models often representing a single tumor subclone. While distinct tumor subclones were represented in independent models from the same tumor, individual PDX models did not fully recapitulate intratumor heterogeneity. On-going genomic evolution in mice contributed modestly to the genomic distance between tumors and PDX models. Our study highlights the importance of considering primary tumor heterogeneity when using PDX models and emphasizes the benefit of comprehensive tumor sampling.

ABSTRACT Patient-derived xenograft (PDX) models of cancer, developed through injection of patient tumour cells into immunocompromised mice, have been widely adopted in preclinical studies, as well as in precision oncology approaches. However, the extent to which PDX models represent the underlying genetic diversity of a patient’s tumour and the extent of on-going genomic evolution in PDX models are incompletely understood, particularly in the context of heterogeneous cancers such as non-small cell lung cancer (NSCLC). To investigate the depiction of intratumour heterogeneity by PDX models, we derived 47 new subcutaneous multi-region PDX models from 22 patients with primary NSCLC enrolled in the clinical longitudinal cohort study TRACERx. By analysing whole exome sequencing data from primary tumours and PDX models, we find that PDX establishment creates a genomic bottleneck, with 76% of PDX models being derived from a single primary tumour subclone. Despite this, multiple primary tumour subclones were capable of PDX establishment in regional PDX models, indicating that PDX libraries derived from multiple tumour regions can capture intratumour heterogeneity. Acquisition of somatic mutations continued during PDX model expansion, and was associated with APOBEC- or mismatch repair deficiency-induced mutational signatures in a subset of models. Overall, while NSCLC PDX models retain truncal genomic alterations, the absence of subclonal heterogeneity representative of the primary tumour is a major limitation. Our results emphasise the importance of characterising and monitoring intratumour heterogeneity in the context of pre-clinical cancer studies.

Before squamous cell lung cancer develops, pre-cancerous lesions can be found in the airways. From longitudinal monitoring, we know that only half of such lesions become cancer, whereas a third spontaneously regress. While recent studies have described the presence of an active immune response in high-grade lesions, the mechanisms underpinning clinical regression of pre-cancerous lesions remain unknown. Here, we show that host immune surveillance is strongly implicated in lesion regression. Using bronchoscopic biopsies from human subjects, we find that regressive carcinoma in-situ lesions harbour more infiltrating immune cells than those that progress to cancer. Moreover, molecular profiling of these lesions identifies potential immune escape mechanisms specifically in those that progress to cancer: antigen presentation is impaired by genomic and epigenetic changes, TGF-beta signalling is overactive, and the immunomodulator TNFSF9 is downregulated. Changes appear intrinsic to the CIS lesions as the adjacent stroma of progressive and regressive lesions are transcriptomically similar. This study identifies mechanisms by which pre-cancerous lesions evade immune detection during the earliest stages of carcinogenesis and forms a basis for new therapeutic strategies that treat or prevent early stage lung cancer.