Understanding cellular force transmission dynamics is crucial in mechanobiology. We developed the DNA-based ForceChrono probe to measure force magnitude, duration, and loading rates at the single-molecule level within living cells. The ForceChrono probe circumvents the limitations of in vitro single-molecule force spectroscopy by enabling direct measurements within the dynamic cellular environment. Our findings reveal integrin force loading rates of 0.5–2 pN/s and durations ranging from tens of seconds in nascent adhesions to approximately 100 s in mature focal adhesions. The probe's robust and reversible design allows for continuous monitoring of these dynamic changes as cells undergo morphological transformations. Additionally, by analyzing how mutations, deletions, or pharmacological interventions affect these parameters, we can deduce the functional roles of specific proteins or domains in cellular mechanotransduction. The ForceChrono probe provides detailed insights into the dynamics of mechanical forces, advancing our understanding of cellular mechanics and the molecular mechanisms of mechanotransduction.

To achieve highly sensitive and reliable detection of apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1), a critical cancer diagnostic biomarker, we designed a DNA walker-based dual-mode biosensor, utilizing cellular endogenous dual enzymes (APE 1 and Flap endonuclease 1 (FEN 1)) to collaborate in activating and propelling DNA walker motion on DNA-functionalized Au nanoparticles. Incorporating both fluorescence and electrochemical detection modes, this system leverages signal amplification from DNA walker movement and cascade amplification through tandem hybridization chain reactions (HCR), achieving highly sensitive detection of APE 1. In the fluorescence mode, continuous DNA walker movement, initiated by APE1 and driven by FEN1, generates a robust signal response within a concentration range of 0.01-500 U mL

Accurate measurement of mechanical forces in cells is key to understanding how cells sense and respond to mechanical stimuli, a central aspect of mechanobiology. However, accurately quantifying dynamic forces at the single-molecule level in living cells is a significant challenge. Here, we’ve developed the DNA-based ForceChrono probe to enable in-depth studies of integrin force dynamics at the single-molecule level in living cells. By illuminating two distinct mechanical points and circumventing the inherent fluctuations of single-molecule fluorescence, the ForceChrono probe enables analysis of the complex dynamics of mechanical forces at the single-molecule level, such as loading rates and durations. Our results refine previous broad estimates of cellular loading rates to a more precise range of 0.5 to 2 pN/s, shedding light on the specifics of cellular mechanics. In addition, this study reveals a critical link between the magnitude and duration of integrin forces, consistent with the catch-bond behavior demonstrated in vitro. The ForceChrono probe has distinct advantages, such as precise analysis of single-molecule force dynamics and robust resistance to fluorescence fluctuations, which will significantly advance our understanding of cell adhesion and mechanotransduction at the single-molecule level.

The functions of DNA and RNA rely on their deformations. When stretched, both DNA and RNA duplexes change their twist angles through twist-stretch coupling. The coupling is negative for DNA but positive for RNA, which is not yet completely understood. Here, our magnetic tweezers experiments show that the coupling of RNA reverses from positive to negative by multivalent cations. Combining with the previously reported tension-induced negative-to-positive coupling-reversal of DNA, we propose a unified mechanism of the couplings of both RNA and DNA based on molecular dynamics simulations. Two deformation pathways are competing when stretched: shrinking the radius causes positive couplings but widening the major groove causes negative couplings. For RNA whose major groove is clamped by multivalent cations and canonical DNA, their radii shrink when stretched, thus exhibiting positive couplings. For elongated DNA whose radius already shrinks to the minimum and canonical RNA, their major grooves are widened when stretched, thus exhibiting negative coupling.

Monovalent salts are generally believed to stabilize DNA duplex by weakening inter-strand electrostatic repulsion. Unexpectedly, our force-induced hairpin unzipping experiments and thermal melting experiments show that LiCl, NaCl, KCl, RbCl, and CsCl at concentrations beyond ~1 M destabilize DNA, RNA, and RNA-DNA duplexes. The two types of experiments yield different changes in free energy during melting, while the results that high concentration monovalent salts destabilize duplexes are common. The effects of these monovalent ions are similar but also have noticeable differences. From 1 M to 4 M, DNA duplex is destabilized by about 0.3 kBT/bp and the melting temperature decreases by about 10 oC. Our all-atom simulations reveal this effect is caused by overcharging, where excessive ion absorption inverts the effective DNA charge from negative to positive. Furthermore, our coarse-grained simulations obtain a phase diagram that indicates whether DNA overcharging occurs at a given cation valence and concentration. These findings challenge the traditional belief that DNA overcharging occurs only with multivalent ions and have significant implications for polyelectrolyte theory, DNA nanomaterials, DNA nanotechnology, and DNA biophysics. Experiments and simulations suggest monovalent salts destabilize DNA/RNA because of overcharging. These findings challenge views that overcharging requires multivalent ions, with implications for nanomaterials, nanotechnology, and biophysics.