Understanding cellular force transmission dynamics is crucial in mechanobiology. We developed the DNA-based ForceChrono probe to measure force magnitude, duration, and loading rates at the single-molecule level within living cells. The ForceChrono probe circumvents the limitations of in vitro single-molecule force spectroscopy by enabling direct measurements within the dynamic cellular environment. Our findings reveal integrin force loading rates of 0.5–2 pN/s and durations ranging from tens of seconds in nascent adhesions to approximately 100 s in mature focal adhesions. The probe's robust and reversible design allows for continuous monitoring of these dynamic changes as cells undergo morphological transformations. Additionally, by analyzing how mutations, deletions, or pharmacological interventions affect these parameters, we can deduce the functional roles of specific proteins or domains in cellular mechanotransduction. The ForceChrono probe provides detailed insights into the dynamics of mechanical forces, advancing our understanding of cellular mechanics and the molecular mechanisms of mechanotransduction.

Accurate measurement of mechanical forces in cells is key to understanding how cells sense and respond to mechanical stimuli, a central aspect of mechanobiology. However, accurately quantifying dynamic forces at the single-molecule level in living cells is a significant challenge. Here, we’ve developed the DNA-based ForceChrono probe to enable in-depth studies of integrin force dynamics at the single-molecule level in living cells. By illuminating two distinct mechanical points and circumventing the inherent fluctuations of single-molecule fluorescence, the ForceChrono probe enables analysis of the complex dynamics of mechanical forces at the single-molecule level, such as loading rates and durations. Our results refine previous broad estimates of cellular loading rates to a more precise range of 0.5 to 2 pN/s, shedding light on the specifics of cellular mechanics. In addition, this study reveals a critical link between the magnitude and duration of integrin forces, consistent with the catch-bond behavior demonstrated in vitro. The ForceChrono probe has distinct advantages, such as precise analysis of single-molecule force dynamics and robust resistance to fluorescence fluctuations, which will significantly advance our understanding of cell adhesion and mechanotransduction at the single-molecule level.