Transcriptional activation of erythropoietin, glycolytic enzymes, and vascular endothelial growth factor occurs during hypoxia or in response to cobalt chloride (CoCl 2 ) in Hep3B cells. However, neither the mechanism of cellular O 2 sensing nor that of cobalt is fully understood. We tested whether mitochondria act as O 2 sensors during hypoxia and whether hypoxia and cobalt activate transcription by increasing generation of reactive oxygen species (ROS). Results show ( i ) wild-type Hep3B cells increase ROS generation during hypoxia (1.5% O 2 ) or CoCl 2 incubation, ( ii ) Hep3B cells depleted of mitochondrial DNA (ρ 0 cells) fail to respire, fail to activate mRNA for erythropoietin, glycolytic enzymes, or vascular endothelial growth factor during hypoxia, and fail to increase ROS generation during hypoxia; ( iii ) ρ 0 cells increase ROS generation in response to CoCl 2 and retain the ability to induce expression of these genes; and ( iv ) the antioxidants pyrrolidine dithiocarbamate and ebselen abolish transcriptional activation of these genes during hypoxia or CoCl 2 in wild-type cells, and abolish the response to CoCl 2 in ρ° cells. Thus, hypoxia activates transcription via a mitochondria-dependent signaling process involving increased ROS, whereas CoCl 2 activates transcription by stimulating ROS generation via a mitochondria-independent mechanism.

During hypoxia, hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) is required for induction of a variety of genes including erythropoietin and vascular endothelial growth factor. Hypoxia increases mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation at Complex III, which causes accumulation of HIF-1α protein responsible for initiating expression of a luciferase reporter construct under the control of a hypoxic response element. This response is lost in cells depleted of mitochondrial DNA (ρ0 cells). Overexpression of catalase abolishes hypoxic response element-luciferase expression during hypoxia. Exogenous H2O2 stabilizes HIF-1α protein during normoxia and activates luciferase expression in wild-type and ρ0 cells. Isolated mitochondria increase ROS generation during hypoxia, as does the bacterium Paracoccus denitrificans. These findings reveal that mitochondria-derived ROS are both required and sufficient to initiate HIF-1α stabilization during hypoxia. During hypoxia, hypoxia-inducible factor-1α (HIF-1α) is required for induction of a variety of genes including erythropoietin and vascular endothelial growth factor. Hypoxia increases mitochondrial reactive oxygen species (ROS) generation at Complex III, which causes accumulation of HIF-1α protein responsible for initiating expression of a luciferase reporter construct under the control of a hypoxic response element. This response is lost in cells depleted of mitochondrial DNA (ρ0 cells). Overexpression of catalase abolishes hypoxic response element-luciferase expression during hypoxia. Exogenous H2O2 stabilizes HIF-1α protein during normoxia and activates luciferase expression in wild-type and ρ0 cells. Isolated mitochondria increase ROS generation during hypoxia, as does the bacterium Paracoccus denitrificans. These findings reveal that mitochondria-derived ROS are both required and sufficient to initiate HIF-1α stabilization during hypoxia. erythropoietin reactive oxygen species hypoxia-inducible factor-1 hypoxic response element vascular endothelial growth factor desferrioxamine diphenylene iodonium 2′,7′-dichlorofluorescein DCFH-DA, 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate pyrrolidine dithiocarbamate 4,4′-diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonate phosphatidylinositol 3-kinase Hypoxia initiates transcription of a number of gene products that help to sustain the supply of O2 to tissues and to enhance cell survival during severe O2 deprivation. Gene products that augment O2 supply at the tissue level include erythropoietin (Epo)1 which increases the proliferation of erythrocytes, tyrosine hydroxylase which is necessary for the synthesis of the neurotransmitter dopamine in the carotid bodies, and the angiogenic factor VEGF which stimulates growth of new capillaries (1Semenza G.L. Wang G.L. Mol. Cell Biol. 1992; 12: 5447-5454Crossref PubMed Scopus (2137) Google Scholar, 2Czyzyk-Krzeska M.F. Furnari B.A. Lawson E.E. Millhorn D.E. J. Biol. Chem. 1994; 269: 760-764Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 3Kuroki M. Voest E.E. Amano S. Beerepoot L.V. Takashima S. Tolentino M. Kim R.Y. Rohan R.M. Colby K.A. Yeo K.T. Adamis A.P. J. Clin. Invest. 1996; 98: 1667-1675Crossref PubMed Scopus (412) Google Scholar). At the cellular level, gene products that enhance survival during hypoxia include the glycolytic enzymes and the glucose transporters Glut1 and Glut3 (4Bunn H.F. Poyton R.O. Physiol. Rev. 1996; 76: 839-885Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar). The induction of these genes is mediated by hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) (5Wang G.L. Semenza G.L. J. Biol. Chem. 1993; 268: 21513-21518Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 6Levy A.P. Levy N.S. Wegner S. Goldberg M.A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 13333-13340Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (875) Google Scholar, 7Wang G.L. Jiang B.-H. Rue E.A. Semenza G.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 5510-5514Crossref PubMed Scopus (4928) Google Scholar), a heterodimeric transcription factor consisting of HIF-1α and the aryl hydrocarbon nuclear translocator (ARNT or HIF-1β) subunits (7Wang G.L. Jiang B.-H. Rue E.A. Semenza G.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995; 92: 5510-5514Crossref PubMed Scopus (4928) Google Scholar, 8Maxwell P.H. Pugh C.W. Ratcliffe P.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 2423-2427Crossref PubMed Scopus (357) Google Scholar, 9Pollenz R.S. Sullivan H.R. Holmes J. Necela B. Peterson R.E. J. Biol. Chem. 1996; 271: 30886-30896Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (75) Google Scholar). The significance of HIF-1 in transcriptional regulation was recently demonstrated by the marked decrease in mRNA expression of VEGF and glycolytic enzymes seen during hypoxia in HIF-1α- or ARNT-deficient murine embryonic stem cells (10Iyer N.V. Kotch L.E. Agani F. Leung S.W. Laughner E. Wenger R.H. Gassmann M. Gearhart J.D. Lawler A.M., Yu, A.Y. Semenza G.L. Genes Dev. 1998; 12: 149-162Crossref PubMed Scopus (2008) Google Scholar, 11Ryan H.E. Lo J. Johnson R.S. EMBO J. 1998; 17: 3005-3015Crossref PubMed Scopus (1318) Google Scholar, 12Maltepe E. Schmidt J.V. Baunoch D. Bradfield C.A. Simon M.C. Nature. 1997; 386: 403-407Crossref PubMed Scopus (625) Google Scholar). The mechanism by which HIF-1 activation is initiated during hypoxia remains unclear. Both HIF-1α and ARNT mRNAs are constitutively expressed, indicating that functional activity of the HIF-1α·ARNT complex is regulated by post-transcriptional events. ARNT levels are not significantly affected by [O2], whereas HIF-1α protein is rapidly degraded under normoxic conditions by the ubiquitin-proteasome system (13Salceda S. Caro J. J. Biol. Chem. 1997; 272: 22642-22647Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1381) Google Scholar, 14Kallio P.J. Pongratz I. Gradin K. McGuire J. Poellinger L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997; 94: 5667-5672Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar). Hypoxia enhances HIF-1α protein levels by inhibiting its degradation, thereby allowing it to accumulate, to dimerize with ARNT, and to bind to the hypoxia-responsive element (HRE) in the promoter or enhancer regions of various genes. Thus, the functional HIF-1α·ARNT complex is primarily regulated by the abundance of the HIF-1α subunit. Although much has been learned about the role of HIF-1 in controlling the expression of hypoxia-responsive genes, the underlying mechanism by which cells detect the decrease in [O2] and initiate the stabilization of HIF-1α is not known. Presently, four diverse O2-sensing mechanisms have been proposed to mediate the transcriptional response to hypoxia (15Semenza G.L. Cell. 1999; 98: 281-284Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (329) Google Scholar). Two of these models postulate the involvement of an iron-containing unit in the form of either a heme group or an iron/sulfur cluster, which undergoes a change in activity during hypoxia that triggers the transcriptional response. These models are supported by the observation that cobaltous ions, or alternatively the iron chelator desferrioxamine (DFO), stabilize HIF-1α under normoxic conditions (16Wang G.L. Semenza G.L. Blood. 1993; 82: 3610-3615Crossref PubMed Google Scholar). However, no specific proteins with this role have been identified in mammalian systems. Two other models involve the generation of reactive oxygen species (ROS) by a flavoprotein-containing NAD(P)H oxidase or by mitochondria. The NAD(P)H oxidase theory postulates that a decrease in ROS production triggers the transcriptional response to hypoxia (17Fandrey J. Frede S. Jelkman W. Biochem. J. 1994; 303: 507-510Crossref PubMed Scopus (223) Google Scholar, 18Ehleben W. Bolling B. Merten E. Porwol T. Strohmaier A.R. Acker H. Respir. Physiol. 1998; 114: 25-36Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar). In support of that model, exogenous H2O2 was found to inhibit subsequent hypoxic stabilization of HIF-1α (19Huang L.E. Arany Z. Livingston D.M. Bunn H.F. J. Biol. Chem. 1996; 271: 32253-32259Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1008) Google Scholar). However, diphenylene iodonium (DPI), a specific flavoprotein inhibitor that blocks ROS generation by NAD(P)H oxidase, abolishes the hypoxic induction of HIF-1-dependent genes (20Gleadle J.M. Ebert B.L. Ratcliffe P.J. Eur. J. Biochem. 1995; 234: 92-99Crossref PubMed Scopus (87) Google Scholar), whereas the model would predict that DPI should activate the response during normoxia. We previously proposed that hypoxia partially inhibits mitochondrial electron transport, producing redox changes in the electron carriers that increase the generation of ROS. These oxidants then enter the cytosol and function as second messengers in the signaling pathway leading to stabilization of HIF-1α (21Chandel N.S. Maltepe E. Goldwasser E. Mathieu C.E. Simon M.C. Schumacker P.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 11715-11720Crossref PubMed Scopus (1559) Google Scholar). In support of this model, hypoxia failed to increase ROS production or the expression of EPO, VEGF, and glycolytic enzymes in ρ0 cells, which lack mitochondrial DNA and electron transport activity. Also, the response to hypoxia was abolished by the DPI, which abrogates mitochondrial ROS generation by inhibiting electron transport at the flavin site in mitochondrial Complex I (22Majander A. Finel M. Wikstroem M. J. Biol. Chem. 1994; 269: 21037-21042Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Our previous study tested whether ROS are required for the DNA binding of HIF-1 and the subsequent mRNA expression of Epo, VEGF, and glycolytic enzymes during hypoxia. However, protein levels of HIF-1α were not measured, so that study did not reveal whether mitochondrial ROS were required to trigger stabilization of HIF-1α during hypoxia. Moreover, although ROS were found to be necessary for the transcriptional response to hypoxia, it was not clear whether ROS by themselves were sufficient to initiate HIF-1α stabilization. Accordingly, the present study tested the following: (a) whether mitochondrial ROS are required for HIF-1α stabilization during hypoxia, cobalt treatment, or DFO; (b) whether cytosolic ROS are sufficient to trigger HIF-1α stabilization; and (c) whether mitochondrial cytochrome coxidase serves as the O2 sensor responsible for the redox changes underlying the increase in ROS generation during hypoxia. Human hepatoma 3B (Hep3B) cells and the human kidney 293 cells were cultured in α-minimum essential medium and Dulbecco's modified essential medium, respectively, to subconfluent conditions. Rat hepatocytes were isolated as described previously (23Schumacker P.T. Chandel N. Agusti A.G.N. Am. J. Physiol. 1993; 265: L395-L402PubMed Google Scholar) and maintained in Dulbecco's modified essential medium. Media were supplemented with penicillin (100 units/ml), streptomycin (100 μg/ml), and 10% heat-inactivated fetal calf serum. The ρ0-293 and ρ0-Hep3B cells were generated by incubating wild-type cells in medium containing ethidium bromide (25 ng/ml), sodium pyruvate (1 mm), and uridine (50 μg/ml) (24King M.P. Attardi G. Science. 1989; 246: 500-503Crossref PubMed Scopus (1431) Google Scholar). Hypoxic conditions were achieved as described previously (21Chandel N.S. Maltepe E. Goldwasser E. Mathieu C.E. Simon M.C. Schumacker P.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 11715-11720Crossref PubMed Scopus (1559) Google Scholar). Intracellular ROS generation was assessed using 2′,7′-dichlorofluorescein diacetate (Molecular Probes). ROS in the cells cause oxidation of DCFH, yielding the fluorescent product 2′,7′-dichlorofluorescein (DCF). Cells were plated on Petri dishes and incubated with DCFH-DA (10 μm) under various conditions. The media were then removed;, cells were lysed and centrifuged to remove debris, and the fluorescence in the supernatant was measured using a spectrofluorometer (excitation, 500 nm; emission, 530 nm). Data were normalized to values obtained from normoxic, untreated controls. Nuclear extracts were prepared by lysing cells in a hypotonic solution (KCl (10 mm), HEPES (10 mm), protease mixture inhibitors (Roche Molecular Biochemicals), phenylmethylsulfonyl fluoride (1 mm), freshly added, pH 7.8) for 30 min. The disrupted cells were then centrifuged at 14,000 rpm, and the pellet was resuspended in a solution containing KCl (400 mm), HEPES (20 mm), glycerol (25%, v/v), EDTA (0.2 mm), and MgCl2 (1.5 mm) at pH 7.8 in order to lyse the nuclear membrane. The suspension was then centrifuged, and the proteins in the supernatant were quantified by Bradford reagent (Sigma). Nuclear protein extract (30 μg) was mixed with equal volume of electrophoresis buffer (1.0 ml of glycerol, 0.5 ml of β-mercaptoethanol, 3.0 ml of 10% SDS, 1.25 ml of Tris-HCl (1.0m), pH 6.7, and 1–2 mg of bromphenol blue). After heating, the protein was resolved on an SDS-7.5% polyacrylamide gel and transferred to hybond ECL nitrocellulose paper (Amersham Pharmacia Biotech). After transfer, the gel was stained with Ponceau stain to verify uniform loading and transfer. Membranes were blocked with 5% milk in TBS-T (Tris-HCl (10 mm), NaCl (150 mm), Tween 20 (0.1%), pH 8.0) overnight and subsequently incubated with the HIF-1α antibody (Novus Biological Sciences) for 3 h at room temperature. The membrane was washed with TBS-T three times and incubated for 1 h at room temperature with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. Subsequently, the membrane was washed three times with TBS-T and analyzed by enhanced chemiluminescence (Amersham Pharmacia Biotech). Transfections of 293 and ρ0-293 cells were carried out on cells plated on 35-mm Petri dishes at 60–80% confluence using TransIT-LT1 (Panvera) according to the manufacturer's protocol. A typical transfection was performed by using 0.5 μg of the luciferase reporter driven by a trimer of murine Epo 3′ enhancer and the Glut-1 promoter (pEpo3′Glut1-Luc) and 0.5 μg of the pSV-β-galactosidase (Promega) as a control vector for monitoring transfection efficiencies. In some experiments, 0.5 μg of empty vector (pRc/CMV2) or human catalase gene driven by SV40 enhancer-promoter (pZeoSV-CAT) was co-transfected with the luciferase and β-galactosidase. The DNA/LipofectAMINE mixture was incubated with plated cells for 24 h. Subsequently, the media were replaced and cells exposed to various conditions. Cell lysis was performed using the reporter gene lysis buffer (Promega). Replicate transfection experiments were performed with four independent DNA preparations. Luciferase assays were performed using Luciferase Assay System (Promega). β-Galactosidase assays were performed using the luminescent β-galactosidase genetic reporter system II (CLONTECH). The concentration of H2O2 or t-butyl hydroperoxide was assessed in media of Hep3B cells using the xylenol orange assay (25Jiang Z.Y. Woollard A.C. Wolff S.P. FEBS Lett. 1990; 268: 69-71Crossref PubMed Scopus (436) Google Scholar). Cells were incubated in serum-free α-medium without phenol red (Life Technologies, Inc.) with H2O2 (25 or 40 μm) for 30 min with samples (900 μl) taken every 5 min (Fig. 4 A), or witht-butyl hydroperoxide (25 or 40 μm) for 120 min with samples (900 μl) taken every 30 min (Fig. 4 B). The aliquots of media were incubated at 25 °C for 45 min with 100 μl of a 10× xylenol orange stock solution (xylenol orange (10 μm), Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O (2.5 μm), H2SO4 (25 mm), (Sigma)) after which the absorbance was read at 590 nm (25Jiang Z.Y. Woollard A.C. Wolff S.P. FEBS Lett. 1990; 268: 69-71Crossref PubMed Scopus (436) Google Scholar). The concentration of H2O2 ort-butyl hydroperoxide was determined from a standard curve (0, 25, and 40 μm). Fresh stock solutions of H2O2 (10 mm) and t-butyl hydroperoxide were prepared immediately prior to each trial. Rat liver mitochondria were isolated by differential centrifugation from the livers of adult rats. The liver homogenate was prepared using a Dounce homogenizer at 4 °C in buffer containing mannitol (200 mm), sucrose (70 mm), HEPES (10 mm), and EGTA (1.0 mm), at pH 7.2. The homogenate was spun for 10 min at 750 × g, and the supernatant was spun at 10,000 × g to recover the mitochondrial fraction. Mitochondria were suspended in sucrose buffer (sucrose (250 mm), HEPES (20 mm), KCl (5 mm), KH2PO4 (3 mm), MgCl2(1.5 mm), EGTA (1 mm), pH 7.2) at a protein concentration of 0.1 mg/ml at 25 °C and were incubated with succinate (5 mm), antimycin (1 μg/ml), rotenone (1 μg/ml), and DCFH-DA (10 μm) for 30 min in spinner flasks. Subsequently, a mitochondrial aliquot (100 μl) was lysed with 1 ml of H2O, and the sample fluorescence was measured using a spectrofluorometer. The head space of the spinner flasks was gassed with various O2 concentrations as described previously (26Chandel N. Budinger G.R.S. Kemp R.A. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1995; 268: L918-L925Crossref PubMed Google Scholar). Wild-typeP. denitrificans (ATCC, Rockville MD) were grown aerobically with succinate as the carbon source as described previously (49Ludwig B. Methods Enzymol. 1986; 126: 153-159Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). Bacteria were harvested in mid-logarithmic growth phase and washed twice with KH2PO4 (50 mm). Cells were suspended in Krebs-Henseleit buffer (NaCl (120 mm), HEPES (20 mm), CaCl2 (1 mm), glucose (10 mm), KCl (2.5 mm), MgSO4 (1 mm) and KH2PO4(1 mm), pH 7.4) at 25 °C. Cells were incubated for 60 min with DCFH-DA (10 μm) in spinner flasks gassed with various O2 concentrations. Subsequently, fluorescence was measured from an aliquot of media. Intracellular ROS generation was examined in human Hep3B cells in response to hypoxia, cobalt chloride (CoCl2), or DFO using 2′,7′-dichlorofluorescein (DCFH) (27Bass D.A. Parce J.W. Dechatelet L.R. Szejda P. Seeds M.C. Thomas M. J. Immunol. 1983; 130: 1910-1917PubMed Google Scholar). This probe enters the cells and can be oxidized in the presence of ROS, generating the fluorescent compound, DCF. Previous studies have indicated that DCFH oxidation can be mediated by H2O2 but not by superoxide (28Carter W.O. Narayanan P.K. Robinson J.P. J. Leukocyte Biol. 1994; 55: 253-258Crossref PubMed Google Scholar). Hep3B cells incubated with DCFH for 6 h during hypoxia (1.5% O2) or with CoCl2 (100 μm) during normoxia demonstrated an increase in DCF fluorescence (Fig.1, A and B). By contrast, DFO (100 μm) did not elicit an increase in DCF fluorescence over the same period (Fig. 1 C). The increase in DCF fluorescence induced by hypoxia or CoCl2 was abolished by the thiol reductant pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC, 20 μm) (Fig. 1, A and B). PDTC can enhance the scavenging of H2O2 by maintaining cellular stores of reduced glutathione (GSH). ROS can be generated at a number of intracellular sites, including NAD(P)H oxidases and at mitochondrial Complex III. DPI inhibits electron transport in flavin-containing systems including NAD(P)H oxidase and mitochondrial Complex I. DPI (10 μm) attenuated the increase in DCF fluorescence in response to hypoxia but not to CoCl2 (Fig.1, A and B). Mitochondrial ROS generation at Complex III can be attenuated by inhibiting electron flux at more upstream sites. Rotenone (1 μg/ml), an inhibitor of electron transport at Complex I, abolished the increase in DCF fluorescence during hypoxia but not during CoCl2 incubation (Fig. 1,A and B). By contrast, antimycin A (1 μg/ml), an inhibitor of the downstream end of Complex III, did not alter the increase in DCF fluorescence. Superoxide generated within mitochondria would require anion channels to enter the cytosol, where it would be converted to H2O2 by cytosolic superoxide dismutase (29Takahashi M.A. Asada K. Arch. Biochem. Biophys. 1983; 226: 558-566Crossref PubMed Scopus (269) Google Scholar). The inhibitor of mitochondrial anion channels 4,4′-diisothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonate (DIDS) should therefore suppress the egress of superoxide from the mitochondria (30Beavis A.D. Davatol-Hag H. J. Bioenerg. Biomembr. 1996; 28: 207-214Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Indeed, DIDS (150 μm) abolished the increase in DCF fluorescence during hypoxia (Fig. 1 A). By contrast, DIDS failed to attenuate the CoCl2-stimulated increase in the DCF signal (Fig. 1 B). These results support the conclusion that hypoxia stimulates mitochondrial ROS generation, that CoCl2stimulates ROS generation by a non-mitochondrial mechanism, and that desferrioxamine does not affect ROS production. Hep3B cells were exposed to hypoxia, CoCl2, or DFO in the presence of PDTC to examine whether increases in ROS are required for the HIF-1α stabilization. PDTC abolished the hypoxia- and CoCl2-induced stabilization of HIF-1α but had no effect on DFO-induced stabilization of HIF-1α protein (Fig. 2 A). Furthermore, human epithelial kidney 293 cells transiently co-transfected with a luciferase reporter construct driven by the HRE and a construct containing catalase (31Bai J. Rodriguez A.M. Melendez J.A. Cederbaum A.I. J. Biol. Chem. 1999; 274: 26217-26224Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (260) Google Scholar) were exposed to hypoxia, CoCl2, or DFO. Catalase expression significantly attenuated the expression of luciferase in response to hypoxia or CoCl2, whereas the response to DFO was unaffected (Fig.2 B). HIF-1α protein accumulation and HRE-luciferase expression were examined in ρ0-Hep3B cells and ρ0-293 cells, respectively, to determine whether mitochondria function as the source of ROS required for activation of HIF-1 during hypoxia. The ρ0-Hep3B cells failed to accumulate HIF-1α protein during hypoxia (Fig. 2 C). By contrast, CoCl2 and DFO still stabilized HIF-1α protein in ρ0-Hep3B cells (Fig. 2 C). Hypoxia-induced HRE-luciferase expression was not detected in ρ0-293 cells, but these cells still demonstrated HRE-luciferase expression in response to CoCl2 or DFO (Fig. 2 D). The CoCl2-induced increase in HRE-luciferase expression in ρ0-293 cells was abolished in cells co-transfected to overexpress catalase (Fig. 2 D). To clarify further the role of mitochondria in the hypoxic response, wild-type Hep3B cells were exposed to hypoxia, CoCl2, or DFO in the presence of rotenone (1 μg/ml), DPI (10 μm), DIDS (150 μm), or antimycin A (1 μg/ml). Rotenone, DPI, and DIDS all abolished the accumulation of HIF-1α during hypoxia but not during CoCl2 or DFO treatment (Fig.3, A–C). Antimycin A augments ROS generation at Complex III (32Boveris A. Oshino N. Chance B. Biochem. J. 1972; 128: 617-630Crossref PubMed Scopus (1203) Google Scholar, 33Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1055) Google Scholar), which should mimic the response to hypoxia and lead to stabilization of HIF-1α. Yet antimycin A failed to stabilize HIF-1α during normoxia and did not abrogate the induction of HIF-1α during hypoxia, CoCl2, or DFO (Fig.3 D). We had previously reported that the ROS response to antimycin A during normoxia was smaller than the response to hypoxia in Hep3B cells (21Chandel N.S. Maltepe E. Goldwasser E. Mathieu C.E. Simon M.C. Schumacker P.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1998; 95: 11715-11720Crossref PubMed Scopus (1559) Google Scholar), which suggests that ROS signaling by antimycin A may have been inadequate. We therefore tested whether stabilization of HIF-1α during normoxic antimycin A treatment might be amplified in cells whose ability to degrade H2O2 is impaired. Hep3B cells were treated for 16 h with buthionine-l-sulfoximine (100 μm) to deplete glutathione stores in an attempt to amplify the response to an oxidizing stimulus evoked by antimycin A (34Nakamura K. Wang W. Kang U.J. J. Neurochem. 1997; 69: 1850-1858Crossref PubMed Scopus (74) Google Scholar). Glutathione-depleted Hep3B cells demonstrated HIF-1α accumulation under normoxia in the presence of antimycin A (Fig. 3 E). Rotenone, DPI, and DIDS all abolished this response, confirming the specificity of mitochondrial involvement (Fig. 3 E). These results support the hypothesis that mitochondrial ROS are required and sufficient for stabilization of HIF-1α during hypoxia and that non-mitochondrial ROS generation is involved in the response to CoCl2. DFO responses require neither the mitochondria nor ROS, suggesting that this compound acts at a more distal step in the signaling cascade.Figure 3A, HIF-1α protein levels in Hep3B cells exposed to 21% O2, 1.5% O2, CoCl2 (100 μm), or DFO (100 μm) for 4 h with or without rotenone (ROT., 1 μg/ml).B, HIF-1α protein levels in Hep3B cells exposed to 21% O2, 1.5% O2, CoCl2 (100 μm), or DFO (100 μm) for 4 h with or without DPI (10 μm). C, HIF-1α protein levels in Hep3B cells exposed to 21% O2, 1.5% O2, CoCl2 (100 μm), or DFO (100 μm) for 4 h with or without DIDS (150 μm). D, HIF-1α protein levels in Hep3B cells exposed to 21% O2, 1.5% O2, CoCl2(100 μm), or DFO (100 μm) for 4 h with or without antimycin A (ANTI. A, 1 μg/ml). E,HIF-1α protein levels in Hep3B cells depleted of glutathione after incubating with buthionine-l-sulfoximine (BSO) for 16 h. Subsequently, the cells were incubated for 2 h with antimycin A (1 μg/ml) in the presence of rotenone (ROT., 1 μg/ml), DPI (10 μm), DIDS (150 μm), or PDTC (20 μm).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) The observation that catalase abolishes the hypoxia- and CoCl2-induced stabilization of HIF-1α suggests that H2O2 acts as a signaling element in this response. If so, then exogenous administration of peroxide should stabilize HIF-1α during normoxia. Accordingly, boluses of H2O2 or t-butyl hydroperoxide, a more stable analogue of H2O2, were added to culture media of normoxic Hep3B cells. Serum-free media was used because catalase in serum would otherwise rapidly degrade any added peroxide. In the absence of serum, a bolus of H2O2 added to achieve an initial concentration of 25 or 40 μm was progressively degraded over 30 min (Fig. 4 A). t-Butyl hydroperoxide (25 or 40 μm) produced a more sustained elevation, but it, too, was largely degraded within 1 h (Fig.4 B). To produce a more sustained elevation in H2O2 levels, Hep3B cells were treated with repeated boluses of H2O2 or t-butyl hydroperoxide (25 μm or 40 μm) every 15 min for 2 h. This regimen was sufficient to trigger the stabilization of HIF-1α protein levels (Fig. 4 C). Hydrogen peroxide failed to stabilize HIF-1α when bolus concentrations were lowered to 10 μm (data not shown). In 293 cells transfected with the HRE-luciferase expression vector, bolus additions of H2O2 (40 μmH2O2 every 15 min for 10 h) caused expression of luciferase compared with normoxic controls (Fig.4 D). By contrast, 293 cells co-transfected with the HRE-luciferase and with catalase demonstrated an attenuated expression in response to a similar regimen of H2O2administration (Fig. 4 D). To determine whether H2O2 acts upstream or downstream of mitochondria, HRE-luciferase expression was examined in ρ0-293 cells exposed to a similar regimen of H2O2 (40 μm). These ρ0-293 cells increased HRE-luciferase expression, indicating that peroxide must act downstream from the mitochondria (Fig. 4 D). Protein phosphorylation participates in the signaling cascade mediating the accumulation of HIF-1α as well as in the transactivation by the HIF-1 complex in response to hypoxia (35Richard D.E. Berra E. Gothie E Roux D. Pouyssegur J. J. Biol. Chem. 1999; 274: 32631-32637Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (706) Google Scholar, 36Salceda S. Beck I. Srinivas V. Caro J. Kidney Int. 1997; 51: 556-559Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (59) Google Scholar, 37Wang G.L. Jiang B.-H. Semenza G.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995; 212: 550-556Crossref PubMed Scopus (158) Google Scholar, 38Mazure N.M. Chen E.Y. Laderoute K.R. Giaccia A.J. Blood. 1997; 90: 3322-3331Crossref PubMed Google Scholar). The phosphatase inhibitor calyculin A (5 nm) abolished HIF-1α stabilization in response to hypoxia, CoCl2, or DFO in Hep3B cells (Fig.5 A). Wortmannin (0.1–1.0 μm), an inhibitor of PI-3 kinase, attenuated HIF-1α accumulation in response to hypoxia, CoCl2, or DFO (Fig.5 B). Wortmannin (500 nm) also attenuated the expression of HRE-luciferase in 293 cells (Fig. 5 C). In the presence of calyculin A or wortmannin, the proteasome inhibitorN-carbobenzoxyl-l-leucinyl-l-leucinyl-l-norvalinal (10 μm) was still able to stabilize HIF-1α (Fig.5 D). These observations reveal the following: (a) the inhibited stabilization of HIF-1α in the presence of these compounds did not reflect a nonspecific toxic effect, and (b) phosphatases and PI-3 kinases must act upstream of the proteolytic degradation machinery. To demonstrate that phosphatases and PI-3 kinases act downstream of H2O2, Hep3B cells were treated with boluses of H2O2 (40 μm every 15 min for 2 h) in the presence of calyculin A or wortmannin. Calyculin A and wortmannin independently abolished the stabilization of HIF-1α protein effected by H2O2 (Fig. 5 E). Thus, phosphatases and PI-3 kinases are required for the stabilization of HIF-1α and act at steps downstream of ROS. To determine whether the inhibition of the HIF-1α protein response to hypoxia, CoCl2, or DFO by wortmannin was specific to that compound, additional studies were carried out using the PI-3 kinase inhibitor LY 294002. At a concentration of 20 μm, this compound also inhibited the stabilization of HIF-1α in response to hypoxia, CoCl2, or DFO (Fig. 5 F). These results support the conclusion that PI-3 kinase participates in the signaling regulating HIF-1α stabilization by acting downstream from the activation by hypoxia, CoCl2, and DFO. We previously found that cytochromec oxidase undergoes a decrease inV max during hypoxia (39Chandel N.S. Budinger G.R.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18672-18677Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (120) Google Scholar). Cytochrome oxidase in rat hepatocytes requires 90

Multicellular organisms initiate adaptive responses when oxygen (O2) availability decreases, but the underlying mechanism of O2 sensing remains elusive. We find that functionality of complex III of the mitochondrial electron transport chain (ETC) is required for the hypoxic stabilization of HIF-1α and HIF-2α and that an increase in reactive oxygen species (ROS) links this complex to HIF-α stabilization. Using RNAi to suppress expression of the Rieske iron-sulfur protein of complex III, hypoxia-induced HIF-1α stabilization is attenuated, and ROS production, measured using a novel ROS-sensitive FRET probe, is decreased. These results demonstrate that mitochondria function as O2 sensors and signal hypoxic HIF-1α and HIF-2α stabilization by releasing ROS to the cytosol.

Mitochondrial physiology is disrupted in either apoptosis or necrosis. Here, we report that a wide variety of apoptotic and necrotic stimuli induce progressive mitochondrial swelling and outer mitochondrial membrane rupture. Discontinuity of the outer mitochondrial membrane results in cytochrome c redistribution from the intermembrane space to the cytosol followed by subsequent inner mitochondrial membrane depolarization. The mitochondrial membrane protein Bcl-xL can inhibit these changes in cells treated with apoptotic stimuli. In addition, Bcl-xL-expressing cells adapt to growth factor withdrawal or staurosporine treatment by maintaining a decreased mitochondrial membrane potential. Bcl-xL expression also prevents mitochondrial swelling in response to agents that inhibit oxidative phosphorylation. These data suggest that Bcl-xL promotes cell survival by regulating the electrical and osmotic homeostasis of mitochondria.

Parkinson’s disease is a pervasive, ageing-related neurodegenerative disease the cardinal motor symptoms of which reflect the loss of a small group of neurons, the dopaminergic neurons in the substantia nigra pars compacta1 (SNc). Mitochondrial oxidant stress is widely viewed as being responsible for this loss2, but why these particular neurons should be stressed is a mystery. Here we show, using transgenic mice that expressed a redox-sensitive variant of green fluorescent protein targeted to the mitochondrial matrix, that the engagement of plasma membrane L-type calcium channels during normal autonomous pacemaking created an oxidant stress that was specific to vulnerable SNc dopaminergic neurons. The oxidant stress engaged defences that induced transient, mild mitochondrial depolarization or uncoupling. The mild uncoupling was not affected by deletion of cyclophilin D, which is a component of the permeability transition pore, but was attenuated by genipin and purine nucleotides, which are antagonists of cloned uncoupling proteins. Knocking out DJ-1 (also known as PARK7 in humans and Park7 in mice), which is a gene associated with an early-onset form of Parkinson’s disease, downregulated the expression of two uncoupling proteins (UCP4 (SLC25A27) and UCP5 (SLC25A14)), compromised calcium-induced uncoupling and increased oxidation of matrix proteins specifically in SNc dopaminergic neurons. Because drugs approved for human use can antagonize calcium entry through L-type channels, these results point to a novel neuroprotective strategy for both idiopathic and familial forms of Parkinson’s disease.

Reactive oxygen species are not only harmful agents that cause oxidative damage in pathologies, they also have important roles as regulatory agents in a range of biological phenomena. The relatively recent development of this more nuanced view presents a challenge to the biomedical research community on how best to assess the significance of reactive oxygen species and oxidative damage in biological systems. Considerable progress is being made in addressing these issues, and here we survey some recent developments for those contemplating research in this area.

Reactive oxygen species (ROS) have been proposed to participate in the induction of cardiac preconditioning. However, their source and mechanism of induction are unclear. We tested whether brief hypoxia induces preconditioning by augmenting mitochondrial generation of ROS in chick cardiomyocytes. Cells were preconditioned with 10 min of hypoxia, followed by 1 h of simulated ischemia and 3 h of reperfusion. Preconditioning decreased cell death from 47 ± 3% to 14 ± 2%. Return of contraction was observed in 3/3 preconditioned versus 0/6 non-preconditioned experiments. During induction, ROS oxidation of the probe dichlorofluorescin (sensitive to H2O2) increased ∼2.5-fold. As a substitute for hypoxia, the addition of H2O2 (15 μmol/liter) during normoxia also induced preconditioning-like protection. Conversely, the ROS signal during hypoxia was attenuated with the thiol reductant 2-mercaptopropionyl glycine, the cytosolic Cu,Zn-superoxide dismutase inhibitor diethyldithiocarbamic acid, and the anion channel inhibitor 4,4′-diisothiocyanato-stilbene-2,2′-disulfonate, all of which also abrogated protection. ROS generation during hypoxia was attenuated by myxothiazol, but not by diphenyleneiodonium or the nitric-oxide synthase inhibitor l-nitroarginine. We conclude that hypoxia increases mitochondrial superoxide generation which initiates preconditioning protection. Furthermore, mitochondrial anion channels and cytosolic dismutation to H2O2 may be important steps for oxidant induction of hypoxic preconditioning. Reactive oxygen species (ROS) have been proposed to participate in the induction of cardiac preconditioning. However, their source and mechanism of induction are unclear. We tested whether brief hypoxia induces preconditioning by augmenting mitochondrial generation of ROS in chick cardiomyocytes. Cells were preconditioned with 10 min of hypoxia, followed by 1 h of simulated ischemia and 3 h of reperfusion. Preconditioning decreased cell death from 47 ± 3% to 14 ± 2%. Return of contraction was observed in 3/3 preconditioned versus 0/6 non-preconditioned experiments. During induction, ROS oxidation of the probe dichlorofluorescin (sensitive to H2O2) increased ∼2.5-fold. As a substitute for hypoxia, the addition of H2O2 (15 μmol/liter) during normoxia also induced preconditioning-like protection. Conversely, the ROS signal during hypoxia was attenuated with the thiol reductant 2-mercaptopropionyl glycine, the cytosolic Cu,Zn-superoxide dismutase inhibitor diethyldithiocarbamic acid, and the anion channel inhibitor 4,4′-diisothiocyanato-stilbene-2,2′-disulfonate, all of which also abrogated protection. ROS generation during hypoxia was attenuated by myxothiazol, but not by diphenyleneiodonium or the nitric-oxide synthase inhibitor l-nitroarginine. We conclude that hypoxia increases mitochondrial superoxide generation which initiates preconditioning protection. Furthermore, mitochondrial anion channels and cytosolic dismutation to H2O2 may be important steps for oxidant induction of hypoxic preconditioning. Myocardial preconditioning was initially described as an adaptive response of the heart to brief episodes of ischemia that decreased necrosis during subsequent prolonged ischemia (1Murry C.E. Jennings R.B. Reimer K.A. Circulation. 1986; 74: 1124-1136Crossref PubMed Scopus (7173) Google Scholar). Reactive oxygen species (ROS 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; BSS, balanced salt solution; PI, propidium iodide; DCF, dichlorofluorescein; DHE, dihydroethidium; Eth, ethidium; SOD, superoxide dismutase; NOS, nitric-axide synthase; DCFH-DA, 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate ; DCFH, 2′,7′-dichlorofluorescin; 2-MPG, 2-mercaptopriopionyl glycine; DPI, diphenyleneiodonium; DDC, diethyldithiocarbamic acid; DIDS, 4,4′-diisothiocyanato-stilbene-2,2′-disulfonate. ;e.g. superoxide, H2O2, hydroxyl radicals) generated from brief ischemia/reperfusion have been recognized as possible "triggers" in the initiation of preconditioning (2Baines C.P. Goto M. Downey J.M. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 207-216Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (419) Google Scholar). Evidence for this role includes intact heart studies where exposure to superoxide or H2O2caused preconditioning-like protection (2Baines C.P. Goto M. Downey J.M. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 207-216Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (419) Google Scholar, 3Tritto I. D'Andrea D. Eramo N. Scognamiglio A. De Simone C. Violante A. Esposito A. Chiariello M. Ambrosio G. Circ. Res. 1997; 80: 743-748Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar), and other studies demonstrating that antioxidants abolished the induction of preconditioning (4Tanaka M. Fujiwara H. Yamasaki K. Sasayama S. Cardiovasc. Res. 1994; 28: 980-986Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 5Osada M. Takeda S. Sato T. Komori S. Tamura K. Jpn. Circ. J. 1994; 58: 259-263Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar). Few studies have directly measured ROS generation during brief hypoxia or ischemia induction (6Zhou X. Zhai X. Ashraf M. Circulation. 1997; 93: 1177-1184Crossref Scopus (175) Google Scholar). Such direct measures are needed to clarify important questions that remain regarding the role of ROS as inducing agents, including their source, where they are metabolized, and the relative contributions of different oxidant species to the induction of preconditioning protection. Within the intact heart, possible sources of ROS include the cardiomyocytes, endothelial cells, neutrophils, or the auto-oxidation of catecholamines (7Ferrari R. Ceconi C. Curello S. Alfieri O. Visioli O. Eur. Heart. J. 1993; 14: 25-30Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 8Hess M.L. Manson N.H. J. Mol. Cell. Cardiol. 1984; 16: 969-985Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (482) Google Scholar). Within cardiomyocytes, sources of ROS could include superoxide generation from NAD(P)H or other oxidases such as cytochrome P450 (9Thannickal V.J. Fanburg B.L. J. Biol. Chem. 1995; 270: 30334-30338Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (386) Google Scholar, 10Griendling K.K. Minieri C.A. Ollerenshaw J.D. Alexander R.W. Circ. Res. 1994; 74: 1141-1148Crossref PubMed Scopus (2433) Google Scholar, 11Mohazzab-H K.M. Kaminski P.M. Wolin M.S. Circulation. 1997; 96: 614-620Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar), the mitochondrial electron transport chain (12Ambrosio G. Zweier J.L. Duilio C. Kuppusamy P. Santoro G. Elia P.P. Tritto I. Cirillo P. Condorelli M. Chiarello M. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18532-18541Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), or even nitric-oxide synthase under conditions where arginine is depleted (13Kitakaze M. Node K. Komamura K. Minamino T. Inoue M. Hori M. Kamada T. J. Mol. Cell. Cardiol. 1995; 27: 2149-2154Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (73) Google Scholar, 14Kelly R.A. Balligand J.L. Smith T.W. Circ. Res. 1996; 79: 363-380Crossref PubMed Scopus (634) Google Scholar, 15Xia Y. Dawson V.L. Dawson T.M. Snyder S.H. Zweier J.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 6770-6774Crossref PubMed Scopus (657) Google Scholar). Although it is likely that superoxide is the initial oxidant generated from these systems, the relative importance of superoxide, or its reduced products H2O2 or hydroxyl radical, in the signal transduction system involved in preconditioning is not known. Some evidence suggests that either superoxide or hydrogen peroxide can initiate preconditioning (2Baines C.P. Goto M. Downey J.M. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 207-216Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (419) Google Scholar, 16Gopalakrishna R. Anderson W.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 6758-6762Crossref PubMed Scopus (381) Google Scholar,17Downey J.M. Cohen M.V. Marber M.M. Yellon D.M. Ischaemia: Preconditioning and Adaptation. 1996: 21-34Google Scholar), so it is conceivable that H2O2 is the active signaling agent in this process. The purpose of our study was to investigate the role of mitochondrial ROS in the induction of hypoxic preconditioning, and to clarify which ROS are required for the preconditioning response. For this study, we used chick cardiomycytes, which have been shown to precondition with brief hypoxia (18Liang B.T. Am. J. Physiol. 1996; 271: H1769-H1777PubMed Google Scholar, 19Strickler J. Jacobson K.A. Liang B.T. J. Clin. Invest. 1996; 98: 1773-1779Crossref PubMed Scopus (117) Google Scholar). Embryonic ventricular cardiac myocytes were prepared as described previously (20Vanden Hoek T.L. Shao Z. Li C. Zak R. Schumacker P.T. Becker L.B. Am. J. Physiol. 1996; 270: H1334-H1341PubMed Google Scholar). Heart ventricles from 10-day-old chick embryos were dissected, minced, enzymatically dispersed with 0.025% trypsin (Life Technologies, Inc.), and centrifuged differentially to yield 5–6 × 105cells/embryo. Cells (0.7 × 106) were pipetted onto coverslips, incubated, and grown into contractile layers. Synchronous contractions were seen by the third day in culture. Cultures were checked for non-muscle cell contamination (greater than 95% of cells stain with anti-myosin heavy chain monoclonal antibodies, CCM-52). Experiments were performed with 3–5-day cardiac cell cultures, at which point viability exceeded 99%. Coverslips with synchronously contracting cells were placed inside a Sykes-Moore chamber (1.2-ml volume, Bellco Glass Inc., Vineland, NJ). The chamber and inflow tubing were maintained at 37 °C. Flow rate (0.25 ml/min), pH, and oxygen tension (PO2) of the perfusate were controlled. Hypoxic conditions were verified with an optical method of phosphorescence quenching (Oxyspot, Medical Systems Inc, Greenvale, NY) (21Lo L.W. Koch C.J. Wilson D.F. Anal. Biochem. 1996; 236: 153-160Crossref PubMed Scopus (228) Google Scholar). An extracellular Pd-porphine dye bound to albumin (1–10 μm) was added to the perfusate, and the PO2-dependent phosphorescence decay was recorded in response to pulsed excitation light. Perfusion with hypoxic media resulted in measured PO2 values of 3 torr within the chamber during steady state perfusion. Tubing supplying perfusate to the chamber was of low O2 permeability, constructed of PharMed (Cole-Parmer Instrument Co., Chicago, IL) or stainless steel to minimize O2 leaks. Standard perfusion media consisted of oxygenated balanced salt solution (BSS) with a PO2 of 100 torr, PCO2 of 40, pH of 7.4, [K+] of 4.0 mEq/liter, and a glucose of 5.6 mm. Simulated ischemia consisted of BSS containing no glucose, with 2-deoxyglucose (20 mm) added to inhibit glycolysis and a [K+] of 8.0 mEq/liter. This was bubbled with 80% N2 gas and 20% CO2 to produce a PO2 of less than 3 torr, a PCO2 of 144 torr, and a final pH of 6.8. Hypoxic media used for preconditioning consisted of BSS with no glucose, bubbled with 95% N2 gas and 5% CO2. Reperfusion was with standard media unless stated otherwise. Cells were imaged with an Olympus IMT-2 inverted phase/epifluorescent microscope equipped with Hoffman Modulation optics to accentuate surface topology of the cells. This facilitated detection of contractile movement in the confluent layer of cells. Phase-contrast images were recorded for contraction analysis with a CCD camera. Fluorescence was measured using a cooled Hamamatsu slow-scanning PC-controlled camera (Hamamatsu, Hamamatsu City, Japan) coupled with Image-One software (Image Pro Plus) for quantification of changes in emission fluorescence. Measurements of propidium iodide (PI) fluorescence to assess membrane integrity were made using an excitation of 540 nm, with 580-nm long pass and 590-nm band pass filters. Dichlorofluorescein (DCF) fluorescence used to assess oxidant generation was measured using excitation light of 480 nm, with 510-nm long pass and 520-nm band pass filters. An additional marker of oxidant generation, dihydroethidium (DHE), which becomes oxidized and bound as the fluorescent complex ethidium-DNA, was measured using the same filter settings used to visualize PI. To prevent interference between PI and DHE oxidation measurements, separate studies were conducted with one or the other of these probes. Cell viability was quantified over time using the nuclear stain PI (5 μm, Molecular Probes, Eugene, OR), an exclusion fluorescent dye that binds to chromatin upon loss of membrane integrity. This method is similar in principle to trypan blue staining, and has been reported to predict the transition from reversible to irreversible cell injury in cultured cardiomyocytes (22Bond J.M. Herman B. Lemasters J.J. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharm. 1991; 71: 195-208PubMed Google Scholar). PI is not toxic to cells over a course of 8 h, permitting its addition to the perfusate throughout the experiment. At the end of each experiment using PI, all nuclei in a field of approximately 500 cells were stained by permeabilizing cells with digitonin (300 μm). Percent loss of viability (i.e. cell death) over time was expressed relative to the maximal value seen after digitonin exposure (100%). Intracellular oxidant stress was monitored by measuring changes in fluorescence resulting from intracellular probe oxidation. DHE (1–10 μm, Molecular Probes) enters the cell and can be oxidized by ROS including superoxide and/or hydroxyl radical to yield fluorescent ethidium (Eth). Eth binds to DNA (Eth-DNA), further amplifying its fluorescence (23Carter W.O. Narayanan P.K. Robinson J.P. J. Leukocyte Biol. 1994; 55: 253-258Crossref PubMed Google Scholar). Eth-DNA fluorescence is generally stable, but can be decreased with severe hydroxyl radical attack (24Prutz W.A. Radiat. Environ. Biophys. 1984; 23: 1-18Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Thus, increases in DHE oxidation to Eth-DNA (i.e. increases in Eth-DNA fluorescence) are suggestive of superoxide generation (25Vanden Hoek T.L. Li C. Shao Z. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2571-2583Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (338) Google Scholar). The probe 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA, 5 μm, Molecular Probes) enters the cell and the acetate group on DCFH-DA is cleaved by cellular esterases, trapping the nonfluorescent 2′,7′-dichlorofluorescin (DCFH) inside. Subsequent oxidation by ROS, particularly hydrogen peroxide (H2O2) and hydroxyl radical, yields the fluorescent product DCF (23Carter W.O. Narayanan P.K. Robinson J.P. J. Leukocyte Biol. 1994; 55: 253-258Crossref PubMed Google Scholar). Thus, increases in DCFH oxidation to DCF (i.e. increases in DCF fluorescence) are suggestive of H2O2 or hydroxyl generation (25Vanden Hoek T.L. Li C. Shao Z. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2571-2583Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (338) Google Scholar). The reported specificities of these two probes for different ROS have been verified in multiple cuvette and chick cardiomyocyte experiments, and have been described previously (25Vanden Hoek T.L. Li C. Shao Z. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2571-2583Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (338) Google Scholar). Cell contractions were observed as described previously (26Vanden Hoek T.L. Shao Z. Li C. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2441-2450Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (145) Google Scholar). The criteria for a return of contraction was met if observable contractions were seen throughout the field of cells following the 3-h period of reperfusion. A single field of cells was monitored for contractions throughout each experiment. In the ischemia/reperfusion protocol, cardiomyocytes were exposed to 1 h of simulated ischemia (simultaneous hypoxia, hypercarbic acidosis, hyperkalemia, and substrate deprivation) followed by 3 h of reperfusion. Previous work has shown that this yields significant cell death during reperfusion that appears to result from oxidant injury (20Vanden Hoek T.L. Shao Z. Li C. Zak R. Schumacker P.T. Becker L.B. Am. J. Physiol. 1996; 270: H1334-H1341PubMed Google Scholar, 25Vanden Hoek T.L. Li C. Shao Z. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2571-2583Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (338) Google Scholar). To induce preconditioning, cardiomyocytes were exposed to 10 min of hypoxia (PO2 = 3 torr) without glucose, followed by 10 min of normoxic recovery in BSS prior to subsequent ischemia/reperfusion. Cell viability, contraction, and oxidant generation were measured during preconditioning induction and during subsequent ischemia and reperfusion. These results were compared with non-preconditioned cells studied under identical conditions. Data were collected and simple descriptive analyses were performed. An individual experiment (n) was the result of observations of a single field of approximately 500 cells on a coverslip. Replicates were performed on separate coverslips. Results are reported as means plus or minus S.E. For tests of significance, analysis of variance and two-tailed paired t tests were performed, with p < 0.05 considered to be significant. As reported previously, cell death in this model of simulated ischemia/reperfusion occurred primarily during the reperfusion phase, whereas minimal cell death was seen during the ischemia phase (20Vanden Hoek T.L. Shao Z. Li C. Zak R. Schumacker P.T. Becker L.B. Am. J. Physiol. 1996; 270: H1334-H1341PubMed Google Scholar). After 1 h of ischemia, cell death (PI uptake) in the present study was 1.2 ± 0.1% (n = 3) in hypoxia-preconditioned cells, which was not different from controls (1.6 ± 0.3% cell death, n = 6; p= 0.51) (Fig. 1). After 3 h of reperfusion, PI uptake in hypoxia-preconditioned cells averaged 14.4 ± 2.0% versus 47.4 ± 3.3% in non-preconditioned cells (p < 0.001). In the preconditioned studies, strong contractile activity returned (3 out of 3) after 3 h reperfusion compared with 0 out of 6 in control experiments (data not shown). Thus, treatment with 10 min of hypoxia prior to simulated ischemia/reperfusion significantly reduced cell death and enhanced the return of contraction. We next tested the role of ROS generation during hypoxic preconditioning. Fig. 2 shows DCF fluorescence during preconditioning with hypoxia. Brief hypoxia caused a rapid and significant increase in ROS generation compared with controls (p < 0.001). Of note, ROS generation occurred during preconditioning hypoxia, and decreased during recovery prior to ischemia. As seen in Fig. 3 the ROS generation during hypoxia was attenuated with the thiol-reducing agent 2-mercaptopriopionyl glycine (2-MPG, 400 μm) (p = 0.003). Inhibition of nitric-oxide synthase (NOS, a potential nitric oxide and superoxide source during hypoxia) usingN-nitro-l-arginine (100 μm) (reported to inhibit both nitric oxide and superoxide formation from NOS (27Zweier J.L. Wang P. Samouilov A. Kuppusamy P. Nat. Med. 1995; 1: 804-809Crossref PubMed Scopus (686) Google Scholar)) increased ROS generation during preconditioning hypoxia (Fig. 3).Figure 3Effect ofN-nitro-l-arginine or 2-MPG on DCFH oxidation during hypoxic preconditioning. ROS generation during 10 min of hypoxic preconditioning, suggested by increased DCFH oxidation, was attenuated by 2-MPG (400 μm), added during base-line conditions for 40 min and hypoxic preconditioning. However, the NOS inhibitor N-nitro-l-arginine (100 μm) had the opposite effect, increasing DCFH oxidation and DCF fluorescence.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) Fig. 4 shows the effect of the NAD(P)H oxidase inhibitor diphenyleneiodonium (DPI, 10 μm). DPI has also been reported to inhibit superoxide formation from the flavin moiety of nitric-oxide synthase (28Wever R.M.F. van Dam T. van Rijn H.J. de Groot F. Rabelink T.J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 237: 340-344Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar). DPI failed to inhibit the ROS increase seen during hypoxic preconditioning. By contrast, the mitochondrial site III electron transport inhibitor myxothiazol attenuated this ROS generation during hypoxia in a dose-dependent fashion. These results suggested that mitochondria were the source of ROS generation during hypoxic preconditioning. Mitochondria have been shown to generate superoxide via univalent electron transfer to O2, especially at the ubisemiquinone site (29Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1085) Google Scholar). This superoxide may be converted to H2O2 by superoxide dismutase (SOD) in the mitochondria or in the cytosol (Fig. 5). To test whether hypoxia generates superoxide that is dismuted by Cu,Zn-superoxide dismutase (Cu,Zn-SOD) in the cytosol, we assessed ROS generation using two fluorescent probes (DHE, 10 μm; and DCFH, 5 μm) to measure superoxide and H2O2 generation. The Cu,Zn-SOD inhibitor diethyldithiocarbamic acid (10 mm, DDC) was used to inhibit the cytosolic conversion of superoxide to H2O2 (30Misra H.P. J. Biol. Chem. 1979; 254: 11623-11628Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). As seen in Fig. 6 A, DDC abolished the increase in DCF fluorescence seen during hypoxic preconditioning (p < 0.001). By contrast, DDC augmented the extent of DHE oxidation during hypoxic preconditioning (p < 0.001) (Fig. 6 B). These results suggest that superoxide generated by mitochondria during hypoxic preconditioning can enter the cytosol, where it is converted to H2O2 by Cu,Zn-SOD. Inhibition of Cu,Zn-SOD with DDC led to an increased oxidation of the superoxide-sensitive probe DHE, and a decrease in oxidation of H2O2-sensitive DCFH.Figure 6Effects of DDC on ROS generation during hypoxic preconditioning. DDC (1 mm) was added 20 min prior to and during 10 min hypoxic preconditioning. A, DCF fluorescence increases during hypoxic preconditioning were attenuated by DDC. B, ethidium fluorescence was increased by DDC. These results suggest that cytosolic SOD is involved in metabolizing superoxide generated by hypoxic preconditioning to H2O2.View Large Image Figure ViewerDownload (PPT) To further study the importance of cytosolic SOD for the induction of preconditioning, DDC was given during preconditioning hypoxia and the effect on subsequent preconditioning protection was measured. As shown above, this inhibition should increase the lifetime of superoxide while decreasing H2O2 formation. Thus, if superoxide radical was sufficient to activate preconditioning protection, SOD inhibition could augment this protection. By contrast, if H2O2 was the active signaling species, then Cu,Zn-SOD inhibition should abolish preconditioning protection. As seen in Fig. 7, transient addition of DDC during hypoxic preconditioning abolished preconditioning protection. No difference in PI uptake was detected at the end of ischemia/reperfusion between preconditioned cells given DDC during preconditioning and non-preconditioned cells. Moreover, there was no return of contraction in any of the preconditioned cells treated with DDC. DDC by itself was not associated with directly toxic effects. In this regard, the same extent of cell death was seen when DDC was given prior to ischemia/reperfusion (in non-preconditioned cells) and in cells exposed to ischemia/reperfusion without preexposure to DDC (46.6 ± 8.6% cell death after ischemia/reperfusion with pre-exposure to DDC, n = 3; versus 47.4 ± 3.3% in non-preconditioned cells). Finally, cardiomyocytes exposed continuously for 4 h to DDC showed no significant increase in PI uptake and continued to exhibit vigorous contractions (results not shown). The results with DDC suggested that H2O2, rather than superoxide, was primarily responsible for the induction of preconditioning. We therefore tested whether low levels of exogenous H2O2 given prior to ischemia/reperfusion could elicit preconditioning-like protection. Cardiomyocytes were superfused with BSS containing H2O2 (15 μmol/liter) for 10 min followed by a 10-min washout prior to ischemia/reperfusion. Exposure to H2O2 for 10 min during normoxia resulted in significant protection against cell death during subsequent ischemia/reperfusion (p < 0.001) (Fig. 8). In addition, 3/3 H2O2-treated groups showed a return of contraction compared with 0/6 untreated control experiments. We next attempted to prevent preconditioning using the thiol reductant 2-MPG at a concentration shown previously to attenuate the ROS signal generated during hypoxia (Fig. 3). By maintaining the cytosolic pool of reduced glutathione, 2-MPG is presumed to enhance the scavenging of H2O2 (Fig. 5). Addition of 2-MPG during the first 40 min of equilibration and 10 min of hypoxic preconditioning abolished preconditioning protection (43.3 ± 4.5% cell death in 2-MPG-treated hypoxic preconditioned cells, n = 3;versus 14.4 ± 2.0% in nontreated hypoxic preconditioned cells; p < 0.01) (Fig. 8). In addition, 0/3 2-MPG-treated hypoxic preconditioned studies showed a return of contraction compared with 3/3 nontreated hypoxic-preconditioned experiments. These results further support the role of H2O2 in the induction phase of preconditioning in cardiomyocytes. Previous reports suggest that membrane anion channels may be required for transit of superoxide across cell membranes (31Takahashi M. Asada K. Arch. Biochem. Biophys. 1983; 226: 558-566Crossref PubMed Scopus (281) Google Scholar), and that this transit can be inhibited by 4,4′-diisothiocyanato-stilbene-2,2′-disulfonate (DIDS) (32Paky A. Michael J.R. Burke-Wolin T.M. Wolin M.S. Gurtner G.H. J. Appl. Physiol. 1993; 74: 2868-2874Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar). As illustrated in Fig. 5, superoxide generated in the mitochondria may enter the cytosol, where it may be dismutated by Cu,Zn-SOD to H2O2, which then activates subsequent mediators of preconditioning. If mitochondrial anion channels are involved in superoxide movement into the cytosol, then inhibitors of those channels should attenuate H2O2 generation in the cytosol and prevent preconditioning protection. To test this, cardiomyocytes were superfused with BSS containing DIDS (200 μm) during 10 min of hypoxic preconditioning. As seen in Fig. 9 A, DIDS during hypoxic preconditioning abolished ROS generation as measured by DCF fluorescence. DIDS given during hypoxic preconditioning also abolished preconditioning protection (Fig. 9 B). DIDS exhibited no apparent toxicity, as evidenced by an absence of increased PI uptake after 4 h of superfusion under normoxic conditions (data not shown). Our results show that 10 min of hypoxia in chick cardiomyocytes elicits a transient increase in ROS generation, predominantly H2O2. This ROS signal was attenuated by the mitochondrial site III electron transport inhibitor myxothiazol, but not NAD(P)H oxidase or nitric-oxide synthase inhibitors. These results suggest that the ROS generated during hypoxia originated from the mitochondria. Protection against subsequent ischemia and reperfusion was reversed by agents that attenuated this H2O2 signal. In that regard, the thiol-reducing agent 2-MPG, the cytosolic SOD inhibitor DDC, and the anion channel inhibitor DIDS all abolished preconditioning protection. Finally, transient exogenous H2O2 administration during normoxia induced preconditioning-like protection. We conclude that ROS participate in the signal transduction pathways involved in hypoxic preconditioning in this model. These ROS appear to originate as superoxide from the mitochondrial electron transport chain, which enter the cytosol via anion channels. There, dismutation by Cu,Zn-SOD appears to be necessary for the activation of subsequent steps involved in preconditioning protection. Our data are consistent with studies that have indirectly implicated ROS as signaling agents that elicit preconditioning. Most previous studies have been done in intact hearts and show that antioxidants given during ischemic preconditioning abrogate its protective effect against ischemia/reperfusion injury (4Tanaka M. Fujiwara H. Yamasaki K. Sasayama S. Cardiovasc. Res. 1994; 28: 980-986Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 33Murry C.E. Richard V.J. Jennings R.B. Reimer K.A. Circulation. 1988; 78 (abstr.): 77Google Scholar). However, our study extends previous work by identifying mitochondria as the source of ROS responsible for induction, and by showing that these ROS are generated during hypoxic preconditioning rather than at reoxygenation. Some previous studies were not able to abolish preconditioning with antioxidants (5Osada M. Takeda S. Sato T. Komori S. Tamura K. Jpn. Circ. J. 1994; 58: 259-263Crossref PubMed Scopus (30) Google Scholar, 34Richard V. Tron C. Thuillez C. Cardiovasc. Res. 1993; 27: 2016-2021Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar), raising the possibility that the type of antioxidant, its dose, or the timing of administration did not attenuate the oxidant signal responsible for induction. Our measurements of ROS generation indicated that the antioxidant compounds were acting as expected, and more directly support a role for ROS in the induction of hypoxic preconditioning. Our results show that hypoxic preconditioning is associated with significant oxidation of DCFH (sensitive to H2O2), and with significant DHE oxidation (sensitive to superoxide) when Cu,Zn-SOD is inhibited. Thus, a predominant ROS pathway during hypoxic preconditioning appears to involve H2O2 generated from superoxide metabolism. However, the specificity of these fluorescent probes for different reactive species is limited, so the precise delineation of each ROS is not possible. Nevertheless, the suggested role of H2O2 as the ROS trigger for preconditioning is supported by the observations that exogenous H2O2 can induce preconditioning-like protection during normoxia and that SOD inhibition, which increases superoxide (DHE oxidation) generation relative to H2O2formation, abolishes the protective effects of preconditioning. These results are consistent with other studies showing that exogenous superoxide or H2O2 can produce preconditioning-like protection in the intact heart (2Baines C.P. Goto M. Downey J.M. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 207-216Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (419) Google Scholar, 3Tritto I. D'Andrea D. Eramo N. Scognamiglio A. De Simone C. Violante A. Esposito A. Chiariello M. Ambrosio G. Circ. Res. 1997; 80: 743-748Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar, 35Pathak S.K. Qian Y.Z. Hess M.L. Kukreja R.C. Circulation. 1995; 92 (abstr.): I-717Google Scholar). Both superoxide and H2O2 have been shown to activate putative mediators of preconditioning such as protein kinase C and phospholipase D (16Gopalakrishna R. Anderson W.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 6758-6762Crossref PubMed Scopus (381) Google Scholar, 36Larsson R. Cerutti P. Cancer Res. 1989; 49: 5627-5632PubMed Google Scholar, 37Natarajan V. Taher M.M. Roehm B. Parinandi N.L. Schmid H.H.O. Kiss Z. Garcia J.G.N. J. Biol. Chem. 1993; 268: 930-937Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). As with our study, it is possible that superoxide could have induced preconditioning in those studies via increased intracellular [H2O2]. However, previous studies involving exogenous superoxide did not employ an SOD inhibitor, so it is difficult to know whether superoxide itself or H2O2 was responsible for eliciting preconditioning protection. Generally, H2O2would appear to be a more likely signaling element because it can cross intracellular membranes more readily than superoxide, and has been shown to directly modify the regulatory domain of protein kinase C resulting in its activation (16Gopalakrishna R. Anderson W.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1989; 86: 6758-6762Crossref PubMed Scopus (381) Google Scholar). Many potential sites of ROS production exist in the intact heart (8Hess M.L. Manson N.H. J. Mol. Cell. Cardiol. 1984; 16: 969-985Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (482) Google Scholar, 9Thannickal V.J. Fanburg B.L. J. Biol. Chem. 1995; 270: 30334-30338Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (386) Google Scholar, 10Griendling K.K. Minieri C.A. Ollerenshaw J.D. Alexander R.W. Circ. Res. 1994; 74: 1141-1148Crossref PubMed Scopus (2433) Google Scholar, 11Mohazzab-H K.M. Kaminski P.M. Wolin M.S. Circulation. 1997; 96: 614-620Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar, 12Ambrosio G. Zweier J.L. Duilio C. Kuppusamy P. Santoro G. Elia P.P. Tritto I. Cirillo P. Condorelli M. Chiarello M. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18532-18541Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 15Xia Y. Dawson V.L. Dawson T.M. Snyder S.H. Zweier J.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 6770-6774Crossref PubMed Scopus (657) Google Scholar, 38Ferrari R. Ceconi C. Curello S. Cargnoni A. Pasini E. De Giuli F. Albertini A. Am. J. Clin. Nutr. 1991; 53: 215S-222SCrossref PubMed Scopus (88) Google Scholar). In addition, neutrophils and other humoral inflammatory mediators localized in the microcirculation may release ROS in intact heart (7Ferrari R. Ceconi C. Curello S. Alfieri O. Visioli O. Eur. Heart. J. 1993; 14: 25-30Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar). However, the chick cardiomyocyte cultures used in the present study do not contain inflammatory or endothelial cells, or significant amounts of xanthine oxidase (39Fisher J.R. Dev. Biol. 1967; 15: 289-299Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar), so the contribution from non-cardiomyocyte systems to ROS generation is unlikely. NAD(P)H and mixed function oxidases also seem unlikely as a source of ROS because DPI, an inhibitor of these flavoproteins (11Mohazzab-H K.M. Kaminski P.M. Wolin M.S. Circulation. 1997; 96: 614-620Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar), did not attenuate ROS generation during hypoxia. Also, superoxide generation by NADH oxidase would be expected to decrease as [O2] decreases (11Mohazzab-H K.M. Kaminski P.M. Wolin M.S. Circulation. 1997; 96: 614-620Crossref PubMed Scopus (138) Google Scholar), whereas our studies revealed an increase in ROS generation during hypoxia. Regarding NOS as a potential oxidant source during induction, our results showed an increase in ROS generation when NOS was inhibited. Thus, it is unlikely that nitric oxide is the oxidant signal responsible for inducing preconditioning. In addition, both N-nitro-l-arginine and DPI have been reported to abolish superoxide generation from NOS (15Xia Y. Dawson V.L. Dawson T.M. Snyder S.H. Zweier J.L. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 6770-6774Crossref PubMed Scopus (657) Google Scholar, 28Wever R.M.F. van Dam T. van Rijn H.J. de Groot F. Rabelink T.J. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997; 237: 340-344Crossref PubMed Scopus (247) Google Scholar). Neither agent attenuated the ROS generation during hypoxic preconditioning, making NOS an unlikely source of superoxide. Our data, along with the work of others, implicate the mitochondrial electron transport chain as an important source of free radicals in isolated cells (7Ferrari R. Ceconi C. Curello S. Alfieri O. Visioli O. Eur. Heart. J. 1993; 14: 25-30Crossref PubMed Scopus (23) Google Scholar, 40Dawson T.L. Gores G.J. Nieminen A.L. Herman B. Lemasters J.J. Am. J. Physiol. 1993; 264: C961-C967Crossref PubMed Google Scholar). The mitchondrial inhibitor myxothiazol decreased the ROS generation during hypoxic preconditioning, suggesting that these ROS originated from the cytochrome b-c 1 segment of complex III in the respiratory chain (41Thierbach G. Reichenbach H. Biochim. Biophys. Acta. 1981; 638: 282-289Crossref PubMed Scopus (205) Google Scholar). This result is consistent with work by others who have found that two segments of the respiratory chain are primarily responsible for superoxide generation: the reduced flavin mononucleotide of NADH dehydrogenase in complex I (42Turrens J.F. Boveris A. Biochem. J. 1980; 191: 421-427Crossref PubMed Scopus (1386) Google Scholar) and the ubisemiquinone associated with the cytochromeb-c 1 segment of complex III (29Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1085) Google Scholar). Because myxothiazol abolished the ROS generation during hypoxia, and DPI (expected to inhibit the flavoprotein NADH dehydrogenase) had no detectable effect, it is likely that complex III is the predominant source of superoxide. The data also show that the ROS generation and protection associated with preconditioning is abolished with the anion channel inhibitor DIDS. Thus, superoxide would appear to enter the cytosol via mitochondrial anion channels. Anion channels are known to transport superoxide across membranes (32Paky A. Michael J.R. Burke-Wolin T.M. Wolin M.S. Gurtner G.H. J. Appl. Physiol. 1993; 74: 2868-2874Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar), and have been described on both the outer and inner mitochondrial membranes (43Sampson M.J. Lovell R.S. Craigen W.J. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18966-18973Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (184) Google Scholar, 44Beavis A.D. Davatol-Hag H. J. Bioenerg. Biomembr. 1996; 28: 207-214Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar). No studies to date have investigated the importance of such channels to the induction of preconditioning, but further studies are needed to clarify their importance. Although previous studies have demonstrated the potentially destructive role of ROS generated during prolonged ischemia/reperfusion (12Ambrosio G. Zweier J.L. Duilio C. Kuppusamy P. Santoro G. Elia P.P. Tritto I. Cirillo P. Condorelli M. Chiarello M. J. Biol. Chem. 1993; 268: 18532-18541Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), a growing body of data suggests that signaling levels of ROS generated by mitochondria may activate intracellular signaling cascades involved in protective responses. In this regard, recent studies have shown that mitochondrial ROS generated during prolonged, moderate hypoxia appear to participate in the reversible suppression of ATP utilization and contraction in cardiomyocytes (45Duranteau J. Chandel N.S. Kulisz A. Shao Z. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1998; 273 (in press)Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (580) Google Scholar). The present study extends those findings by revealing that mitochondrial ROS generated during brief anoxia can also activate signaling cascades involved in protecting cardiomyocytes from subsequent ischemia/reperfusion injury.

Cardiomyocytes suppress contraction and O2 consumption during hypoxia. Cytochrome oxidase undergoes a decrease in V max during hypoxia, which could alter mitochondrial redox and increase generation of reactive oxygen species (ROS). We therefore tested whether ROS generated by mitochondria act as second messengers in the signaling pathway linking the detection of O2 with the functional response. Contracting cardiomyocytes were superfused under controlled O2 conditions while fluorescence imaging of 2,7-dichlorofluorescein (DCF) was used to assess ROS generation. Compared with normoxia (PO2 ∼ 107 torr, 15% O2), graded increases in DCF fluorescence were seen during hypoxia, with responses at PO2 = 7 torr > 20 torr > 35 torr. The antioxidants 2-mercaptopropionyl glycine and 1,10-phenanthroline attenuated these increases and abolished the inhibition of contraction. Superfusion of normoxic cells with H2O2 (25 μm) for >60 min mimicked the effects of hypoxia by eliciting decreases in contraction that were reversible after washout of H2O2. To test the role of cytochrome oxidase, sodium azide (0.75–2 μm) was added during normoxia to reduce theV max of the enzyme. Azide produced graded increases in ROS signaling, accompanied by graded decreases in contraction that were reversible. These results demonstrate that mitochondria respond to graded hypoxia by increasing the generation of ROS and suggest that cytochrome oxidase may contribute to this O2 sensing. Cardiomyocytes suppress contraction and O2 consumption during hypoxia. Cytochrome oxidase undergoes a decrease in V max during hypoxia, which could alter mitochondrial redox and increase generation of reactive oxygen species (ROS). We therefore tested whether ROS generated by mitochondria act as second messengers in the signaling pathway linking the detection of O2 with the functional response. Contracting cardiomyocytes were superfused under controlled O2 conditions while fluorescence imaging of 2,7-dichlorofluorescein (DCF) was used to assess ROS generation. Compared with normoxia (PO2 ∼ 107 torr, 15% O2), graded increases in DCF fluorescence were seen during hypoxia, with responses at PO2 = 7 torr > 20 torr > 35 torr. The antioxidants 2-mercaptopropionyl glycine and 1,10-phenanthroline attenuated these increases and abolished the inhibition of contraction. Superfusion of normoxic cells with H2O2 (25 μm) for >60 min mimicked the effects of hypoxia by eliciting decreases in contraction that were reversible after washout of H2O2. To test the role of cytochrome oxidase, sodium azide (0.75–2 μm) was added during normoxia to reduce theV max of the enzyme. Azide produced graded increases in ROS signaling, accompanied by graded decreases in contraction that were reversible. These results demonstrate that mitochondria respond to graded hypoxia by increasing the generation of ROS and suggest that cytochrome oxidase may contribute to this O2 sensing. Alterations in oxygen tension (PO2) elicit a variety of functional responses in different cell types, including gene expression, altered metabolic function, altered ion channel activation, and release of neurotransmitters (1Bunn H.F. Poyton R.O. Physiol. Rev. 1996; 76: 839-885Crossref PubMed Scopus (1043) Google Scholar). In spontaneously contracting embryonic cardiomyocytes, we previously found significant decreases in contractile activity during prolonged moderate hypoxia (PO2 = 20 torr for >2 h) (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar). This inhibition was not associated with a depletion of ATP or phosphocreatine stores, and was reversible when normoxic conditions were restored. Similar findings of decreased contractile function during hypoxia (48 h at 1% O2) have also been seen in rat cardiac myocytes (3Silverman H.S. Wei S. Haigney M.C.P. Ocampo C.J. Stern M.D. Circ. Res. 1997; 80: 699-707Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar), which suggests that this response is not unique to embryonic cells. An ability to respond to changes in oxygen tension within the physiological range implies the existence of a cellular O2sensor linked to a signal transduction pathway. When activated by hypoxia, the sensor presumably would initiate a signaling cascade which ultimately leads to the functional response (e.g. diminished contractile activity). However, the O2 sensing mechanism and the subsequent signal transduction pathways involved in the cardiomyocyte responses to hypoxia are not known. A number of different potential mechanisms of cellular O2 sensing have been identified (1Bunn H.F. Poyton R.O. Physiol. Rev. 1996; 76: 839-885Crossref PubMed Scopus (1043) Google Scholar). Mitochondria are responsible for most of the O2 consumption by the cell and would seem to be well suited because their localPO2 responds to changes in the ratio of O2 supply to demand. However, the low apparentK m of cytochrome oxidase for O2 (4Cooper C.E. Biochim. Biophys. Acta. 1990; 1017: 187-203Crossref PubMed Scopus (82) Google Scholar, 5Einarsdóttir O. Biochim. Biophys. Acta. 1995; 1229: 129-147Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 6Chance B. Williams G.R. J. Biol. Chem. 1955; 217: 383-393Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar) would appear to render these organelles incapable of detecting changes until very low O2 concentrations are reached. Nevertheless, our studies of hypoxic cardiomyocytes (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar) and of normal rat hepatocytes (7Chandel N. Budinger G.R.S. Kemp R.A. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1995; 268: L918-L925Crossref PubMed Google Scholar, 8Schumacker P.T. Chandel N. Agusti A.G.N. Am. J. Physiol. 1993; 265: L395-L402PubMed Google Scholar) have implicated mitochondria as a likely site of O2sensing underlying their metabolic and functional responses to hypoxia. In this regard, we found that cytochrome oxidase undergoes a ∼50% decrease in V max during exposure to prolonged moderate hypoxia (9Chandel N.S. Budinger G.R.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18672-18677Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (121) Google Scholar). This change was manifested by decreases inN,N,N′,N′-tetramethyl-p-phenylenediamine-ascorbate respiration during hypoxia (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar), and also by increases in [NAD(P)H] autofluorescence (10Chandel N.S. Budinger G.R.S. Choe S.H. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18808-18816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (150) Google Scholar). Collectively, these findings cast a new light on the possible role of mitochondria in the cellular responses to hypoxia in cardiomyocytes. The presence of a cellular O2 sensor implies the existence of a signaling pathway linking it to the targeted response. If mitochondria function as that sensor, what signaling system could be activated by a decrease in the V max of cytochrome oxidase? We hypothesized that a decrease inV max of the oxidase should increase the reduction state of mitochondrial electron carriers upstream of cytochrome aa 3. This should increase the lifetime of reduced electron carriers such as ubisemiquinone, which would increase the generation of superoxide via univalent electron transfer to O2 in the mitochondria (11Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1064) Google Scholar). Trace levels of reactive oxygen species (ROS) 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; DCF, 2,7-dichlorofluorescein; DCFH, reduced DCF; TTFA, thenoyltrifluoroacetone. 1The abbreviations used are: ROS, reactive oxygen species; DCF, 2,7-dichlorofluorescein; DCFH, reduced DCF; TTFA, thenoyltrifluoroacetone. such as superoxide or H2O2 could then potentially act as signaling elements by activating subsequent steps in a signal transduction cascade. Indeed, numerous studies have implicated ROS as participants in a variety of intracellular signaling sequences including members of the stress- and mitogen-activated protein kinases (12Guyton K.Z. Liu Y. Gorospe M. Xu Q. Holbrook N.J. J. Biol. Chem. 1996; 271: 4138-4142Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1138) Google Scholar, 13Laderoute K.R. Webster K.A. Circ. Res. 1997; 80: 336-344Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), the nuclear transcription factors c-Jun and NF-κB (14Flohe L. Brigelius-Flohe R. Saliou C. Traber M.G. Packer L. Free Radical. Biol. Med. 1997; 22: 1115-1126Crossref PubMed Scopus (755) Google Scholar), and other signaling systems (15Lander H.M. FASEB J. 1997; 11: 118-124Crossref PubMed Scopus (820) Google Scholar). The mechanisms responsible for intracellular oxidant generation involved in the activation of those pathways are not fully clear, but could involve mitochondrial sources during hypoxia. The present study therefore sought to test the hypothesis that ROS are generated by mitochondria during hypoxia in cardiomyocytes, and that ROS signaling is involved in coupling the O2 sensor to the contractile response to hypoxia. Embryonic chick cardiomyocytes were isolated using a method (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar) modified from Barry et al. (16Barry W.H. Pober J. Marsh J.D. Frankel S.R. Smith T.W. Am. J. Physiol. 1980; 239: H651-H657PubMed Google Scholar). Briefly, hearts of 10–11-day-old chick embryos were removed and placed in Hank's balanced salt solution lacking magnesium and calcium (Life Technologies, Inc.). Ventricular tissue was minced and the cells were dissociated using four to six cycles of trypsin (0.025%, Life Technologies, Inc.) degradation at 37 °C with gentle agitation. Trypsin digestion was halted after 8 min by transferring the cells to a trypsin inhibitor solution. After filtering (100-μm mesh), the cells were centrifuged for 5 min at 1200 rpm at 4 °C and resuspended in nutritive medium. Cells then were placed in a Petri dish in a humidified incubator (5% CO2, 95% air at 37 °C) for 45 min to promote early adherence of fibroblasts. Nonadherent cells then were counted with a hemacytometer, and their viability was measured using trypan blue (0.4%). Approximately 1 × 106cells in nutritive medium (54% Barry's solution (in mm: NaCl (116), KCl (1.3), NaHCO3 (22Petersen L.C. Biochim. Biophys. Acta. 1977; 460: 299-307Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar), MgSO4(0.8), NaH2PO4 (1.0), CaCl2 (0.87), glucose (5.6)), 40% M199 with Earle's salts (Life Technologies, Inc.), 6% heat inactivated fetal bovine serum, penicillin (100 units/ml), and streptomycin (100 mg/ml)) were plated onto glass coverslips (25 mm). Cell yield averaged 5–6 × 105cells per embryo. Cells were maintained in a humidified incubator for 2–3 days, at which point synchronous contractions of the monolayer were noted. Experiments were performed on spontaneously contracting cells at day 3 or 4 after isolation. Rat hepatocytes were isolated using the methodology described previously (8Schumacker P.T. Chandel N. Agusti A.G.N. Am. J. Physiol. 1993; 265: L395-L402PubMed Google Scholar). Spontaneously contracting myocytes on glass coverslips were placed in a stainless steel flow-through chamber (1-ml volume, Penn Century Co., Philadelphia). The chamber was sealed using thin-wafer gaskets to minimize any O2 exchange between the chamber wall and the perfusate, and mounted on a heated (37 °C) platform (Warner Instruments) on an inverted microscope. A water-jacketed glass equilibration column (37 °C) mounted above the microscope stage was used to equilibrate the perfusate to known O2 tensions (PO2). The perfusate consisted of a buffered salt solution (BSS) (in mm: NaCl (117), KCl (4.0), NaHCO3 (18Lo L.W. Koch C.J. Wilson D.F. Anal. Biochem. 1996; 236: 153-160Crossref PubMed Scopus (227) Google Scholar), MgSO4 (0.8), NaH2PO4 (1.0), CaCl2 (1.21), glucose (5.6)). The gas used to control the PO2and PCO2 of the perfusate was supplied by a precision mass flow controller. Stainless steel or low O2solubility polymer tubing was used to connect the equilibration column to the flow-through chamber in an effort to minimize any ambient O2 transfer into the perfusate. In previous studies, thePO2 in the chamber was confirmed under conditions identical to those of the experiments using an optical phosphorescence quenching method (17Wilson D.F. Rumsey W.L. Green T.J. Vanderkooi J.M. J. Biol. Chem. 1988; 263: 2712-2718Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 18Lo L.W. Koch C.J. Wilson D.F. Anal. Biochem. 1996; 236: 153-160Crossref PubMed Scopus (227) Google Scholar) (Oxyspot, Medical Systems Inc.). An inverted microscope was equipped for epifluorescent illumination and included a xenon light source (75 W), a 12-bit digital cooled CCD camera (Princeton Instruments), a shutter and filter wheel (Sutter), and appropriate excitation and emission filter cubes. The microscope also was equipped with Hoffman-modified phase illumination to accentuate surface topology, facilitating the measurement of contractile motion (see below). Fluorescent cell images were obtained using a 40× oil immersion objective (Nikon Plan Fluor). Data were acquired and analyzed using Metamorph software (Universal Imaging). ROS generation in cells was assessed using the probe 2,7-dichlorofluorescein (DCF) (Molecular Probes). The membrane-permeable diacetate form of the dye (reduced DCF (DCFH-diacetate)) was added to the perfusate at a final concentration of 5 μm. Within the cell, esterases cleave the acetate groups on DCFH-diacetate, thus trapping the reduced probe (DCFH) intracellularly (19Sawada G.A. Raub T.J. Decker D.E. Buxser S.E. Cytometry. 1996; 25: 254-262Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). ROS in the cells oxidize DCFH, yielding the fluorescent product DCF (20Rothe G. Valet G. J. Leukoc. Biol. 1990; 47: 440-448Crossref PubMed Scopus (780) Google Scholar). Our previous studies of the behavior of DCFH in cardiomyocytes revealed that the probe is readily oxidized by H2O2 or hydroxyl radical, but is relatively insensitive to superoxide (21Vanden Hoek T.L. Li C. Shao Z. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2571-2583Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (332) Google Scholar). Fluorescence was measured using an excitation wavelength of 480 nm, dichroic 505-nm long pass, and emitter bandpass of 535 nm (Chroma Technology) using neutral density filters to attenuate the excitation light. Fluorescence intensity was assessed in clusters of several (<10) cells identified as regions of interest, and background was identified as an area without cells or with minimal cellular fluorescence. Intensity values are reported as percent of initial values, after subtracting background. Cell motion was recorded during low intensity visible light illumination using Hoffman modulation optics to accentuate the cellular topological changes during contraction. Images were recorded at video rates on magnetic tape using a high resolution video camera (Hammamatsu). During later analysis, sequential video frames were digitized, and pixels were assigned an intensity value ranging from 0 to 255. For each pixel, the absolute change in intensity was summed over ∼250 frames. These summed changes in intensity were summed for all pixels, providing a single measure of motion in the field that consistently described the motion that already was evident by inspection. This analysis was carried out using a series of macro instructions in the Metamorph imaging software. In different experiments the cells were treated with the electron transport inhibitors thenoyltrifluoroacetone (TTFA), antimycin A, and rotenone (Sigma). The antioxidants 2-mercaptopropionyl glycine and 1,10-phenanthroline were also obtained from Sigma. Cultured embryonic cardiomyocytes on coverslips were placed in a flow-through chamber on an inverted microscope and perfused with buffered salt solution containing DCFH-diacetate (5 μm) under controlled O2 conditions. Fig. 1 shows the effect of hypoxia at different levels of PO2on DCF fluorescence in cardiomyocytes. Compared with normoxic cells superfused with buffered salt solution equilibrated with 15% O2 (PO2 ∼ 107 torr), cells perfused at PO2 = 35, 20, or 7 torr for 2 h showed significant increases in fluorescence that correlated with the degree of hypoxia. Restoration of normoxia at t = 150 min was associated with a progressive decrease in fluorescence, which could represent either intracellular reduction of the oxidized probe or escape of the oxidized probe from the cell. Fig. 1 b shows the effect of graded hypoxia on spontaneous contractile motion in the same cells shown in Fig. 1 a. Contractile motion was assessed by periodically recording motion at video rates under low-light illumination conditions for 1 min. Graded decreases in contractile motion were seen during hypoxia, which were reversible when normoxic conditions were restored. These results were consistent with our previous studies (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar). As seen previously, the decrease in contraction did not develop immediately but required 1–2 h to reach a stable level of inhibition. Likewise, full recovery of motion required 2–3 h after restoration of normoxia. To confirm that oxidant signaling was responsible for these changes, the study was repeated (3% O2, PO2∼ 20 torr) in the presence of the thiol reducing agent 2-mercaptopropionyl glycine (300 μm) and the metal chelator 1,10-phenanthroline (10 μm). In the presence of these antioxidants, the increases in cell fluorescence were significantly attenuated (Fig. 2). To determine the source of oxidants during hypoxia, cells loaded with DCFH were incubated atPO2 ∼ 20 torr (3% O2) while DCF fluorescence images were acquired. The mitochondrial electron transport inhibitors rotenone (1 μg/ml) and TTFA (10 μm) subsequently were added to block electron supply to ubiquinol, thereby limiting the formation of ubisemiquinone. This produced a rapid decrease in DCF fluorescence during hypoxia (Fig.3 a). In another experiment, cardiomyocytes loaded with DCFH and perfused under hypoxic conditions were given antimycin A, which inhibits the oxidation of cytochromeb 566, thereby increasing the lifetime of ubisemiquinone (11Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1064) Google Scholar). This produced a further increase in DCFH oxidation, as detected from fluorescence measurements (Fig.3 b). To test whether oxidant signaling was involved in the suppression of contraction seen during prolonged moderate hypoxia, the antioxidants 2-mercaptopropionyl glycine (300 μm) and 1,10-phenanthroline (10 μm) were added to the perfusate during hypoxia (3% O2). As shown in Fig. 4, antioxidant treatment abolished the decreases in contractile motion seen during hypoxia, thus implicating ROS in the functional response to hypoxia. Conceivably, superoxide generated by the mitochondrial electron transport system could activate subsequent signaling steps by oxidizing a substrate directly. Alternatively, dismutation of superoxide by superoxide dismutase could yield H2O2, which could function as the active intermediate in this response. To test this possibility, contractile motion was studied in cardiomyocytes perfused with different concentrations of H2O2under normoxic conditions. Fig. 5 shows the effect of 120 min perfusion with H2O2 (25 μm) on contractile motion. Within 1 h, significant decreases in contractile motion were detected. Washout of H2O2 was associated with recovery of contractile motion, although this required several hours to reach baseline levels. Interestingly, lower concentrations of H2O2 (<10 μm) did not significantly affect contractile motion during perfusion for 1 h, while higher concentrations of H2O2 (>50 μm) elicited a marked decrease or cessation of contractile activity which did not return during recovery (data not shown). Previous studies of cytochrome oxidase revealed a decrease in the V max of the enzyme during hypoxia (9Chandel N.S. Budinger G.R.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18672-18677Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (121) Google Scholar). Such a change could alter the mitochondrial redox state and accelerate ROS generation by mitochondria during hypoxia. If so, then inhibitors of cytochrome oxidase that reduce theV max of the enzyme during normoxia should mimic that effect. To test this we used sodium azide, a noncompetitive inhibitor of the oxidase (22Petersen L.C. Biochim. Biophys. Acta. 1977; 460: 299-307Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar) to partially inhibit the oxidase during normoxia. Fig. 6 a shows the effect of different concentrations of azide on DCF fluorescence in cultured cardiomyocytes maintained at PO2 ∼ 107 torr. Low concentrations of azide (0.75–1 mm) produced graded increases in fluorescence that decreased after washout of the inhibitor. Greater increases in fluorescence were observed with higher concentrations of azide (2–5 mm), which also were reversible after removal of azide. Fig. 6 b shows the effects of azide on contractile motion of cardiomyocytes. Dose-dependent progressive decreases in contractile motion were observed during 2 h of azide treatment, which were reversible after removal of the inhibitor. However, rapid and irreversible decreases in contraction were seen with high concentrations of azide (5 mm), which were suggestive of cellular injury. To test whether O2-dependent decreases in cytochrome oxidase V max were responsible for the increase in ROS generation during hypoxia, primary rat hepatocytes were loaded with 2,7-dichlorofluorescin and studied during normoxia (1 h) followed by hypoxia (3% O2, 2 h) and reoxygenation (1 h) (Fig. 7). In previous studies, hepatocytes were shown to require 1–2 h of hypoxia in order to elicit the decrease in V max of the oxidase (8Schumacker P.T. Chandel N. Agusti A.G.N. Am. J. Physiol. 1993; 265: L395-L402PubMed Google Scholar), whereas the oxidase in cardiomyocytes responded within 10 min of hypoxia (23Vanden Hoek T.L. Shao Z. Li C. Zak R. Schumacker P.T. Becker L.B. Am. J. Physiol. 1996; 270: H1334-H1341PubMed Google Scholar). Therefore, ROS generation should correlate temporally with the changes in V max of the oxidase among different cell types. In accordance with this hypothesis, hepatocytes showed minimal increase in DCF fluorescence during the first hour of hypoxia, but demonstrate a more rapid increase at 1.5–2 h. Upon reoxygenation, cellular fluorescence decreased toward baseline levels. Control cells maintained under normoxic conditions for the same period showed minimal increases in DCF fluorescence. Many cell types respond to changes in the local O2concentration by activating functional or adaptive responses. This suggests the existence of an O2 sensor coupled to a signal transduction system, which ultimately triggers the functional response. Although a variety of O2 sensing mechanisms are known to exist (1Bunn H.F. Poyton R.O. Physiol. Rev. 1996; 76: 839-885Crossref PubMed Scopus (1043) Google Scholar), our previous studies suggested that mitochondria may act in that role in embryonic cardiomyocytes (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar, 24Budinger G.R.S. Duranteau J. Chandel N.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1998; 273: 3320-3326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar). The present study aimed to test the hypothesis that ROS generated by mitochondria act as second messengers in the contractile response to physiological levels of hypoxia in those cells. Our data show that mitochondrial ROS generation increases as the concentration of O2 decreases during hypoxia. Compared with normoxia (15% O2), graded increases in DCFH oxidation were observed at 5%, 3% and 1% O2, with the highest levels of oxidant signaling seen at the lowest O2 concentrations. Administration of antioxidants attenuated this oxidant signaling, and also abolished the decrease in contractile function seen during prolonged hypoxia. Dose-dependent inhibition of cytochrome oxidase with azide produced graded increases in ROS generation during normoxia and elicited reversible decreases in contraction. Exogenous administration of H2O2 produced reversible decreases in contraction during normoxia that mimicked the response to hypoxia. Collectively, these observations suggest thatPO2-dependent mitochondrial ROS generation participates in the signal transduction cascade linking the O2 sensor with the contractile response via the sequence of events: hypoxia → decreased cytochrome oxidaseV max → increased mitochondrial redox → increased mitochondrial superoxide generation → increased H2O2 generation → subsequent signaling steps → decreased contraction. The data suggest that ROS released from mitochondria participate as second messengers in the signaling pathway linking the O2 sensor to the decrease in contractile function of cardiomyocytes. We propose that the decreases in contractile function and O2consumption are a consequence of decreased ATP utilization (24Budinger G.R.S. Duranteau J. Chandel N.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1998; 273: 3320-3326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (137) Google Scholar), possibly arising from a signaling sequence that inhibits activation of the actin-myosin ATPase system. ROS would appear to act at an early step in this sequence, since the contractile response to hypoxia or exogenous of H2O2 required 1–2 h to develop, and recovery from these activators required 2–3 h for completion. The low levels of ROS generation during hypoxia do not appear to be toxic, as judged by the ability of the cells to recover contractile function after restoration of normoxia, and the absence of any loss of cell viability despite prolonged hypoxia noted previously (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar). Our study did not investigate steps subsequent to H2O2generation, but a growing number of studies indicate an important role of ROS in a variety of intracellular signaling pathways (14Flohe L. Brigelius-Flohe R. Saliou C. Traber M.G. Packer L. Free Radical. Biol. Med. 1997; 22: 1115-1126Crossref PubMed Scopus (755) Google Scholar, 25Monteiro H.P. Stern A. Free Radical. Biol. Med. 1996; 21: 323-333Crossref PubMed Scopus (219) Google Scholar, 26Suzuki Y.J. Forman H.J. Sevanian A. Free Radical. Biol. Med. 1997; 22: 269-285Crossref PubMed Scopus (1255) Google Scholar). For example, Guyton et al. (12Guyton K.Z. Liu Y. Gorospe M. Xu Q. Holbrook N.J. J. Biol. Chem. 1996; 271: 4138-4142Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1138) Google Scholar) have shown that H2O2 can cause activation of mitogen-activated protein kinase (ERK-2, p44); Lander et al. (27Lander H.M. Hajjar D.P. Hempstead B.L. Mirza U.A. Chait B.T. Campbell S. Quilliam L.A. J. Biol. Chem. 1997; 272: 4323-4326Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (446) Google Scholar) have described a mechanism allowing nitric oxide to regulate the G protein p21 ras, and ROS appear to participate in the activation of stress-activated protein kinases (JNKs/SAPKs) (13Laderoute K.R. Webster K.A. Circ. Res. 1997; 80: 336-344Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar). Future studies will be required to clarify the later steps in the signal transduction cascade responsible for the inhibition of contraction. Mitochondria have long been recognized as sites where reactive oxygen species are generated in cells. In the electron transport chain, ubisemiquinone (11Turrens J.F. Alexandre A. Lehninger A.L. Arch. Biochem. Biophys. 1985; 237: 408-414Crossref PubMed Scopus (1064) Google Scholar) appears to be a major site of superoxide generation because of its predisposition for univalent electron transfer to O2. Indeed, it has been estimated that superoxide generation accounts for 1–2% of mitochondrial O2 consumption even under normal conditions (28Boveris A. Oshino N. Chance B. Biochem. J. 1972; 128: 617-630Crossref PubMed Scopus (1216) Google Scholar). Two pieces of evidence support the conclusion that mitochondria were the source of ROS signals in our study. First, electron transport inhibition with rotenone (site I) plus TTFA (site II) attenuated the ROS signal during hypoxia, whereas antimycin A, an inhibitor of complex III, accelerated oxidant production (Fig.8). Rotenone and TTFA limit the formation of superoxide by attenuating formation of ubisemiquinone, whereas antimycin A augments superoxide generation by increasing the lifetime of that intermediate. Collectively, these results demonstrate that mitochondria function as a source of ROS during hypoxia, generating increasing amounts of oxidants at lower oxygen concentrations. This behavior could allow mitochondria to function as a cellular O2 sensor at physiological levels of hypoxia. Many different oxidase systems could conceivably contribute to the generation of ROS in cells. For example, Wolin and colleagues identified a cytosolic NADH oxidoreductase whose ROS generation varies in response to changes in PO2over a wide physiological range (29Mohazzab-H K.M. Fayngersh R.P. Kaminski P.M. Wolin M.S. Am. J. Physiol. 1995; 269: L637-L644PubMed Google Scholar). Using homogenates of cardiac myocytes, they found that addition of NADH (but not NADPH) caused a marked increase in superoxide generation, as detected by lucigenin chemiluminescence (30Mohazzab-H K.M. Kaminski P.M. Wolin M.S. Circulation. 1997; 96: 614-620Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar). Those results suggest that the NADH-dependent oxidase is responsive to cytosolic, rather than mitochondrial, NAD(H) redox. However, their lucigenin chemiluminescence signal increased with PO2, and was greatest during 21% O2 incubation. During hypoxia their chemiluminescence signal decreased, becoming undetectable atPO2 = 8–10 torr. By contrast, using DCFH we found increases in mitochondrial oxidant generation at lowPO2 values, with the highest levels at 1% O2 (PO2 ∼ 7 torr). Because the decrease in contractile motion during hypoxia was abolished with antioxidants, and the ROS generation detected with DCFH increased under hypoxia, we conclude that the functional response to hypoxia in our study must have involved an increase in ROS production from mitochondria, rather than decreased ROS generation at lowPO2 from NAD(P)H oxidases. The factors that control the rate of ROS production by mitochondria are not fully understood, but likely include (a) the reduction state of the mitochondrial electron transport system and (b) availability of O2. Factors that increase the reduction state of the electron carriers appear to increase the generation of superoxide, even when [O2] is low. For example, accelerated mitochondrial ROS generation has been shown to occur during ischemic conditions when electron carriers are highly reduced and the cells are nearly anoxic (21Vanden Hoek T.L. Li C. Shao Z. Schumacker P.T. Becker L.B. J. Mol. Cell. Cardiol. 1997; 29: 2571-2583Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (332) Google Scholar, 31Piantadosi C.A. Zhang J. Stroke. 1996; 27: 327-332Crossref PubMed Scopus (310) Google Scholar). Likewise, increases in mitochondrial redox at a given [O2] appear to increase ROS generation (32Partridge R.S. Nonroe S.M. Parks J.K. Johnson K. Parker Jr., W.D. Eaton G.R. Eaton S.S. Arch. Biochem. Biophys. 1994; 310: 210-217Crossref PubMed Scopus (56) Google Scholar). For example, both azide and antimycin A produced increases in reduction of ubiquinone during normoxia, which led to the increases in DCF fluorescence. Thus, mitochondrial superoxide generation appears to respond to changes in redox state at a given availability of O2. In our study, the increases in ROS detected during hypoxia suggest that mitochondrial reduction must have increased as PO2 was lowered. Two models could conceivably explain this change. First, we previously reported thatV max of cytochrome oxidase decreases by ∼50% during hypoxia in cardiac myocytes (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar), normal rat hepatocytes (8Schumacker P.T. Chandel N. Agusti A.G.N. Am. J. Physiol. 1993; 265: L395-L402PubMed Google Scholar, 10Chandel N.S. Budinger G.R.S. Choe S.H. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18808-18816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (150) Google Scholar), rat liver mitochondria (7Chandel N. Budinger G.R.S. Kemp R.A. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1995; 268: L918-L925Crossref PubMed Google Scholar), liver submitochondrial particles (10Chandel N.S. Budinger G.R.S. Choe S.H. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18808-18816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (150) Google Scholar), and in isolated bovine heart cytochrome oxidase (9Chandel N.S. Budinger G.R.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18672-18677Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (121) Google Scholar). We now suggest that the increase in mitochondrial reduction caused by the decrease in cytochrome oxidase V max elicits an increase in mitochondrial superoxide generation. A second mechanism tending to increase mitochondrial reduction during hypoxia was described by Wilson and co-workers who measured cytochromec reduction as PO2 was reduced from 150 torr toward zero (17Wilson D.F. Rumsey W.L. Green T.J. Vanderkooi J.M. J. Biol. Chem. 1988; 263: 2712-2718Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 33Erecinska M. Wilson D.F. J. Membr. Biol. 1982; 70: 1-14Crossref PubMed Scopus (326) Google Scholar). According to their model, small increases in cytochrome c reduction occur at physiological levels of hypoxia, which tend to maintain a constant electron flux (and thus O2 consumption rate) until critically low levels of [O2] are reached. Although the increases in cytochromec reduction they reported were small during physiological hypoxia, they may nevertheless have been sufficient to augment superoxide generation. To distinguish the relative importance of these two mechanisms, we compared the ROS response in cardiac myocytes to that in normal rat hepatocytes. In their studies ofPO2-dependent cytochromec reduction, Wilson and co-workers observed increases in reduction within seconds after the start of hypoxia in a wide variety of cell types (17Wilson D.F. Rumsey W.L. Green T.J. Vanderkooi J.M. J. Biol. Chem. 1988; 263: 2712-2718Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 34Wilson D.F. Erecinska M. Drown C. Silver I.A. Arch. Biochem. Biophys. 1979; 195: 485-493Crossref PubMed Scopus (251) Google Scholar, 35Rumsey W.L. Schlosser C. Nuutinen E.M. Robiolio M. Wilson D.F. J. Biol. Chem. 1990; 265: 15392-15399Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). We previously noted that cytochrome oxidase differs among cell types with respect to the duration of hypoxia required to elicit a decrease in its V max. The oxidase in embryonic cardiac myocytes responded to hypoxia within 10 min (2Budinger G.R.S. Chandel N. Shao Z.H. Li C.Q. Melmed A. Becker L.B. Schumacker P.T. Am. J. Physiol. 1996; 14: L37-L53Google Scholar), whereas rat hepatocytes required incubation under hypoxia for 1 to 2 h to elicit a change in V max (8Schumacker P.T. Chandel N. Agusti A.G.N. Am. J. Physiol. 1993; 265: L395-L402PubMed Google Scholar,10Chandel N.S. Budinger G.R.S. Choe S.H. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18808-18816Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (150) Google Scholar). If the decrease in V max were responsible for the increase in ROS signal during hypoxia, then increased DCF fluorescence should not occur in hepatocytes until they had been hypoxic for >1–2 h. In contrast, if thePO2-dependent increases in mitochondrial redox described by Wilson and colleagues were responsible, the increases in ROS production would occur immediately in both cell types. As shown in Fig. 7, hepatocytes loaded with DCFH and superfused at 3% O2 showed an increase in fluorescence that did not begin until 1–2 h after the start of hypoxia, and which decreased after return of normoxia. By contrast, increases in DCF fluorescence were evident after 15 min of hypoxia in the cardiomyocytes. We conclude that changes in theV max of cytochrome oxidase during hypoxia, rather than O2-dependent changes in mitochondrial reduction state (17Wilson D.F. Rumsey W.L. Green T.J. Vanderkooi J.M. J. Biol. Chem. 1988; 263: 2712-2718Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar), must have been responsible for the increase in ROS signaling during hypoxia. As a noncompetitive inhibitor of cytochrome oxidase (22Petersen L.C. Biochim. Biophys. Acta. 1977; 460: 299-307Crossref PubMed Scopus (151) Google Scholar), azide has effects that depend on its concentration. At high concentrations (≥2 mm) it is possible that azide could throttle mitochondrial respiration by inhibiting cytochrome oxidase. However, lower concentrations (≤2 mm) should mimic the effects of hypoxia by partially inhibiting cytochrome oxidase. This should lower the V max of the oxidase via non-competitive inhibition during normoxia. Indeed, the dose-dependent increase in reduction of electron carriers caused a graded increase in ROS generation detected by DCFH, which mediated a progressive and reversible suppression of contractile activity. However, previous studies of the effects of O2 on cytochrome oxidase V max suggested that the oxidase can function in either of two kinetic states, rather than over continuous spectrum (9Chandel N.S. Budinger G.R.S. Schumacker P.T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 18672-18677Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (121) Google Scholar). Therefore, when hypoxia induces a step decrease in cytochrome oxidase V max, a step increase in superoxide generation should be seen. In this respect, the graded increases in oxidant signaling seen at lowerPO2 levels would seem paradoxical, because mitochondrial redox should remain constant while O2availability for superoxide generation would decrease. These observations suggest that additional factors may influence the rate of superoxide generation at different levels of moderate hypoxia. Further studies will be required to fully delineate the mechanisms controlling superoxide generation in the intact cell at graded levels of hypoxia.

While cellular responses to low oxygen (O2) or hypoxia have been studied extensively, the precise identity of mammalian cellular O2 sensors remains controversial. Using murine embryonic cells lacking cytochrome c, and therefore mitochondrial activity, we show that mitochondrial reactive oxygen species (mtROS) are essential for proper O2 sensing and subsequent HIF-1α and HIF-2α stabilization at 1.5% O2. In the absence of this signal, HIF-α subunits continue to be degraded. Furthermore, exogenous treatment with H2O2 or severe O2 deprivation is sufficient to stabilize HIF-α even in the absence of cytochrome c and functional mitochondria. These results provide genetic evidence indicating that mtROS act upstream of prolyl hydroxylases in regulating HIF-1α and HIF-2α in this O2-sensing pathway.

The transcription factor NF-kappa B stimulates the transcription of proinflammatory cytokines including TNF-alpha. LPS (endotoxin) and hypoxia both induce NF-kappa B activation and TNF-alpha gene transcription. Furthermore, hypoxia augments LPS induction of TNF-alpha mRNA. Previous reports have indicated that antioxidants abolish NF-kappa B activation in response to LPS or hypoxia, which suggests that reactive oxygen species (ROS) are involved in NF-kappa B activation. This study tested whether mitochondrial ROS are required for both NF-kappaB activation and the increase in TNF-alpha mRNA levels during hypoxia and LPS. Our results indicate that hypoxia (1.5% O2) stimulates NF-kappa B and TNF-alpha gene transcription and increases ROS generation as measured by the oxidant sensitive dye 2',7'-dichlorofluorescein diacetate in murine macrophage J774.1 cells. The antioxidants N-acetylcysteine and pyrrolidinedithiocarbamic acid abolished the hypoxic activation of NF-kappa B, TNF-alpha gene transcription, and increases in ROS levels. Rotenone, an inhibitor of mitochondrial complex I, abolished the increase in ROS signal, the activation of NF-kappa B, and TNF-alpha gene transcription during hypoxia. LPS stimulated NF-kappa B and TNF-alpha gene transcription but not ROS generation in J774.1 cells. Rotenone, pyrrolidinedithiocarbamic acid, and N-acetylcysteine had no effect on the LPS stimulation of NF-kappa B and TNF-alpha gene transcription, indicating that LPS activates NF-kappa B and TNF-alpha gene transcription through a ROS-independent mechanism. These results indicate that mitochondrial ROS are required for the hypoxic activation of NF-kappa B and TNF-alpha gene transcription, but not for the LPS activation of NF-kappa B.