Rhizopus oryzae is the primary cause of mucormycosis, an emerging, life-threatening infection characterized by rapid angioinvasive growth with an overall mortality rate that exceeds 50%. As a representative of the paraphyletic basal group of the fungal kingdom called “zygomycetes,” R. oryzae is also used as a model to study fungal evolution. Here we report the genome sequence of R. oryzae strain 99–880, isolated from a fatal case of mucormycosis. The highly repetitive 45.3 Mb genome assembly contains abundant transposable elements (TEs), comprising approximately 20% of the genome. We predicted 13,895 protein-coding genes not overlapping TEs, many of which are paralogous gene pairs. The order and genomic arrangement of the duplicated gene pairs and their common phylogenetic origin provide evidence for an ancestral whole-genome duplication (WGD) event. The WGD resulted in the duplication of nearly all subunits of the protein complexes associated with respiratory electron transport chains, the V-ATPase, and the ubiquitin–proteasome systems. The WGD, together with recent gene duplications, resulted in the expansion of multiple gene families related to cell growth and signal transduction, as well as secreted aspartic protease and subtilase protein families, which are known fungal virulence factors. The duplication of the ergosterol biosynthetic pathway, especially the major azole target, lanosterol 14α-demethylase (ERG11), could contribute to the variable responses of R. oryzae to different azole drugs, including voriconazole and posaconazole. Expanded families of cell-wall synthesis enzymes, essential for fungal cell integrity but absent in mammalian hosts, reveal potential targets for novel and R. oryzae-specific diagnostic and therapeutic treatments.

ABSTRACT Plant growth is dependent on oriented cell divisions that employ the microtubular preprophase band (PPB) to position the cell plate. It has been intriguing how this transient cytoskeletal array imprints the spatial information to be read by the cytokinetic phragmoplast at later stages of mitotic cell division. In Arabidopsis thaliana , we discovered that the PPB recruited the Myosin XI motor MYA1 to the cortical division site where it joined microtubule-associated proteins and motors to form a ring of prominent cytoskeletal assemblies which received the expanding phragmoplast. This regulatory function of MYA1 in phragmoplast guidance is dependent on intact actin filaments. The discovery of these assemblies revealed the mechanism underlying how two dynamic cytoskeletal networks govern PPB-dependent division plane orientation during vegetative growth in flowering plants. ONE-SENTENCE SUMMARY Myosin XI joins microtubule-associated proteins and motors to form cortical assemblies to demarcate the cell division site.

In plant vegetative tissues, cell division employs a mitotic microtubule array called the preprophase band (PPB) that marks the cortical division site. This transient cytoskeletal array imprints the spatial information to be read by the cytokinetic phragmoplast at later stages of mitotic cell division. In Arabidopsis thaliana, we discovered that the PPB recruited the Myosin XI motor MYA1/Myo11F to the cortical division site, where it joined microtubule-associated proteins and motors to form a ring of prominent cytoskeletal assemblies that received the expanding phragmoplast. Such a myosin localization pattern at the cortical division site was dependent on the POK1/2 Kinesin-12 motors. This regulatory function of MYA1/Myo11F in phragmoplast guidance was dependent on intact actin filaments. The discovery of these cytoskeletal motor assemblies pinpoints a mechanism underlying how two dynamic cytoskeletal networks work in concert to govern PPB-dependent division plane orientation in flowering plants.

ABSTRACT Mitosis is monitored by the spindle assembly checkpoint (SAC) which remains active until all chromosomes have their kinetochores attached to microtubules originated from opposite spindle poles. Plants produce both highly conserved and sequence-diverged SAC components, so it has been largely unknown how SAC activation leads to the assembly of these proteins at the unattached kinetochores to prevent anaphase onset in plants. In Arabidopsis thaliana , the noncanonical BUB3.3 protein was detected at kinetochores throughout mitosis, unlike MAD1 and the plant specific BUB1/MAD3 family protein BMF3 that associated with unattached chromosomes only. However, BUB3.3 was required to arrest mitotic progression when one or more chromosomes did not congress at the metaphase plate. Nevertheless, BUB3.3 was not required for the kinetochore localization of other SAC components and vice versa . BUB3.3 specifically interacted with BMF3 in a novel region containing two internal repeats that were not required for the kinetochore localization of BMF3. This interaction was important for BMF3 to recruit the CDC20 protein to the unattached kinetochores. Our results showed that the Arabidopsis BUB3.3 protein functioned in the activation of BMF3 for CDC20 recruitment, rather than the recruitment of BMF proteins as what has been found in fungi and animals, in order to arrest mitosis at prometaphase. Therefore, activated SAC resulted in BUB3.3-independent localization of BMF3 and MAD1 to kinetochores and BUB3.3-dependent licensing of BMF3 for CDC20 recruitment in A . thaliana . SIGNIFICANCE STATEMENT Mitotic progression into anaphase is monitored by spindle assembly checkpoint that is poorly understood in plants. Using Arabidopsis thaliana as a reference system, we discovered a novel interaction pattern centered at the BUB1 and MAD3 protein BMF3 at kinetochores. A noncanonical isoform of the evolutionarily conserved BUB3 family protein BUB3.3 interacted with two novel internal repeats in BMF3 for recruiting the CDC20 protein to unattached kinetochores in order to inhibit its function in anaphase onset. Hence, our work sheds light on how spindle assembly checkpoint operates in flowering plants that produce the highly conserved BUB3.3 protein but highly divergent BMF proteins.

In animals and fungi, cytoplasmic dynein is a processive motor that plays dominant roles in various intracellular processes. In contrast, land plants lack cytoplasmic dynein but contain many minus-end-directed kinesin-14s. No plant kinesin-14 is known to produce processive motility as a homodimer. OsKCH2 is a plant-specific kinesin-14 with an N-terminal actin-binding domain and a central motor domain flanked by two predicted coiled-coils (CC1 and CC2). Here, we show that OsKCH2 specifically decorates preprophase band microtubules in vivo and transports actin filaments along microtubules in vitro. Importantly, OsKCH2 exhibits processive minus-end-directed motility on single microtubules as individual homodimers. We find that CC1 but not CC2 forms the coiled-coil for OsKCH2 dimerization. Instead, CC2 functions to enable OsKCH2 processivity by enhancing its binding to microtubules. Collectively, these results show that land plants have evolved unconventional kinesin-14 homodimers with inherent minus-end-directed processivity that may function to compensate for the loss of cytoplasmic dynein.

Abstract The evolutionarily conserved Microspherule protein 1 (MCRS1) has diverse functions from transcriptional regulation to stabilization of microtubule minus ends in acentrosomal spindles in mammals. A previous study suggested that in the model plant Arabidopsis thaliana , inactivation of an MCRS1 homolog gene led to aborted embryogenesis. To test whether this lethality was caused by defects associated with transcription or mitosis, we used the heterozygous mcrs1 mutant to examine whether the gene was required for mitosis during gametogenesis. Results of reciprocal crosses between the mcrs1 mutant and the wild-type plant showed that the MCRS1 gene was dispensable for mitotic cell divisions associated with the development of both male and female gametophytes. An MCRS1-GFP fusion protein was expressed in the mcrs1 mutant and suppressed the mutation as reported by restored growth. This functional fusion protein exclusively localized to interphase nuclei and became undetectable during mitosis before returning to the reforming daughter nuclei. Affinity purification of the MCRS1-GFP protein resulted in consistent recovery of the Myb-like transcription factor DRMY1 (Developmentally Regulated Myb-like1) but not microtubule-associated factors. The association was further supported by the evidence of a direct interaction in living cells. Hence, the plant MCRS1 was concluded to play a role in the gene transcription in sporophyte development.

Abstract The C-type hybrid-proline-rich protein (HyPRP) AtCWLP and its homolog AtPRP940 are referred as cell wall (CW)-plasma-membrane (PM) linker proteins, but little is known about their functions. Here we show that N-terminal proline-rich domains of CWLP and PRP940, containing glycosylated hydroxyproline residues, contact the CW, while their C-terminal 8CM domains function as PM-scaffolds. Both proteins are detected in PM nanodomains (PM-ND) and show co-localization and co-immunoprecipitation with aquaporins PIP2;1 and PIP2;7. Inhibition of actin polymerization by latrunculin B promotes CWLP-endosome appearance, while blocking the actomyosin-based transport by a truncated form of myosin XI-K relaxes lateral boundaries of CWLP-PIP2;1 PD-NDs. Mass spectrometry data indicate that CWLP co-purifies with dynamins implicated in fission of endocytic PD-ND invaginations. Lack of co-localization and co-immunoprecipitation with aquaporin-binding flotillin (FLOT2) indicates that CWLP and PRP940 mark a new distinct type of PM-ND. Yeast two-hybrid and co-immunoprecipitation assays demonstrate that CWLP and PRP940 interact with multiple aquaporins and several protein phosphatase PP2A-B’’ regulatory subunits. By preventing irreversible separation of CW and PM, and likely assisting PP2A-mediated dephosphorylation of aquaporins and closure of their water channels, overexpression of CWLP confers tolerance to plasmolysis, dehydration and freezing in Arabidopsis and to water shortage in potato plants. Summary Statement Arabidopsis Hybrid-Proline-Rich Proteins CWLP and PRP940 occur in association with dynamins, recruit PP2A protein phosphatases to aquaporin water channels in plasma-membrane (PM) nanodomains and elevate tolerance to cellular dehydration.

Aurora kinases are key regulators of mitosis. Multicellular eukaryotes generally possess two functionally diverged types. In plants like Arabidopsis, these are termed α versus β Auroras. As the functional specification of Aurora kinases is determined by their specific interaction partners, we initiated interactomics analyses using both α Aurora kinases (AUR1 and AUR2). Proteomics results revealed the TPX2-Like proteins 2 and 3 (TPXL2/3) prominently associating with α Auroras, as did the conserved TPX2 to a lower degree. Like TPX2, TPXL2 and TPXL3 strongly activated AUR1 kinase but exhibited cell cycle-dependent localization differences on microtubule arrays. The separate functions of TPX2 and TPXL2/3 were also suggested by their different influences on AUR1 localization upon ectopic expressions. Furthermore, genetic analyses disclosed that TPXL3, but not TPX2 and TPXL2, acts non-redundantly to secure proper embryo development. In contrast to vertebrates, plants expanded the TPX2 family for both redundant and unique functions among its members.