While plastics like polyethylene terephthalate can already be degraded efficiently by the activity of hydrolases, other synthetic polymers like polyurethanes (PUs) and polyamides (PAs) largely resist biodegradation. In this study, we solved the first crystal structure of the metagenomic urethanase UMG-SP-1, identified highly flexible loop regions to comprise active site residues, and targeted a total of 20 potential hot spots by site-saturation mutagenesis. Engineering campaigns yielded variants with single mutations, exhibiting almost 3- and 8-fold improved activity against highly stable N-aryl urethane and amide bonds, respectively. Furthermore, we demonstrated the release of the corresponding monomers from a thermoplastic polyester-PU and a PA (nylon 6) by the activity of a single, metagenome-derived urethanase after short incubation times. Thereby, we expanded the hydrolysis profile of UMG-SP-1 beyond the reported low-molecular weight carbamates. Together, these findings promise advanced strategies for the bio-based degradation and recycling of plastic materials and waste, aiding efforts to establish a circular economy for synthetic polymers.

Hydrolases are well-known for hydrolyzing esters, amides, carbamates, peptides, or acid anhydrides in the presence of water. However, some of them are also capable of catalyzing the reverse reaction (condensation) under certain conditions in aqueous systems. Hence, these enzymes are called promiscuous hydrolases/acyltransferases. This review deals with their discovery, background information on their mechanism of action, and significant improvements by enzyme engineering to both enhance product formation and decrease the undesired hydrolysis of the targeted acyl products. Their applications in biocatalysis are exemplified by the synthesis of a wide range of esters or amides in aqueous systems, including preparative-scale processes and the combination of hydrolases/acyltransferases with other enzymes in cascade reactions to utilize alternative feedstocks from renewable resources, for example. Complementary, the use of ATP-dependent amide synthesizing enzymes is covered. Together, promiscuous hydrolases/acyltransferases represent practically useful alternatives to well-established chemical reactions, operating in aqueous solutions that also appeal to different industries.

Abstract In the last decades, biocatalysis has offered new perspectives for the synthesis of (chiral) amines, which are essential building blocks for pharmaceuticals, fine and bulk chemicals. In this regard, amidases have been employed due to their broad substrate scope and their independence from expensive cofactors. To expand the repertoire of amidases, tools for their rapid identification and characterization are greatly demanded. In this work an ultra-high throughput growth selection assay based on the production of the folate precursor p -aminobenzoic acid (PABA) is introduced to identify amidase activity. PABA-derived amides structurally mimic the broad class of commonly used chromogenic substrates derived from p -nitroaniline. This suggests that the assay should be broadly applicable for the identification of amidases. Unlike conventional growth selection assays that rely on substrates as nitrogen or carbon source, our approach requires PABA in sub-nanomolar concentrations, making it exceptionally sensitive and ideal for engineering campaigns that aim at enhancing amidase activities from minimally active starting points, for example. The presented assay offers flexibility in the adjustment of sensitivity to suit project-specific needs using different expression systems and fine-tuning with the antimetabolite sulfathiazole. Application of this PABA-based assay facilitates the screening of millions of enzyme variants on a single agar plate within two days, without the need for laborious sample preparation or expensive instruments, with transformation efficiency being the only limiting factor. Key points • Ultra-high throughput assay (tens of millions on one agar plate) for amidase screening • High sensitivity by coupling selection to folate instead of carbon or nitrogen source • Highly adjustable in terms of sensitivity and expression of the engineering target

Abstract Während Kunststoffe wie Polyethylenterephthalat (PET) bereits effizient durch die Aktivität von Hydrolasen abgebaut werden können, sind andere synthetische Polymere wie Polyurethane (PUs) und Polyamide (PAs) weitgehend resistent gegenüber einem biologischen Abbau. In dieser Studie lösten wir die erste Kristallstruktur der metagenomischen Urethanase UMG‐SP‐1, identifizierten hochflexible Loopregionen, die Reste des aktiven Zentrums enthalten, und untersuchten insgesamt 20 potenzielle Hotspots mittels Sättigungsmutagenese. Die durch Protein Engineering erzeugten Einzelmutanten wiesen eine fast 3‐ bzw. 8‐fach verbesserte Aktivität gegenüber hochstabilen N ‐Arylurethan‐ und Amidbindungen auf. Darüber hinaus konnte die Freisetzung der entsprechenden Monomere aus einem thermoplastischen Polyester‐PU und einem PA (Nylon 6) durch die Aktivität einer einzigen, metagenomischen Urethanase nach kurzer Inkubationszeit nachgewiesen werden. Dadurch konnte das Hydrolyseprofil von UMG‐SP‐1 über die bekannten niedermolekularen Carbamate hinaus erweitert werden und erschließt so neue Möglichkeiten für den enzymatischen Abbau und das Recycling von Kunststoffen und Plastikabfällen. Damit unterstützt diese Studie Bemühungen um die Verbesserung einer Kreislaufwirtschaft für synthetische Polymere.

Global plastic production exceeded 400 million tons in 2022, urgently demanding improved waste management and recycling strategies for a circular plastic economy. While the enzymatic hydrolysis of polyethylene terephthalate (PET) has become feasible on industrial scales, efficient enzymes targeting other hydrolysable plastic types such as polyurethanes (PURs) are lacking. Recently, enzymes of the amidase signature (AS) family, capable of cleaving urethane bonds in a polyether‐PUR analog and a linear polyester‐PUR, have been identified. Herein, we present high‐resolution crystal structures of the AS enzyme UMG‐SP3 in three states: ligand‐free, bound with a suicidal inhibitor mimicking the transition state, and bound with a monomeric PUR degradation product. Besides revealing the conserved core and catalytic triad akin to other AS family members, the UMG‐SP3 structures show remarkable flexibility of loop regions. Particularly, Arg209 in loop 3 adopts two induced‐fit conformations upon ligand binding. Through structure‐guided kinetic studies and enzyme engineering, we mapped structural key elements that determine the enhanced hydrolysis of urethane and amide bonds in various small molecules including a linear PUR fragment analog. Our findings contribute critical insights into urethanase activity, aiding PUR degradation campaigns and sustainable plastic recycling efforts in the future.

Global plastic production exceeded 400 million tons in 2022, urgently demanding improved waste management and recycling strategies for a circular plastic economy. While the enzymatic hydrolysis of polyethylene terephthalate (PET) has become feasible on industrial scales, efficient enzymes targeting other hydrolysable plastic types such as polyurethanes (PURs) are lacking. Recently, enzymes of the amidase signature (AS) family, capable of cleaving urethane bonds in a polyether‐PUR analog and a linear polyester‐PUR, have been identified. Herein, we present high‐resolution crystal structures of the AS enzyme UMG‐SP3 in three states: ligand‐free, bound with a suicidal inhibitor mimicking the transition state, and bound with a monomeric PUR degradation product. Besides revealing the conserved core and catalytic triad akin to other AS family members, the UMG‐SP3 structures show remarkable flexibility of loop regions. Particularly, Arg209 in loop 3 adopts two induced‐fit conformations upon ligand binding. Through structure‐guided kinetic studies and enzyme engineering, we mapped structural key elements that determine the enhanced hydrolysis of urethane and amide bonds in various small molecules including a linear PUR fragment analog. Our findings contribute critical insights into urethanase activity, aiding PUR degradation campaigns and sustainable plastic recycling efforts in the future.