Abstract Correct transcription is crucial for life. However, DNA damage severely impedes elongating RNA Polymerase II (Pol II), causing transcription inhibition and transcription-replication conflicts. Cells are equipped with intricate mechanisms to counteract the severe consequence of these transcription-blocking lesions (TBLs). However, the exact mechanism and factors involved remain largely unknown. Here, using a genome-wide CRISPR/cas9 screen, we identified elongation factor ELOF1 as an important new factor in the transcription stress response upon DNA damage. We show that ELOF1 has an evolutionary conserved role in Transcription-Coupled Nucleotide Excision Repair (TC-NER), where it promotes recruitment of the TC-NER factors UVSSA and TFIIH to efficiently repair TBLs and resume transcription. Additionally, ELOF1 modulates transcription to protect cells from transcription-mediated replication stress, thereby preserving genome stability. Thus, ELOF1 protects the transcription machinery from DNA damage by two distinct mechanisms.

Abstract DNA damage severely impedes gene transcription by RNA polymerase II (Pol II), causing cellular dysfunction. Transcription-Coupled Nucleotide Excision Repair (TC-NER) specifically removes such transcription-blocking damage. TC-NER initiation relies on the CSB, CSA and UVSSA proteins; loss of any results in complete TC-NER deficiency. Strikingly, UVSSA deficiency results in UV-Sensitive Syndrome (UVSS), with mild cutaneous symptoms, while loss of CSA or CSB activity results in the severe Cockayne Syndrome (CS), characterized by neurodegeneration and premature aging. Thus far the underlying mechanism for these contrasting phenotypes remains unclear. Live-cell imaging approaches reveal that in TC-NER proficient cells, lesion-stalled Pol II is swiftly resolved, while in CSA and CSB knockout (KO) cells, elongating Pol II remains damage-bound, likely obstructing other DNA transacting processes and shielding the damage from alternative repair pathways. In contrast, in UVSSA KO cells, Pol II is cleared from the damage via VCP-mediated proteasomal degradation which is fully dependent on the CRL4CSA ubiquitin ligase activity. This Pol II degradation might provide access for alternative repair mechanisms, such as GG-NER, to remove the damage. Collectively, our data indicate that the inability to clear lesion-stalled Pol II from the chromatin, rather than TC-NER deficiency, causes the severe phenotypes observed in CS.

Abstract DNA damage forms a major obstacle for gene transcription by RNA polymerase II (Pol II). Transcription-coupled nucleotide excision repair (TC-NER) efficiently eliminates transcription-blocking lesions (TBLs), thereby safeguarding accurate transcription, preserving correct cellular function and counteracting aging. TC-NER initiation involves the recognition of lesion-stalled Pol II by CSB, which recruits the CRL4 CSA E3 ubiquitin ligase complex and UVSSA. TBL-induced ubiquitylation of Pol II at lysine 1268 of the RPB1 subunit by CRL4 CSA serves as a critical TC-NER checkpoint, governing Pol II stability and initiating TBL excision by TFIIH recruitment. However, the precise regulatory mechanisms of the CRL4 CSA E3 ligase activity and TFIIH recruitment remain elusive. Here, we reveal Inactive Serine/Threonine Kinase 19 (STK19) as a novel TC-NER factor, that is essential for correct TBL removal repair and subsequent transcription restart. Cryo-EM studies demonstrate that STK19 is an integral part of the Pol II-TC-NER complex, bridging CSA with UVSSA, RPB1 and downstream DNA. Live-cell imaging and interaction studies show that STK19 stimulates TC-NER complex stability and CRL4 CSA activity, resulting in efficient Pol II ubiquitylation and correct UVSSA and TFIIH binding. These findings underscore the crucial role of STK19 as a core component of the TC-NER machinery and its key involvement in the cellular responses to DNA damage that interfere with transcription.

Abstract Faithful transcription of eukaryotic genes by RNA polymerase II (Pol II) is essential for proper cell function. Nevertheless, the integrity of the DNA template of Pol II is continuously challenged by different sources of DNA damage, such as UV-light, that impede transcription. When unresolved, these transcription-blocking lesions (TBLs) can cause cellular dysfunction, senescence and apoptosis, eventually resulting in DNA damage-induced aging. Cells counteract these deleterious effects by Transcription-Coupled Nucleotide Excision Repair (TC-NER), which specifically removes TBLs, thereby safeguarding transcription. TC-NER initiation relies on the concerted actions of the CSB, CSA and UVSSA proteins, and loss of either of these factors results in a complete TC-NER deficiency. Although their TC-NER defect is similar, UVSSA loss results in UV-Sensitive Syndrome (UV S S), with only mild phenotypes like freckling and photosensitivity, while loss of CSA or CSB activity results in the severe Cockayne Syndrome (CS), characterized by premature aging, progressive neurodegeneration and mental retardation. Thus far the underlying mechanism for these striking differences in phenotypes remains unclear. Using live-cell imaging approaches, here we show that in TC-NER proficient cells lesion-stalled Pol II is swiftly resolved by repair of the TBL. However, in CSA and CSB knockout (KO) cells, elongating Pol II remains chromatin-bound. This lesion-stalled Pol II will obstruct other DNA transacting processes and will also shield the damage from repair by alternative pathways. In contrast, in UVSSA KO cells, Pol II is removed from the TBL by VCP-mediated proteasomal degradation, thereby, allowing alternative repair mechanisms to remove the TBL.

The coordinated transcription of genes involves the regulated release of RNA polymerase II (RNAPII) from promoter-proximal sites into active elongation. DNA lesions in transcribed strands block elongation and induce a strong transcriptional arrest. The transcription-coupled repair (TCR) pathway efficiently removes transcription-blocking DNA lesions, but this is not sufficient to resume transcription. Through proteomics screens, we find that the TCR-specific CSB protein loads the evolutionary conserved PAF1 complex (PAF1C) onto RNAPII in promoter-proximal regions in response to DNA damage. PAF1C is dispensable for TCR-mediated repair, but is essential for recovery of RNA synthesis after UV irradiation, suggesting an uncoupling between DNA repair and transcription recovery. Moreover, we find that PAF1C promotes RNAPII pause release in promoter-proximal regions and subsequently acts as a processivity factor that stimulates transcription elongation throughout genes. Our findings expose the molecular basis for a non-canonical PAF1C-dependent pathway that restores transcription throughout the human genome after genotoxic stress.