Dicer, an RNAse III endonuclease critical for processing of pre-microRNAs (miRNAs) into mature 22-nucleotide miRNAs, has proven a useful target to dissect the significance of miRNAs biogenesis in mammalian biology.To circumvent the embryonic lethality associated with germline null mutations for Dicer, we triggered conditional Dicer loss through the use of a tamoxifen-inducible Cre recombinase in the postnatal murine myocardium. Targeted Dicer deletion in 3-week-old mice provoked premature death within 1 week accompanied by mild ventricular remodeling and dramatic atrial enlargement. In the adult myocardium, loss of Dicer induced rapid and dramatic biventricular enlargement, accompanied by myocyte hypertrophy, myofiber disarray, ventricular fibrosis, and strong induction of fetal gene transcripts. Comparative miRNA profiling revealed a set of miRNAs that imply causality between miRNA depletion and spontaneous cardiac remodeling.Overall, these results indicate that modifications in miRNA biogenesis affect both juvenile and adult myocardial morphology and function.

Background: Genome-wide transcriptome analysis has greatly advanced our understanding of the regulatory networks underlying basic cardiac biology and mechanisms driving disease. However, so far, the resolution of studying gene expression patterns in the adult heart has been limited to the level of extracts from whole tissues. The use of tissue homogenates inherently causes the loss of any information on cellular origin or cell type-specific changes in gene expression. Recent developments in RNA amplification strategies provide a unique opportunity to use small amounts of input RNA for genome-wide sequencing of single cells. Methods: Here, we present a method to obtain high-quality RNA from digested cardiac tissue from adult mice for automated single-cell sequencing of both the healthy and diseased heart. Results: After optimization, we were able to perform single-cell sequencing on adult cardiac tissue under both homeostatic conditions and after ischemic injury. Clustering analysis based on differential gene expression unveiled known and novel markers of all main cardiac cell types. Based on differential gene expression, we could identify multiple subpopulations within a certain cell type. Furthermore, applying single-cell sequencing on both the healthy and injured heart indicated the presence of disease-specific cell subpopulations. As such, we identified cytoskeleton-associated protein 4 as a novel marker for activated fibroblasts that positively correlates with known myofibroblast markers in both mouse and human cardiac tissue. Cytoskeleton-associated protein 4 inhibition in activated fibroblasts treated with transforming growth factor β triggered a greater increase in the expression of genes related to activated fibroblasts compared with control, suggesting a role of cytoskeleton-associated protein 4 in modulating fibroblast activation in the injured heart. Conclusions: Single-cell sequencing on both the healthy and diseased adult heart allows us to study transcriptomic differences between cardiac cells, as well as cell type-specific changes in gene expression during cardiac disease. This new approach provides a wealth of novel insights into molecular changes that underlie the cellular processes relevant for cardiac biology and pathophysiology. Applying this technology could lead to the discovery of new therapeutic targets relevant for heart disease.

During mammalian heart development, the clustered genes encoding peptide hormones, Natriuretic Peptide A (NPPA; ANP) and B (NPPB; BNP), are transcriptionally co-regulated and co-expressed predominately in the atrial and ventricular trabecular cardiomyocytes. After birth, expression of NPPA and a natural antisense transcript NPPA-AS1 becomes restricted to the atrial cardiomyocytes. Both NPPA and NPPB are induced by cardiac stress and serve as markers for cardiovascular dysfunction or injury. NPPB gene products are extensively used as diagnostic and prognostic biomarkers for various cardiovascular disorders. Membrane-localized guanylyl cyclase receptors on many cell types throughout the body mediate the signaling of the natriuretic peptide ligands through the generation of intracellular cGMP, which interacts with and modulates the activity of cGMP-activated kinase and other enzymes and ion channels. The natriuretic peptide system plays a fundamental role in cardio-renal homeostasis, and its potent diuretic and vasodilatory effects provide compensatory mechanisms in cardiac pathophysiological conditions and heart failure. In addition, both peptides, but also CNP, have important intracardiac actions during heart development and homeostasis independent of the systemic functions. Exploration of the intracardiac functions may provide new leads for the therapeutic utility of natriuretic peptide-mediated signaling in heart diseases and rhythm disorders. Here, we review recent insights into the regulation of expression and intracardiac functions of NPPA and NPPB during heart development, homeostasis, and disease.

Abstract Funding Acknowledgements Type of funding sources: Foundation. Main funding source(s): Dutch Heart Foundation Identifying therapeutical target genes is the first step towards developing new gene therapies to promote cardiac repair after injury. In the last decades, despite the many steps forward, not a single therapy has shown to be effective and suitable for human treatment of the injured heart. Considering that cardiac diseases represent one of the most prevalent causes of morbidity, disability, and mortality in the world, it is, therefore, essential to develop new and improved therapies to induce cardiac regeneration. In this study, we aimed to identify novel therapeutical targets that could be used for future purposes of cardiac gene therapy. Unlike previous studies that investigated fetal hearts that are physiologically and functionally different from mature hearts, we focused on investigating adult human hearts that we collected from human donors with post-mortem time below 5 hours. Samples of left ventricles were molecularly and morphologically characterized for the presence of stress, cardiac damage, and cardiac fibrosis. Results of the molecular analyses were cross-referenced with the donors' medical history to classify each specimen as "control" or "diseased." Next, we performed single nuclei RNA sequencing of samples of the left ventricle from 2 "control" and 3 "diseased" hearts. Due to the adult tissue's complexity and the specimen's high-fiber content, we optimized the nuclei isolation protocol. Eventually, we successfully sequenced an average of 8.000 nuclei per sample with a gene coverage of approximately 800 genes per nucleus, identifying, via unsupervised cluster analysis, 17 different cell populations. In cardiomyocytes, we identified over 500 genes differentially expressed in diseased hearts when compared to healthy controls. Among these genes, we discovered several novel target genes whose expression is increased only in diseased cardiomyocytes. Gene ontology analysis of the known interactors of the newly identified target genes shows enrichment in terms such as sarcomere organization, muscle contraction, mitochondrial energetics, calcium handling, and fatty acid metabolism. Currently, we are investigating the molecular effects of the gain and loss of function of these genes in healthy iPS-derived cardiomyocytes and human-derived myocardial tissue slices to better understand their role in the pathophysiology of the adult human heart. From a therapeutic perspective, our ongoing research holds promises for developing new and improved intervention therapies to promote cardiac regeneration.

Intracellular calcium (Ca2+) overload is known to play a critical role in the development of cardiac dysfunction. Despite the remarkable improvement in managing the progression of heart disease, developing effective therapies for heart failure (HF) remains a challenge. A better understanding of molecular mechanisms that maintain proper Ca2+ levels and contractility in the injured heart could be of therapeutic value.