Scientific Report26 March 2014free access Source Data ULK1 translocates to mitochondria and phosphorylates FUNDC1 to regulate mitophagy Wenxian Wu Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Weili Tian Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Zhe Hu Department of Anesthesiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China Search for more papers by this author Guo Chen College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China Search for more papers by this author Lei Huang Cell Biology Core Facility, Center for Biomedical Analysis, Tsinghua University, Beijing, China Search for more papers by this author Wen Li Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Xingli Zhang Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Peng Xue Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China Search for more papers by this author Changqian Zhou College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China Search for more papers by this author Lei Liu State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China Search for more papers by this author Yushan Zhu College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China Search for more papers by this author Xingliang Zhang Department of Pediatrics, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China Search for more papers by this author Longxuan Li Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Department of Neurology, Gongli Hospital, Pudong New Area, Shanghai, China Search for more papers by this author Liangqing Zhang Department of Anesthesiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China Search for more papers by this author Senfang Sui State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing, China Search for more papers by this author Bin Zhao Corresponding Author Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Du Feng Corresponding Author Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Wenxian Wu Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Weili Tian Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Zhe Hu Department of Anesthesiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China Search for more papers by this author Guo Chen College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China Search for more papers by this author Lei Huang Cell Biology Core Facility, Center for Biomedical Analysis, Tsinghua University, Beijing, China Search for more papers by this author Wen Li Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Xingli Zhang Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Peng Xue Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China Search for more papers by this author Changqian Zhou College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China Search for more papers by this author Lei Liu State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China Search for more papers by this author Yushan Zhu College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China Search for more papers by this author Xingliang Zhang Department of Pediatrics, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China Search for more papers by this author Longxuan Li Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Department of Neurology, Gongli Hospital, Pudong New Area, Shanghai, China Search for more papers by this author Liangqing Zhang Department of Anesthesiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China Search for more papers by this author Senfang Sui State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing, China Search for more papers by this author Bin Zhao Corresponding Author Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Du Feng Corresponding Author Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China Search for more papers by this author Author Information Wenxian Wu1,‡, Weili Tian1,‡, Zhe Hu2, Guo Chen3, Lei Huang4, Wen Li1, Xingli Zhang1, Peng Xue5, Changqian Zhou3, Lei Liu6, Yushan Zhu3, Xingliang Zhang7, Longxuan Li1,8, Liangqing Zhang2, Senfang Sui9, Bin Zhao 1 and Du Feng 1 1Institute of Neurology, Guangdong Key Laboratory of Age-related Cardiac-cerebral Vascular Disease, Affiliated Hospital of Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, China 2Department of Anesthesiology, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China 3College of Life Sciences, Nankai University, Tianjin, China 4Cell Biology Core Facility, Center for Biomedical Analysis, Tsinghua University, Beijing, China 5Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China 6State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, Institute of Zoology, Chinese Academy of Sciences, Beijing, China 7Department of Pediatrics, Guangdong Medical College, Zhanjiang, China 8Department of Neurology, Gongli Hospital, Pudong New Area, Shanghai, China 9State Key Laboratory of Biomembrane and Membrane Biotechnology, School of Life Sciences, Tsinghua University, Beijing, China ‡These authors contributed equally to this work. *Corresponding author. Tel: +86 759 2386757; E-mail: [email protected] *Corresponding author. Tel: +86 759 2386757; E-mail: [email protected] EMBO Rep (2014)15:566-575https://doi.org/10.1002/embr.201438501 PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Abstract Autophagy eliminates dysfunctional mitochondria in an intricate process known as mitophagy. ULK1 is critical for the induction of autophagy, but its substrate(s) and mechanism of action in mitophagy remain unclear. Here, we show that ULK1 is upregulated and translocates to fragmented mitochondria upon mitophagy induction by either hypoxia or mitochondrial uncouplers. At mitochondria, ULK1 interacts with FUNDC1, phosphorylating it at serine 17, which enhances FUNDC1 binding to LC3. A ULK1-binding-deficient mutant of FUNDC1 prevents ULK1 translocation to mitochondria and inhibits mitophagy. Finally, kinase-active ULK1 and a phospho-mimicking mutant of FUNDC1 rescue mitophagy in ULK1-null cells. Thus, we conclude that FUNDC1 regulates ULK1 recruitment to damaged mitochondria, where FUNDC1 phosphorylation by ULK1 is crucial for mitophagy. Synopsis This study shows that ULK1 translocates to damaged mitochondria and phosphorylates FUNDC1, which is crucial for organelle elimination through mitophagy. ULK1-induced phosphorylation enhances FUNDC1 interaction with LC3. Hypoxia and mitochondrial uncouplers upregulate ULK1 and induce its translocation to damaged mitochondria ULK1 recruitment to mitochondria is regulated by its binding to FUNDC1 At mitochondria, ULK1 directly phosphorylates FUNDC1 at serine-17, which is necessary for FUNDC1-LC3 binding and colocalization Serine-17 phosphorylation is required for mitophagy in response to hypoxia and FCCP Introduction Maintenance of a healthy mitochondrial pool is essential for cellular homeostasis 1. Mitophagy is a major mechanism for mitochondrial quality control at the organelle level through two main mitophagy pathways, involving Parkin/FCCP or mitophagy receptors 234567. Failure of mitophagy or autophagy results in a number of diseases, including neurodegeneration, diabetes and cancer 8910. ULK1 and ULK2 (the yeast ATG1 homologues) are Ser/Thr kinases required for early autophagosome formation 111213. Mice deficient of either the ulk1 or the ulk2 gene displayed normal development but double knockout of both kinases in mice is lethal. The ability of ULK2 to compensate for the loss of ULK1 is further supported by evidence that ulk1-deficient cells displayed autophagy in response to glucose withdrawal, indicating that ULK1 and ULK2 are partially redundant protein kinases 141516. Recent studies suggest that ULK1 plays a more specific role in mitophagy. An ULK1-knockout mouse model shows defects in the autophagic clearance of mitochondria during erythroid maturation 17. ULK1 is associated with damaged mitochondria upon FCCP treatment 18. More recently, it has been found that phosphorylation of ULK1 by AMP-activated protein kinase (AMPK) connects cellular energy sensing to mitophagy 19. The ULK1 phosphorylation event was also reported by others, although the sites they identified are different 202122. Despite the pivotal role of ULK1 in mitochondrial clearance, the molecular mechanisms by which ULK1 regulates mitophagy, the identity of the mitochondrial substrate of ULK1, and the subcellular localization of ULK1 upon mitophagy induction remain unknown. We previously identified that FUNDC1 is a novel mitophagy receptor 6. But how FUNDC1 is modulated by upstream signals to activate receptor-mediated mitophagy also remains poorly understood 23. Here, we report that ULK1 is elevated and recruited to fragmented mitochondria in response to hypoxia or FCCP. The translocated ULK1 interacts with its substrate FUNDC1 and phosphorylates FUNDC1 at Ser-17. The ULK1-binding-deficient mutant of FUNDC1 or knockdown of FUNDC1 significantly impairs the translocation of ULK1 to fragmented mitochondria and inhibits mitophagy. The interaction between FUNDC1 and LC3 is enhanced by phosphorylation-mimetic mutant FUNDC1 (S17D) but is impaired by FUNDC1 (S17A). Hypoxia-, FCCP-, or FUNDC1-induced mitophagy is suppressed in ULK1−/− MEFs and can be restored by kinase-active form of ULK1 or FUNDC1 (S17D). Accordingly, both ULK1 and FUNDC1 are required for mitophagy and they collaboratively regulate mitophagy. Thus, our findings establish an unexpected link between ULK1 and FUNDC1 in response to different stresses. Results ULK1 is upregulated and translocates to fragmented mitochondria in response to mitophagy induced by hypoxia or FCCP Hypoxia or the mitochondrial uncoupler FCCP induces extensive mitophagy 6242526. We examined the expression of ULK1 under both conditions. The protein level of ULK1 is substantially elevated in response to hypoxia or FCCP treatment and has no significant changes upon short-term exposure to starvation but decreases after prolonged starvation (Fig 1A–D, and Supplementary Fig S1). Immunofluorescence results show that hypoxia or FCCP not only extensively induces mitochondrial fragmentation but also significantly enhances the number and size of ULK1-positive puncta (Fig 1E). A large number of ULK1-positive puncta translocate to fragmented mitochondria in both conditions compared with untreated control or with starvation condition (Fig 1E and Supplementary Fig S1). Subcellular fractionation assays further demonstrated that a proportion of ULK1 molecules are indeed co-fractionated with mitochondria in response to either hypoxia or FCCP (Fig 1F and G). Figure 1. ULK1 is upregulated and translocates to fragmented mitochondria in response to mitophagy induced by hypoxia or FCCP Levels of ULK1 in MEFs exposed to hypoxia (1% O2) for the indicated times. Quantification of the ratio of ULK1 to actin in (A). Levels of ULK1 in MEFs treated with FCCP (20 μM) for the indicated times. Quantification of the ratio of ULK1 to actin in (C). MEFs were exposed to hypoxia (1% O2) for 12 h or FCCP (20 μM) for 6 h and then fixed by 4% paraformaldehyde. Cells were stained with anti-TIM23 (mouse) and anti-ULK1 (rabbit) primary antibodies, then Alexa Fluor-488-labeled donkey anti-rabbit IgG and Alexa Fluor-555-labeled donkey anti-mouse IgG secondary antibodies before analysis by immunofluorescence microscopy. Scale bar, 10 μm. Immunoblots of subcellular fractions from control MEFs or MEFs that were exposed to hypoxia (1% O2) for 12 h. PNS, post-nuclear supernatant; Cyto, cytosol; Mito, mitochondria. Immunoblots of subcellular fractions from control MEFs or MEFs that were treated with FCCP (20 μM) for 6 h. PNS, post-nuclear supernatant; Cyto, cytosol; Mito, mitochondria. Data information: All results are from three independent experiments. All quantitative data are presented as mean ± s.e.m. from 3 independent experiments; *** P < 0.001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 1 [embr201438501-SourceData-Fig1.pdf] Download figure Download PowerPoint The mitophagy receptor FUNDC1 is a novel substrate of ULK1 The enrichment of ULK1 on fragmented mitochondria upon mitophagy induction suggests that there may be crosstalk between ULK1 and mitochondria. To find the mitochondrial substrate of ULK1, we used mass spectrometry to analyze the immunoprecipitants by the FLAG antibody from cell lysates that overexpressed FLAG-ULK1 and FUNDC1-MYC and found that FUNDC1-MYC is precipitated (Supplementary Fig S2). Overexpression of FUNDC1 potentially induces mitophagy 6. Initially, we used transient transfection experiments to confirm that FUNDC1 is a binding partner of ULK1. Immunoprecipitation experiments revealed that FUNDC1-Myc interacts with FLAG-ULK1, but not with the IgG control (Fig 2A). Conversely, we also observed that FLAG-FUNDC1 coimmunoprecipitates with GFP-ULK1, but not with the GFP control (Fig 2B). We then confirmed the endogenous interaction between ULK1 and FUNDC1 upon mitophagy induction (Fig 2C). Figure 2. The mitophagy receptor FUNDC1 is a novel substrate of ULK1 and FUNDC1 (N118A) that prevents its binding to ULK1, impairs ULK1 translocation to mitochondria, and inhibits mitophagy A. HeLa cells were co-transfected with FUNDC1-Myc and FLAG-ULK1. Cells were lysed and immunoprecipitated with anti-Myc antibody 24 h after transfection. B. FLAG-FUNDC1 was co-transfected with GFP-vector or GFP-ULK1 for 24 h in HeLa cells, and then, cell lysates were immunoprecipitated with anti-GFP antibody. C. MEFs were exposed to hypoxia (1% O2) for 12 h or FCCP (20 μM) for 3 h, followed by immunoprecipitation using anti-ULK1 antibody. D. The expression of FUNDC1 is induced by 10 ng/ml tetracycline (Tet) in FUNDC1-inducible HeLa cells. Cells were transfected with HA-ULK1 or HA-ULK1 (K46N) for 24 h. Then, the cell lysates were prepared for immunoblotting using indicated antibodies. E. ULK1+/+ cells were transfected with FUNDC1-Myc, and ULK1 cells were transfected with FUNDC1-Myc alone, FUNDC1-Myc and HA-ULK1, or FUNDC1-Myc and HA-ULK1 (K46N). Cells were harvested and lysed for immunoblots 24 h after transfection. F. Purified GST-FUNDC1 and GST-FUNDC1 (S17A) were subjected to an in vitro kinase assay with Myc-ULK1 immunoprecipitated by anti-Myc antibody from Myc-ULK1-transfected cells about 24 h post-transfection. Phosphorylated FUNDC1 was detected by anti-p-S17-FUNDC1 antibody. The red asterisks mark the target bands. G. Western blot analysis of the kinetics of ULK1, FUNDC1, and the phosphorylated FUNDC1 in MEFs exposed to hypoxia (1% O2) for the indicated times. H. Western blot analysis of the kinetics of ULK1, FUNDC1, and the phosphorylated FUNDC1 in MEFs treated with FCCP (20 μM) for the indicated times. I, J. The single mutant which can abolish the ULK1 and FUNDC1 interaction was identified. HeLa cells were co-transfected with Flag-ULK1 and the indicated constructs. 24 h after transfection, cells were lysed for immunoprecipitation by anti-Flag antibody. K. MEFs were transfected with FUNDC1-Myc and its mutants after the endogenous FUNDC1 was knocked down by siRNA. 36 h after transfection, cells were harvested in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1) and then lysed for immunoblotting with the indicated antibodies. L. MEFs were co-transfected with FUNDC1-Myc or its mutants and MitoDsred after the endogenous FUNDC1 was knocked down by siRNA. 24 h post-transfection, cells were treated with hypoxic (1% O2) conditions for 12 h or FCCP (20 μM) for 6 h before fixed by 4% paraformaldehyde and stained with indicated antibodies. Scale bar, 10 μm. Data information: All results are from three independent experiments. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 2 [embr201438501-SourceData-Fig2.pdf] Download figure Download PowerPoint Mass spectrometric analysis of cellular phosphoproteome revealed that FUNDC1 has a potential phosphorylation site at Ser-17 upon mitophagy induction (our unpublished observations), so we generated an anti-FUNDC1 (Ser-17)-specific antibody and verified its specificity (Supplementary Fig S3). We also generated a FUNDC1-inducible HeLa cell line using the Tetracycline-On system to see whether the phosphorylation state of FUNDC1 changes as mitophagy proceeds. Treatment with 10 ng/ml tetracycline elevated the expression of FUNDC1 and phosphorylated FUNDC1 (Fig 2D). Transfection with HA-ULK1 markedly promoted the phosphorylation of FUNDC1 at Ser-17, while transfection with the kinase-inactivated HA-ULK1 (K46N) showed much weaker phosphorylation since the mutant ULK1 (K46N) still has minor kinase activity (Fig 2E and Supplementary Fig S4) 2728. FUNDC1 (Ser-17) could not be phosphorylated in ULK1−/− MEFs, but when HA-ULK1 was reconstituted, the phosphorylation was significantly enhanced (Fig 2E). In vitro kinase assays further confirmed that Myc-ULK1 immunoprecipitated from cell lysates strongly phosphorylates GST-FUNDC1 at Ser-17 (Fig 2F). Time-course analysis of the phosphorylation of FUNDC1 at Ser-17 indicates that the level of ULK1 expression correlates with the phosphorylation of FUNDC1 upon mitophagy induction by hypoxia or FCCP (Fig 2G and H). However, starvation does not induce the phosphorylation of Ser-17 (Supplementary Fig S5). FUNDC1 (N118A) prevents its binding to ULK1, impairs ULK1 translocation to mitochondria, and inhibits mitophagy Next, we examined the role of FUNDC1 in the recruitment of ULK1 to mitochondria. Knockdown of Fundc1 markedly reduces mitochondria-associated ULK1 in response to hypoxia or FCCP but does not affect ULK1 puncta formation in starvation condition (Supplementary Figs S1 and S6). Next, we generated a series of FUNDC1 constructs to identify key elements required for the FUNDC1-ULK1 binding and for FUNDC1 mitochondrial localization. Immunoprecipitation reveals that N118 at FUNDC1 is essential for FUNDC1-ULK1 association (Fig 2I–N and Supplementary Fig S7). FUNDC1 loses its mitochondrial localization upon simultaneously deletion of the first and the second transmembrane domains (Fig 2I, Supplementary Figs S7 and S8). We found that mutation of N118 to Ala also reduced the translocation of ULK1 from cytosol to fragmented mitochondria and significantly inhibits mitophagy (Fig 2K and L). Kinase-active form of ULK1 is required for hypoxia-, FCCP-, or FUNDC1-induced mitophagy We next investigated whether ULK1 is required for mitophagy. In ULK1+/+ MEFs, hypoxia, FCCP, or FUNDC1 overexpression promotes the autophagic degradation of the overall mitochondrial proteins (Fig 3A–C and Supplementary Fig S9). In ULK1−/− MEFs, however, the degradation is blocked (Fig 3A and C). We then assessed the role of the kinase-active form of ULK1 in hypoxia- or FCCP-induced mitophagy in ULK1-null MEFs. Wild-type ULK1 efficiently induces mitochondrial turnover by autophagy, whereas the kinase-inactivated form of ULK1 (K46N) does not, which suggests that the kinase activity of ULK1 is very important for mitophagy (Fig 3D and E). Mitophagy induced by hypoxia is reversed by the lysosomal ATPase inhibitor bafilomycin A1 (BAF1), but not by the proteasome inhibitor, MG132 (Fig 3A, Supplementary Figs S9,S10,S11). Mitophagy induced by FCCP, however, is reversed either by BAF1 or by MG132 but to a lesser extent by MG132 (Fig 3C, Supplementary Figs S9,S10,S11). These indicate that autophagy and proteasome are both involved in FCCP-induced mitochondrial protein turnover (Fig 3B, Supplementary Figs S9 and S11). Figure 3. Mitophagy is restored in ULK1-null MEFs upon reconstitution of the kinase-active form of ULK1 or constitutively active FUNDC1 (S17D) ULK1+/+ and ULK1−/− cells were cultured under hypoxic (1% O2) condition for 12 h or 24 h in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cell lysates were immunoblotted. ULK1+/+ and ULK1−/− cells were treated with FCCP (20 μM) for the indicated times in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cell lysates were immunoblotted. ULK1+/+ and ULK1−/− cells were transfected with FUNDC1-Myc for 24 h and then harvested in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cell lysates were immunoblotted. ULK1−/− cells were transfected with HA-ULK1 or HA-ULK1 (K46N), then cultured under hypoxic (1% O2) conditions for 24 h in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cells lysates were immunoblotted. ULK1−/− cells were transfected with HA-ULK1 or HA-ULK1 (K46N) and then treated with FCCP (20 μM) for 24 h. Cells were harvested in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cell lysates were immunoblotted. FUNDC1-knockdown MEFs were transfected with FUNDC1-Myc or FUNDC1-Myc (S17A) for the indicated times. Cell lysates were used for immunoblotting. ULK1+/+ cells were transfected with FUNDC1-Myc, and ULK1−/− cells were transfected with FUNDC1-Myc or FUNDC1-Myc (S17D). 24 h after transfection, cells were fixed with 4% paraformaldehyde and stained with anti-Myc (mouse) and anti-LC3 (rabbit) primary antibodies for immunofluorescence microscopy. Scale bar, 10 μm. ULK1−/− cells were transfected with FUNDC1-Myc or FUNDC1-Myc (S17D) for 24 h in the absence or presence of 50 nm bafilomycin A1 (BAF1) for an additional 6 h before harvesting. Cell lysates were immunoblotted. ULK1−/− cells were transfected with FUNDC1-Myc or FUNDC1-Myc (S17D) for 24 h in the absence or presence of 50 nm bafilomycin A1 (BAF1) for an additional 6 h before harvesting. Cell lysates were detected with the citrate synthase activity kit. HeLa cells were transfected with FUNDC1-Myc, FUNDC1-Myc (S17A), or FUNDC1-Myc (S17D). 24 h after transfection, cell lysates were immunoprecipitated with anti-LC3 antibody. Data information: All results are from three independent experiments. All quantitative data are presented as mean ± s.e.m. from 3 independent experiments; *** P < 0.001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 3 [embr201438501-SourceData-Fig3.pdf] Download figure Download PowerPoint Phosphorylation of FUNDC1 at Ser-17 restores mitophagy that is defective in ULK1-deficient cells by promoting FUNDC1-LC3 binding and colocalization To elucidate the importance of the phosphorylation of FUNDC1 at Ser-17 by ULK1 in mitophagy, we compared the mitophagy-inducing ability of FUNDC1 (WT) with FUNDC1 (S17A) in Fundc1-KD MEFs. While FUNDC1 (WT) promotes effective mitophagy, FUNDC1 (S17A) cannot induce mitophagy (Fig 3F). To further evaluate the role of phosphorylated Ser-17 in mitophagy, we constructed FUNDC1 (S17D), which mimics constitutive phosphorylation of FUNDC1, and compared its ability to mediate mitophagy with wild-type FUNDC1 in ULK1-deficient cells. Overexpression of FUNDC1 (WT) induces extensive colocalization of mitochondria with endogenous LC3 puncta in ULK1+/+ cells, which is largely suppressed in ULK1-deficient cells (Fig 3G). However, FUNDC1 (S17D) significantly restores the colocalization of mitochondria with LC3 dots in ULK1-deficient cells (Fig 3G). FUNDC1 (S17D) is able to rescue mitophagy in ULK1−/− MEFs, whereas FUNDC1 (WT) is not (Fig 3H and I). Immunoprecipitation demonstrated that compared to FUNDC1-Myc (WT), endogenous LC3 binds more strongly to FUNDC1-Myc (S17D) and much more weakly to FUNDC1-Myc (S17A) (Fig 3J). Since Ser-17 and Tyr-18 are two adjacent sites and Tyr-18 phosphorylation is inhibitory for mitophagy, we co-transfected SRC kinase and ULK1 to see whether two kinases have mutually inhibitory effects. As shown in Supplementary Fig S12, SRC inhibits the association of ULK1 puncta with mitochondria and suppresses phosphorylation of FUNDC1 at Ser-17 by ULK1. ULK1 and FUNDC1 cooperatively regulate mitophagy Next, we determined the relationship between ULK1 and FUNDC1 in the regulation of mitophagy. Effective upregulation of ULK1 and autophagic degradation of mitochondrial proteins are readily observed in ULK1+/+ MEFs in exposure to hypoxia or FCCP treatment, while mitophagy is suppressed in ULK1−/− MEFs in response to both conditions (Fig 4A and B, and Supplementary Fig S13). When HA-ULK1 was reconstituted in ULK1−/− cells, mitophagy activity was recovered (Fig 4A and B, and Supplementary Fig S13). If FUNDC1 was knocked down in ULK1−/− cells, the autophagic removal of mitochondria was blocked compared to ULK1+/+ cells. However, mitophagy activity was much more strongly enhanced in ULK1- and FUNDC1-reconstituted ULK1−/− FUNDC1-KD cells than in ULK1 wild-type cells, or in ULK1−/− cells expressing HA-ULK1 alone (Fig 4A and B, and Supplementary Fig S13). Figure 4. FUNDC1 and ULK1 cooperatively regulate mitophagy A. ULK1+/+ or ULK1−/− cells were cultured under hypoxic (1% O2) or normoxic conditions in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). ULK1−/− cells were transfected with HA-ULK1, and ULK1−/− FUNDC1-KD cells were transfected with HA-ULK1 and FUNDC1-Myc, then cultured under hypoxic (1% O2) conditions for 24 h in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cells were harvested and lysed for immunoblotting assays. B. ULK1+/+ or ULK1−/− cells were treated with or without FCCP (20 μM) in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). ULK1−/− cells were transfected with HA-ULK1 and ULK1−/− FUNDC1-KD cells were transfected with HA-ULK1 and FUNDC1-Myc and then treated with FCCP (20 μM) for 24 h in the absence or presence of 50 nM bafilomycin A1 (BAF1). Cells were harvested and lysed for immunoblotting assays. C. ULK1+/+, ULK1−/− FUNDC1-KD, or ULK1−/− FUNDC1-KD cells rescued by introduction of HA-ULK1 and FUNDC1-Myc were cultured under hypoxic (1% O2) conditions for 24 h or with FCCP (20 μM) for 24 h. Samples were analyzed by electron microscopy. Scale bar, 2 μm. The yellow asterisks mark mitochondria. The red arrows indicate double-membraned autophagic structures. The yellow arrow denotes autolysosomes. D–E. The mitochondrial coverage and mitochondrial-containing AVs shown in (C) were quantified. Recon, reconstitution. F. Provisional working model of the interplay between ULK1 and FUNDC1 in mitophagy regulation. Data information: All results are from three independent experiments. All quantitative data are presented as mean ± s.e.m. from 3 independent experiments; ***P < 0.001. Source data are available online for this figure. Source Data for Figure 4 [embr201438501-SourceData-Fig4.pdf] Download figure Download PowerPoint Finally, we monitored mitophagy by electron microscopy. Normal-shaped mitochondria were abundant in control MEFs, while fewer mitochondria were observed in wild-type MEFs treated with hypoxia or FCCP (Fig 4C and E, and Supplementary Fig S14). Mitophagosomes were frequently observed in wild-type MEFs in response to hypoxia or FCCP (Fig 4C and E). In ULK1−/− FUNDC1-KD cells, however, the degradation of mitochondria was blocked and the formation of mitophagosomes was heavily suppressed under both conditions (Fig 4A and E, and Supplementary Fig S14). Mitophagy activity was restored when ULK1 and FUNDC1 expression was reconstituted in the

Cysteine (Cys) not only plays an indispensable role in maintaining the redox balance in organisms, but is also an important nutrient in the food industry. Fluorescence-based detection systems have emerged as an effective method to track the locations and concentrations of different species. To achieve efficient monitoring of Cys in both food samples and biological systems, a novel lipid droplet (LD) targeted fluorescent probe (namely NIT-Cys) was constructed for the turn-on detection of Cys, characterized by a large Stokes shift (142 nm), a short response time (<8 min), and a low Cys detection limit (39 nM). Furthermore, the NIT-Cys probe has been successfully used not only to quantify the amounts of Cys in selected food samples, but also to enable the visualization of endogenous Cys in acetaminophen (APAP)-induced drug-induced liver injury cells, zebrafish larvae and mice models. Consequently, the work presented here provides an efficient tool for monitoring Cys.

Epilepsy is one of the most commonly-seen neurological disorders, and both endoplasmic reticulum stress (ERS) and oxidative stress (OS) have been demonstrated to be associated with epileptic seizures. As one of the three endogenous thiol-containing amino acids, cysteine (Cys) is recognized not only as an important biomarker of various biological processes but also widely used as a significant additive in the food industry. However, the exact role that Cys plays in ERS has not been well answered up to now. In this paper, we reported the first flavone-based fluorescent probe (namely BFC) with nice endoplasmic reticulum (ER)-targeting ability, which was capable of monitoring Cys in a fast response (3.0 min), large stokes shift (130 nm) and low detection limit (10.4 nM). The recognition mechanism of Cys could be attributed to the addition-cyclization reaction involving a Cys residue and an acrylate group, resulting in the release of the strong excited-state intramolecular proton transfer (ESIPT) emission molecule of benzoflavonol (BF). The low cytotoxicity and good biocompatibility of the probe BFC allowed for monitoring the fluctuation of endogenous Cys levels under both ERS and OS processes, as well as in zebrafish models of epilepsy. Quantitative determination of Cys with the probe BFC was also achieved in three different food samples. Additionally, a probe-immersed test strips integrated with a smartphone device was successfully constructed for on-site colorimetric detection of Cys. Undoubtedly, our work provided a valuable tool for tracking Cys levels in both an epilepsy model and real food samples.