The relative ease, speed, and biological scope of clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated Protein9 (Cas9)-based reagents for genomic manipulations are revolutionizing virtually all areas of molecular biosciences, including functional genomics, genetics, applied biomedical research, and agricultural biotechnology. In plant systems, however, a number of hurdles currently exist that limit this technology from reaching its full potential. For example, significant plant molecular biology expertise and effort is still required to generate functional expression constructs that allow simultaneous editing, and especially transcriptional regulation, of multiple different genomic loci or multiplexing, which is a significant advantage of CRISPR/Cas9 versus other genome-editing systems. To streamline and facilitate rapid and wide-scale use of CRISPR/Cas9-based technologies for plant research, we developed and implemented a comprehensive molecular toolbox for multifaceted CRISPR/Cas9 applications in plants. This toolbox provides researchers with a protocol and reagents to quickly and efficiently assemble functional CRISPR/Cas9 transfer DNA constructs for monocots and dicots using Golden Gate and Gateway cloning methods. It comes with a full suite of capabilities, including multiplexed gene editing and transcriptional activation or repression of plant endogenous genes. We report the functionality and effectiveness of this toolbox in model plants such as tobacco (Nicotiana benthamiana), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), and rice (Oryza sativa), demonstrating its utility for basic and applied plant research.

Targeting specificity has been a barrier to applying genome editing systems in functional genomics, precise medicine and plant breeding. In plants, only limited studies have used whole-genome sequencing (WGS) to test off-target effects of Cas9. The cause of numerous discovered mutations is still controversial. Furthermore, WGS-based off-target analysis of Cpf1 (Cas12a) has not been reported in any higher organism to date.

CRISPR-Cas12a (formerly Cpf1) is an RNA-guided endonuclease with distinct features that have expanded genome editing capabilities. Cas12a-mediated genome editing is temperature sensitive in plants, but a lack of a comprehensive understanding on Cas12a temperature sensitivity in plant cells has hampered effective application of Cas12a nucleases in plant genome editing. We compared AsCas12a, FnCas12a, and LbCas12a for their editing efficiencies and non-homologous end joining (NHEJ) repair profiles at four different temperatures in rice. We found that AsCas12a is more sensitive to temperature and that it requires a temperature of over 28 °C for high activity. Each Cas12a nuclease exhibited distinct indel mutation profiles which were not affected by temperatures. For the first time, we successfully applied AsCas12a for generating rice mutants with high frequencies up to 93% among T0 lines. We next pursued editing in the dicot model plant Arabidopsis, for which Cas12a-based genome editing has not been previously demonstrated. While LbCas12a barely showed any editing activity at 22 °C, its editing activity was rescued by growing the transgenic plants at 29 °C. With an early high-temperature treatment regime, we successfully achieved germline editing at the two target genes, GL2 and TT4, in Arabidopsis transgenic lines. We then used high-temperature treatment to improve Cas12a-mediated genome editing in maize. By growing LbCas12a T0 maize lines at 28 °C, we obtained Cas12a-edited mutants at frequencies up to 100% in the T1 generation. Finally, we demonstrated DNA binding of Cas12a was not abolished at lower temperatures by using a dCas12a-SRDX-based transcriptional repression system in Arabidopsis. Our study demonstrates the use of high-temperature regimes to achieve high editing efficiencies with Cas12a systems in rice, Arabidopsis, and maize and sheds light on the mechanism of temperature sensitivity for Cas12a in plants.

Abstract Cytosine base editors (CBEs) and adenine base editors (ABEs) are powerful tools to install precise C-to-T and A-to-G base edits in living organisms. In recently years, a highly efficient ABE based on engineered TadA-8e, known as ABE8e, has been developed to confer highly efficient A-to-G editing in mammalian cells and plants. Interestingly, TadA-8e can be further evolved and engineered to confer cytosine base editing. In this study, we compare in rice and tomato cells a serial of engineered CBEs derived from TadA-8e and identify TadCBEa, TadCBEd, and TadCBEd_V106W as efficient CBEs with high editing purity, while maintaining the relatively narrow editing window of ABE8e. Excitingly, we show TadDE is a new class of dual base editor where a single deaminase domain promotes simultaneous C-to-T and A-to-G base editing in plant cells. Multiplexed base editing is demonstrated in transgenic rice plants with TadCBEa and TadDE. Furthermore, no off-target effects of TadCBEa and TadDE can be detected by whole genome and transcriptome sequencing of the transgenic lines, suggesting high editing specificity. Finally, we demonstrate two gain-of-function crop engineering applications in rice by using the efficient dual base editor, TadDE. In the first case, herbicide resistance alleles of OsALS are introduced by TadDE. In the second case, synonymous mutations are generated in OsSPL14 , making its transcript resistant to OsMIR156 -mediated degradation. Together, this study reports TadA-8e derived CBEs and a dual base editor with high editing activity, purity, and specificity. They are valuable additions to the expanding plant base editing toolbox.

Abstract Cytosine base editors (CBEs) and adenine base editors (ABEs) enable precise C-to-T and A-to-G edits. Recently, ABE8e, derived from TadA-8e, enhances A-to-G edits in mammalian cells and plants. Interestingly, TadA-8e can also be evolved to confer C-to-T editing. This study compares engineered CBEs derived from TadA-8e in rice and tomato cells, identifying TadCBEa, TadCBEd, and TadCBEd_V106W as efficient CBEs with high purity and a narrow editing window. A dual base editor, TadDE, promotes simultaneous C-to-T and A-to-G editing. Multiplexed base editing with TadCBEa and TadDE is demonstrated in transgenic rice, with no off-target effects detected by whole genome and transcriptome sequencing, indicating high specificity. Finally, two crop engineering applications using TadDE are shown: introducing herbicide resistance alleles in OsALS and creating synonymous mutations in OsSPL14 to resist OsMIR156 -mediated degradation. Together, this study presents TadA-8e derived CBEs and a dual base editor as valuable additions to the plant editing toolbox.

PAM-relaxed Cas9 nucleases, cytosine base editors and adenine base editors are promising tools for precise genome editing in plants. However, their genome-wide off-target effects are largely undetermined. Here, we conduct whole-genome sequencing (WGS) analyses of transgenic plants edited by xCas9, Cas9-NGv1, Cas9-NG, SpRY, nCas9-NG-PmCDA1, nSpRY-PmCDA1 and nSpRY-ABE8e in rice. Our results reveal different guide RNA (gRNA)-dependent off-target effects with different editors. De novo generated new gRNAs by SpRY editors lead to additional but not substantial off-target mutations. Strikingly, ABE8e results in ~500 genome-wide A-to-G off-target mutations at TA motif sites per transgenic plant. The preference of the TA motif by ABE8e is also observed at the target sites. Finally, we investigate the timeline and mechanism of somaclonal variation due to tissue culture, which chiefly contributes to the background mutations. This study provides a comprehensive understanding on the scales and mechanisms of off-target and background mutations during PAM-relaxed genome editing in plants.

Targeting specificity has been an essential issue for applying genome editing systems in functional genomics, precise medicine and plant breeding. Understanding the scope of off-target mutations in Cas9 or Cpf1-edited crops is critical for research and regulation. In plants, only limited studies had used whole-genome sequencing (WGS) to test off-target effects of Cas9. However, the cause of numerous discovered mutations is still controversial. Furthermore, WGS based off-target analysis of Cpf1 has not been reported in any higher organism to date. Here, we conducted a WGS analysis of 34 plants edited by Cas9 and 15 plants edited by Cpf1 in T0 and T1 generations along with 20 diverse control plants in rice, a major food crop with a genome size of ~380 Mb. The sequencing depth ranged from 45X to 105X with reads mapping rate above 96%. Our results clearly show that most mutations in edited plants were created by tissue culture process, which caused ~102 to 148 single nucleotide variations (SNVs) and ~32 to 83 insertions/deletions (indels) per plant. Among 12 Cas9 single guide RNAs (sgRNAs) and 3 Cpf1 CRISPR RNAs (crRNAs) assessed by WGS, only one Cas9 sgRNA resulted in off-target mutations in T0 lines at sites predicted by computer programs. Moreover, we cannot find evidence for bona fide off-target mutations due to continued expression of Cas9 or Cpf1 with guide RNAs in T1 generation. Taken together, our comprehensive and rigorous analysis of WGS big data across multiple sample types suggests both Cas9 and Cpf1 nucleases are very specific in generating targeted DNA modifications and off-targeting can be avoided by designing guide RNAs with high specificity.

系统性红斑狼疮是一种致病性自身抗体和免疫复合物形成并介导器官、组织损伤的慢性自身免疫病。狼疮累及心脏瓣膜可产生非感染性疣状赘生物，称为Libman-Sacks心内膜炎。Libman-Sacks心内膜炎的诊断及治疗方案目前尚无指南推荐。该文报道狼疮肾炎合并Libman-Sacks心内膜炎1例，为Libman-Sacks的诊治提供一定的经验及依据。.