Memory B cells (MBCs) epitomize the adaptation of the immune system to the environment. We identify two MBC subsets in peripheral blood, CD27dull and CD27bright MBCs, whose frequency changes with age. Heavy chain variable region (VH) usage, somatic mutation frequency replacement-to-silent ratio, and CDR3 property changes, reflecting consecutive selection of highly antigen-specific, low cross-reactive antibody variants, all demonstrate that CD27dull and CD27bright MBCs represent sequential MBC developmental stages, and stringent antigen-driven pressure selects CD27dull into the CD27bright MBC pool. Dynamics of human MBCs are exploited in pregnancy, when 50% of maternal MBCs are lost and CD27dull MBCs transit to the more differentiated CD27bright stage. In the postpartum period, the maternal MBC pool is replenished by the expansion of persistent CD27dull clones. Thus, the stability and flexibility of human B cell memory is ensured by CD27dull MBCs that expand and differentiate in response to change.

Around 65% of primary immunodeficiencies are antibody deficiencies. Functional tests are useful tools to study B-cell functions in vitro. However, no accepted guidelines for performing and evaluating functional tests have been issued yet. Here, we report our experience on the study of B-cell functions in infancy and throughout childhood. We show that T-independent stimulation with CpG measures proliferation and differentiation potential of memory B cells. Switched memory B cells respond better than IgM memory B cells. On the other hand, CD40L, a T-dependent stimulus, does not induce plasma cell differentiation, but causes proliferation of naïve and memory B cells. During childhood, the production of plasmablasts in response to CpG increases with age mirroring the development of memory B cells. The response to CD40L does not change with age. In patients with selective IgA deficiency (SIgAD), we observed that switched memory B cells are reduced due to the absence of IgA memory B cells. In agreement, IgA plasma cells are not generated in response to CpG. Unexpectedly, B cells from SIgAD patients show a reduced proliferative response to CD40L. Our results demonstrate that functional tests are an important tool to assess the functions of the humoral immune system.

Children with Down Syndrome (DS) suffer from immune deficiency with a severe reduction in switched memory B cells and poor response to vaccination. Chromosome 21 encodes two microRNAs (miRs), miR-125b and miR-155, that regulate B-cell responses. We investigated the expression of miR-125b and miR-155 in B cell and T cell subsets and during B-cell activation in DS. The frequency of B-cell and T-cell subsets were analyzed in tonsils of HD and DS. We studied the expression of miR-125b and miR-155 in sorted tonsillar B-cell and T-cell subsets and after in vitro activation of PBMCs. We blocked miRs using antagomiRs and determined plasmablast formation in vitro. We found that the germinal center (GC) reaction was impaired in DS as GC size and numbers of GC B cells and TFH cells were severely reduced. The expression of miR-155 and miR-125b was increased in tonsillar memory B cells. MiR-125b was also higher than expected in plasma cells. The expression of miR-155 rose excessively upon in vitro stimulation of PBMCs with CpG, whereas miR-125b was constitutively over-expressed in DS. The increase of miR-155 and its functional consequences were blocked by antagomiRs in vitro. Our data show that the expression of human chromosome 21-encoded miR-155 and miR-125b is altered in B cells of DS both in vivo and in vitro. Administration of antagomiRs changes the fate of B cells in vitro, partially correcting the defects observed in DS. HSA21-encoded miRs may play a role also in DS-associated dementia and leukemia. Our study suggests that antagomiRs may represent pharmacological tools useful for the treatment of DS.

Common variable immune deficiency (CVID) is a heterogeneous disorder characterized by recurrent infections, low levels of serum immunoglobulins, and impaired vaccine responses. Autoimmune manifestations are common, but B cell central and peripheral selection mechanisms in CVID are incompletely understood. Here, we find that receptor editing, a measure of central tolerance, is increased in transitional B cells from CVID patients and that these cells have a higher immunoglobulin κ:λ ratio in CVID patients with autoimmune manifestations than in those with infection only. Contrariwise, the selection pressure in the germinal center on CD27bright memory B cells is decreased in CVID patients with autoimmune manifestations. Finally, functionally, T cell-dependent activation showed that naive B cells in CVID patients are badly equipped for activation and induction of mismatch repair genes. We conclude that central tolerance is functional whereas peripheral selection is defective in CVID patients with autoimmune manifestations, which could underpin the development of autoimmunity.

The aim of this study is to report the safety and efficacy of CD19-targeting chimeric antigen receptor (CAR) T cells in a child with refractory juvenile dermatomyositis (JDM).

Background:

 Juvenile Idiopathic Arthritis (JIA) is the most common form of chronic arthritis in childhood. The adaptive branch of the immune system plays a crucial role in the development of JIA. We have showed that switched memory B cells are expanded in patients with oligoarticular- and polyarticular-JIA. 

Objectives:

 To characterize the antigen-experienced immunoglobulin repertoire, we performed deep sequencing of the switched repertoire in peripheral blood (PB) of oligo-/ploy-JIA patients(n=14) and age matched controls(n=4), and in matched synovial fluid (SF) of oligo-/ploy-JIA patients(n=7). 

Methods:

 We employed a cDNA-based-5′RACE approach with unique molecular identifiers. De-multiplexing, UMI extraction, and UMI-based consensus assembling were performed using the MIGEC software. Clonotype assembly were performed using MiXCR. SHM analysis was performed with SHazaM. B cell tolerance checkpoints were analyzed with a validated flow cytometry-based system (Malkiel S, Arthritis Rheumatol. 2016). 

Results:

 Immunoglobulin heavy chain variable gene segment usage frequency was similar between patients and controls, and PB and SF. Thus, we did not observe clustering of patients from controls. Analysis of averaged complementarity-determining region 3 (CDR3) repertoire characteristics revealed that CDR3 length was similar among the three groups, whereas physico-chemical characteristics of amino acid residues were significantly different in the IgG repertoire, but not in the IgA repertoire. IgG from SF showed higher charge and polarity and an increased hydrophobicity index compared to PB of controls and patients. We then analyzed the frequency of somatic hypermutation (SHM) and the selection pressure with SHazaM. We found a significant reduction in the frequency of SHM and a higher frequency of sequences with less than 10 mutations per Ig molecule in patients (in both PB and SF) than controls. The IgG repertoire in SF exhibited decreased positive selection in CDRs. To further characterize the immunoglobulin repertoire, we performed a flow cytometry-based staining to assess the frequency of autoreactive B cells in the transitional, naïve and memory B cell subsets in PB and also of memory B cells in SF. We found that central tolerance checkpoints are effective in both JIA patients and controls: the frequency of autoreactive B cells decreased from transitional, to naïve B cells in both JIA patients and controls. However, the frequency of autoreactive B cells was higher in memory B cells of JIA patients compared to controls, with the highest frequency observed in memory B cells of SF. 

Conclusion:

 Altogether, the observed changes in the IgG repertoire in PB and SF establish an altered peripheral selection process of IgG+ B cells in oligo-/ploy-JIA with a decreased load of SHM. Our data show for the first time that an altered GC response, leading to the accumulation of autoreactive B cells in the memory compartment, is a feature of oligo-/ploy-JIA. 

REFERENCES:

 NIL. 

Acknowledgements:

 NIL. 

Disclosure of Interests:

 Emiliano Marasco: None declared, Angela Aquilani: None declared, Ivan Caiello: None declared, Rebecca Nicolai: None declared, Giusyda Tarantino: None declared, Silvia Magni-Manzoni: None declared, Rita Carsetti: None declared, Fabrizio De Benedetti Novartis, SOBI.

Background:

 Methotrexate (MTX) is the most used drug for the treatment of children and adults suffering from arthritis although its intake is burdened by well-known side effects. The Methotrexate Intolerance Severity Score (MISS) was originally developed in English [1] to identify patients intolerant to MTX. 

Objectives:

 Methotrexate (MTX) is the most used drug to treat children and adults with arthritis and its use is burdened by adverse effects. The MTX intolerance severity score (MISS) was developed in English to identify patients who are intolerant to MTX. The aim of this study was to translate and validate the MISS in Italian. 

Methods:

 The Italian version of the MISS was developed following the "guidelines for process of cross-cultural adaptation of self-reported measures". The Italian version of the MISS was validated in 125 patients with juvenile idiopathic arthritis (JIA) followed at the Rheumatology Unit of Bambino Gesù Children Hospital. We assessed the construct validity and calculated the internal consistency of the Italian MISS. We performed ROC analysis to assess the overall performance of the Italian MISS. 

Results:

 Of the study cohort (83% female), 71 patients had oligoarthritis, 43 had RF-negative polyarthritis, 4 had enthesitis-related arthritis (ERA), and 3 had psoriatic arthritis. The mean age (±IQR) at diagnosis was approximately 4 years, with a "disease duration" on the MISS questionnaire of 6 years (IQR 3.3-10.5). The mean (± SD) VAS and c-JADAS scores were 0.7 and 2.4 respectively, with 65% of patients having inactive disease. The majority (98%) of patients received MTX subcutaneously and the average duration of use of the drug was approximately 5 years. We translated and adapted the MISS to the Italian language. The Italian MISS showed a very good internal consistency as shown by a Cronbach a of 0.87 (95% CI, 0.84-0.90) and a composite reliability of 0.89 (95% CI, 0.83-0.91). A threshold of 6 to define intolerant patients, showed a sensitivity of 98.3% and specificity of 81.2%. 

Conclusion:

 We developed the Italian version of the MISS and showed its validity and reliability to identify patients intolerant to MTX in clinical practice and in a research setting. 

REFERENCES:

 [1] M. Bulatović et al., "High prevalence of methotrexate intolerance in juvenile idiopathic arthritis: development and validation of a methotrexate intolerance severity score." Arthritis Rheum 63, 2007-2013 (2011). [2] D. Wild et al., "Principles of Good Practice for the Translation and Cultural Adaptation Process for Patient-Reported Outcomes (PRO) Measures: report of the ISPOR Task Force for Translation and Cultural Adaptation." Value Health 8, 94-104 (2005). 

Acknowledgements:

 NIL. 

Disclosure of Interests:

 None declared.