Article30 September 2011free access miRNA-dependent gene silencing involving Ago2-mediated cleavage of a circular antisense RNA Thomas B Hansen Thomas B Hansen Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Erik D Wiklund Erik D Wiklund Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia Search for more papers by this author Jesper B Bramsen Jesper B Bramsen Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Sune B Villadsen Sune B Villadsen Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Aaron L Statham Aaron L Statham Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia Search for more papers by this author Susan J Clark Susan J Clark Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia Search for more papers by this author Jørgen Kjems Corresponding Author Jørgen Kjems Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Thomas B Hansen Thomas B Hansen Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Erik D Wiklund Erik D Wiklund Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia Search for more papers by this author Jesper B Bramsen Jesper B Bramsen Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Sune B Villadsen Sune B Villadsen Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Aaron L Statham Aaron L Statham Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia Search for more papers by this author Susan J Clark Susan J Clark Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia Search for more papers by this author Jørgen Kjems Corresponding Author Jørgen Kjems Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark Search for more papers by this author Author Information Thomas B Hansen1, Erik D Wiklund1,2, Jesper B Bramsen1, Sune B Villadsen1, Aaron L Statham2, Susan J Clark2 and Jørgen Kjems 1 1Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus, Denmark 2Epigenetics Laboratory, Cancer Program, Garvan Institute of Medical Research, Darlinghurst, New South Wales, Australia *Corresponding author. Department of Molecular Biology, Interdisciplinary Nanoscience Center (iNANO), Aarhus University, Aarhus 8000 C, Denmark. Tel.: +45 8942 2686; Fax: +45 8619 6500; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2011)30:4414-4422https://doi.org/10.1038/emboj.2011.359 There is a Have you seen? (November 2011) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info MicroRNAs (miRNAs) are ∼22 nt non-coding RNAs that typically bind to the 3′ UTR of target mRNAs in the cytoplasm, resulting in mRNA destabilization and translational repression. Here, we report that miRNAs can also regulate gene expression by targeting non-coding antisense transcripts in human cells. Specifically, we show that miR-671 directs cleavage of a circular antisense transcript of the Cerebellar Degeneration-Related protein 1 (CDR1) locus in an Ago2-slicer-dependent manner. The resulting downregulation of circular antisense has a concomitant decrease in CDR1 mRNA levels, independently of heterochromatin formation. This study provides the first evidence for non-coding antisense transcripts as functional miRNA targets, and a novel regulatory mechanism involving a positive correlation between mRNA and antisense circular RNA levels. Introduction MicroRNAs (miRNA) are known to regulate gene expression by binding to the 3′ UTR of target mRNAs in the cytoplasm, resulting in mRNA destabilization and translational repression (Humphreys et al, 2005; Pillai et al, 2005; Petersen et al, 2006; Chendrimada et al, 2007). It is becoming evident that miRNAs are at some level involved in most, if not all, cellular pathways, and deregulated miRNA expression patterns are a hallmark of diseases such as cancer (Guil and Esteller, 2009). In some cases, miRNAs have also been demonstrated to direct Ago2-dependent cleavage of mRNAs with near perfect complementary miRNA target sites in an RNA interference (RNAi)-like manner (Hutvagner and Zamore, 2002; Yekta et al, 2004), and certain miRNAs may function by targeting sites in the 5′ UTR and ORF of mRNAs (Forman et al, 2008; Orom et al, 2008; Tay et al, 2008). In addition, functional RISC activity has been detected in the nucleus of human cells (Langlois et al, 2005; Robb et al, 2005), and a subset of miRNAs are predominantly nuclear (Hwang et al, 2007; Liao et al, 2010), suggesting that miRNAs may have a variety of biological functions distinct from canonical 3′ UTR target mRNA repression. In fission yeast and plants, small interfering RNAs (siRNAs) targeted to promoter regions induce RNAi-dependent transcriptional gene silencing (TGS) by directing local heterochromatin formation (Verdel et al, 2009). It has been shown that promoter-targeting siRNAs can induce TGS in cultured human cell lines as well (Morris et al, 2004), and recently an endogenous mammalian TGS mechanism involving miRNAs has been proposed (Gonzalez et al, 2008; Kim et al, 2008). In human cells, siRNA-directed TGS is usually accompanied by H3K27 and/or H3K9 methylation and occasionally with DNA hypermethylation (Svoboda et al, 2004; Suzuki et al, 2005; Ting et al, 2005; Weinberg et al, 2006; Hawkins et al, 2009). It is also associated with increased localization of Argonaute proteins to chromosomal DNA, consistent with a possible role for the miRNA machinery, but the underlying mechanisms are poorly understood (Janowski et al, 2006; Kim et al, 2006; Gonzalez et al, 2008). Non-coding transcription around the targeted promoter seems to be required, and the siRNA probably directs the effect via RNA–RNA interactions in the nucleus (Han et al, 2007; Schwartz et al, 2008; Napoli et al, 2009). High-throughput technologies have in recent years led to the uncovering of a plethora of gene proximal sense and antisense non-coding transcription. Natural antisense transcripts (NATs) refer to gene overlapping antisense transcription, which is detected in ∼70% of protein coding genes in mouse (Katayama et al, 2005), suggesting an important widespread role in regulation. NATs have mostly been associated with gene silencing, but recent reports of activation demonstrate that the relationship between sense and antisense levels is more complex (Katayama et al, 2005; Morris et al, 2008). Several mechanisms for NAT gene regulation have been proposed, including: (i) inhibition of translation by blocking mRNA association with ribosomes (Ebralidze et al, 2008), (ii) stabilization of mRNA by duplex formation (Faghihi et al, 2008), (iii) perturbation of splicing leading to intron inclusion (Beltran et al, 2008), (iv) epigenetic silencing by deposition of silent state chromatin marks similar to TGS (Yap et al, 2010), and (v) a collision model where antisense transcription interferes with polymerase activity on the sense strand (Crampton et al, 2006). Moreover, NAT expression has been implicated in cancer, as p15 expression is known to be epigenetically regulated by a long antisense ncRNA (Yu et al, 2008). Thus, NATs seem to be an important regulator in mammalian systems. Here, we aimed to investigate whether miRNAs can modulate gene expression by targeting NATs. A bioinformatic scan for possible miRNA targets in promoter proximal non-coding transcripts identified Cerebellar Degeneration-Related protein 1 (CDR1) as a promising candidate target locus of miR-671. We show that miR-671 predominantly localizes to the nucleus and directs Ago2-mediated cleavage of an antisense transcript of the CDR1 gene, leading to a concomitant decrease in steady-state CDR1 mRNA levels. Characterization of the CDR1 NAT revealed an unexpected non-linear alternative splicing (NAS) event, producing a circular exonic RNA that appears to stabilize the CDR1 mRNA. This study for the first time demonstrates that non-coding antisense transcripts can act as direct miRNA targets, and also suggests a novel gene regulatory mechanism involving a positive correlation between mRNA and circular antisense RNA levels. Results miR-671 negatively regulates CDR1 In order to identify miRNAs with a possible role in TGS, we scanned promoter proximal regions for highly complementary and phylogenetically conserved miRNA target sites. A putative target in the intronless gene CDR1 (also known as CDR34; Dropcho et al, 1987; Furneaux et al, 1989) was identified for miR-671 (Figure 1A). The target site is highly complementary to mature miR-671, is situated in the antisense direction proximal to the CDR1 transcription start site, and is associated with a peak of conservation exactly spanning the predicted miR-671 target sequence (Figure 1A). Figure 1.miR-671 represses CDR1 expression. (A) Schematic representation of the CDR1 locus. CDR1 mRNA (chrX: 139,693,091–139,694,389, hg18) and the antisense RNA (chrX: 139,693,005–139,694,491, hg18) derived from EST accessions (for additional detail, see Supplementary Figure S3). The enlargement shows the miR-671 antisense target region along with vertebrate conservation from UCSC Genome Browser (17-way conservation). (B) CDR1 expression in HEK293-eGFP-671 cells at indicated time points from 0 to 40 days of tetracycline induction. Expression was determined by qRT–PCR on random hexamer primed total RNA using the primer set CDR1(4)FW/CDR1(4)RE (normalized to 18S, relative to uninduced levels). (C) Northern blot showing subcellular localization of miR-671 in nuclear and cytoplasmic fractions of HEK293 cells transiently transfected with pJEBB-671. miR-15b is included as a localization control for an endogenously expressed miRNA and U6 snRNA and tRNALys are nuclear- and cytoplasm-specific RNAs, respectively. (D) CDR1 expression in HEK293 cells transfected with anti-mir-671 or scrambled control determined by qPCR (as in B). Download figure Download PowerPoint To investigate whether CDR1 levels were affected by miR-671 expression, we established stable tetracycline inducible miR-671 and negative control miR-769 expression HEK293 cell lines (HEK293-eGFP-671 and HEK293-eGFP-769, respectively) using the FRT/TO system (Supplementary Figure S1). CDR1 expression levels were subsequently evaluated in time course induction of HEK293-eGFP-671 and HEK293-eGFP-769 cells. As seen in Figure 1B, CDR1 levels dropped to 65% after 3 days and stabilized at <40% throughout long-term miR-671 induction. Gene expression microarray data confirmed these results, with CDR1 mRNA levels dropping to 47 and 36% after 3 and 40 days, respectively (Supplementary Figure S2A and B), whereas negative control miR-769 induction had no or little effect on CDR1 expression (Supplementary Figure S2B and C). An miRNA gene regulatory effect mediated via a non-coding antisense transcript would presumably be a nuclear event, similar to previous reports of TGS. Northern blot analysis of transiently transfected miR-671 showed that miR-671 indeed localizes predominantly to the nucleus (Figure 1C), in agreement with a recent analysis of subcellular miRNA abundance (Liao et al, 2010). In this study, miR-671 was found to be among the most nuclear enriched miRNAs, with a nuclear to cytoplasmic ratio of 6. This suggests that the miR-671 directed downregulation of CDR1 is likely to be mediated by a nuclear mechanism. We observed that HEK293 cells express miR-671 endogenously (Supplementary Figure S1B), consistent with a publicly available high-throughput sequencing data set of HEK293 small RNAs (∼250 miR-671-5p reads per million, GSM416733; Mayr and Bartel, 2009). Thus, removing the miRNA by an anti-mir-671, we propose, should activate CDR1. As expected, CDR1 levels increased upon anti-mir-671 transfection compared with a scramble control (Figure 1D), thereby demonstrating an endogenous involvement of miR-671 in CDR1 regulation in HEK293 cells. Non-linear splicing and circularization of the antisense transcript We went on to characterize the CDR1 antisense transcript in more detail. Searching the UCSC genome browser EST database for the existence of NATs overlapping the miR-671 target region, several accessions in and around the CDR1 locus were identified (Supplementary Figure S3). Interestingly, at least 23 ESTs appear to derive from an unusual NAS mechanism (Gingeras, 2009), with the splice acceptor (SA) 1485 bp upstream of the splice donor (SD) (Figure 2A; Supplementary Figure S3A and B). These splice site sequences are conserved and resemble consensus mRNA splicing motifs (Supplementary Figure S3A), suggesting that the NAS event is mediated by the canonical spliceosomal apparatus giving rise to 5′–3′ exon–exon linkage, similar to the circular SRY transcript in mice, which is essential for male sex determination (Capel et al, 1993). Moreover, the CDR1 antisense RNA harbours at least two canonical co-linear introns with consensus splice sites (Figure 2A; Supplementary Figure S3C and D). Figure 2.Characterization of the circular CDR1 antisense RNA. (A) Schematic illustration of the circular antisense RNA including the NAS splice donor (SD) and splice acceptor (SA) sites and the position of the NAS-specific primer set. (B) qRT–PCR for total or poly(A)-enriched RNA from HEK293 using primers specific for the NAS RNA. 7SK is included as a poly(A) tail-deficient control RNA. (C) NAS-specific qRT–PCR for RNA treated with TAP (Tobacco Acid Pyrophosphatase) and EXO (Terminator 5′ Phosphate-Dependent Exonuclease) normalized to untreated RNA. GAPDH mRNA and 7SK RNA are included as controls for TAP and EXO efficiencies. (D) Total HEK293 RNA was mixed with solidifying agarose and subjected to electrophoresis. In this system, circular RNA species will be physically trapped, whereas linear RNAs remain free to migrate. A no-electrophoresis control was included to determine gel-extraction efficiency, and −fold enrichment in CDR1 AS was quantified by NAS-specific qRT–PCR relative to total INPUT RNA and normalized to GAPDH. (E) Agarose northern blot with 2 μg RNA from HEK293 cells or human brain showing distinct AS migration using a CDR1 NAS-specific probe (top panel). Unspliced and spliced AS represent splicing of canonical intron II (see A). The approximate RNA sizes were deduced based on ribosomal RNA migration. 18S (bottom panel) serves as loading control. Download figure Download PowerPoint The predicted NAS event was assessed in HEK293 cells by RT–PCR with three different NAS-specific primer sets (Supplementary Figure S3C) and subsequent sequencing of the resulting amplicons confirmed the non-linear nature of the CDR1 antisense transcript and the optional removal of intron II by canonical linear splicing (‘Unspliced’ and ‘Spliced’; Supplementary Figure S3C and D). Next, 3′ RACE analysis failed to reveal any polyadenylation of the CDR1 antisense RNA. This observation was confirmed by decreased antisense transcript levels in poly(A)-enriched RNA relative to GAPDH, indicating that a poly(A)-tail is absent in the antisense species (Figure 2B). This posed the question of whether NAS occurs in trans, forming antisense concatamers, or whether it may be a cis-acting event resulting in a circular NAT. In order to distinguish the linear or circular structure of the antisense transcript, total HEK293 RNA was subjected to treatment with Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP), which removes the 5′ cap, and subsequently with Terminator 5′-phosphate-dependent exonuclease (EXO), thereby assaying for the presence of a free 5′ end. In contrast to linear and capped control RNAs (7SK RNA and GAPDH mRNA) that were degraded, the CDR1 antisense transcript proved to be resistant to the TAP/EXO treatment (Figure 2C). Circularization was further confirmed by TRAP electrophoresis (Figure 2D); a system in which a solution containing RNA and melted agarose is allowed to solidify in the well of a preformed gel, thereby physically trapping circular species upon electrophoresis (Schindler et al, 1982). Indeed, the CDR1 antisense was strongly enriched in the TRAP fraction relative to input RNA, further confirming its circular nature (Figure 2D). Moreover, as in RT–PCR, northern blotting RNA from human brain, where CDR1 NAT is highly expressed (cf. Supplementary Figure S9), clearly revealed two distinct antisense species (Figure 2E), which reflects optional inclusion of intron II in the circular RNA. The distinct migration of AS species according to predicted size of circular RNA (1485 and 1301 nt, respectively) on agarose northern blotting (Figure 2E), similar to the circular SRY RNA (Capel et al, 1993), emphasizes the existence and prevalence of circular CDR1 NAT RNA in vivo. Strand-specific quantification of CDR1 mRNA and circular AS To directly assess the effect of miR-671 on both antisense RNA and CDR1 mRNA, we designed a strand-specific qRT–PCR approach (Figure 3A). Interestingly, the antisense levels were several orders of magnitude higher than CDR1 mRNA levels, indicating that the non-coding antisense transcript is the predominant RNA species of the CDR1 locus (Figure 3B). However, relative downregulation of the CDR1 sense and antisense transcripts upon miR-671 induction was similar (Figure 3B). This suggests that removal of the antisense transcript is directly correlated with reduced mRNA levels. Furthermore, the upregulatory and downregulatory effects on CDR1 NAT associated with miR-671 overexpression and inhibition, respectively, were verified by northern blotting (Figure 3C and D). Figure 3.Strand-specific quantification of CDR1 mRNA and the antisense RNA. (A) Schematic illustration of the CDR1 locus with primers used for strand-specific qRT–PCR of CDR1 mRNA (above) and antisense RNA (below), respectively. (B) Expression of the CDR1 mRNA (black) and NAS antisense RNA (grey) in uninduced, 3 and 40 days induced HEK293-eGFP-671 cells determined by strand-specific qRT–PCR. Left and right axes denote relative levels of CDR1 mRNA and CDR1 AS, respectively. (C, D) Northern blot showing CDR1 AS levels after 3 days miR-671 induction (C) or upon 100 nM anti-miR-671-5p treatment (D) compared with uninduced and anti-Control treatment, respectively. 18S serves as loading control. Download figure Download PowerPoint Given the speculation that miRNAs may be involved in TGS, we next investigated whether the mode of CDR1 repression was epigenetic. Surprisingly, no clear accumulation of the repressive H3K27me3 polycomb mark or depletion of active H3K9 acetylation (H3K9ac) was observed by ChIP-qPCR upon miR-671 induction (Supplementary Figure S4A–C). The CDR1 locus also remained largely unmethylated and, although CDR1 was activated overall, further depletion of DNA methylation by 5-aza-dC failed to inhibit miR-671 directed CDR1 repression (Supplementary Figure S4D and E). Consistently, CDR1 mRNA and antisense levels increased when HEK293-671 cells were treated with anti-miR-671-5p following 3 days tetracycline induction (Supplementary Figure S5A and B), suggesting that the CDR1 regulation is a transient phenomenon rather than dependent on a stable, epigenetic mechanism. As such, the primary mechanism of miR-671-directed CDR1 silencing appears to be distinct from TGS. Positive correlation between CDR1 antisense and mRNA levels To confirm the dependency of the CDR1 mRNA on the NAT, and to further support that the antisense is the direct target of miR-671, small internally segmented interfering RNAs (sisiRNA) (Bramsen et al, 2007) was employed to target strictly either the antisense transcript (sisiRNA-AS) or the sense mRNA (sisiRNA-S) (Figure 4A). Strand-specific qRT–PCR showed a significant decrease of CDR1 mRNA using either sisiRNA-AS or sisiRNA-S compared with a mock siRNA (Control) (Figure 4B). In contrast, only the antisense-specific sisiRNA (sisiRNA-AS) repressed the level of NAT (Figure 4C), and a significant increase in AS levels was in fact observed as a consequence of mRNA knockdown (Figure 4C). Concordant with the effects observed upon miR-671 expression, this further demonstrates that the CDR1 mRNA is dependent on antisense RNA levels, and that miR-671 mediated antisense removal accounts for the reduction in steady-state CDR1 mRNA levels. Figure 4.Effect of CDR1 antisense-specific knockdown and overexpression. (A) Schematic illustration showing the target sites for strand-specific sisiRNAs. (B, C) HEK293 cells were transfected with 20 nM strand-specific sisiRNAs targeting the CDR1 antisense RNA (sisiRNA-AS) or mRNA (sisiRNA-S), or a mock control siRNA (Control). After 48 h, RNA levels were evaluated by qRT–PCR using mRNA-specific (B) or NAS-specific (C) primers, respectively. (D) Schematic illustration showing antisense vector design. (E) HEK293 cells were transfected with a vector expressing an antisense transcript harbouring the miR-671 target site (AS1), a vector expressing NAS-mimicking antisense RNA (AS2), a vector expressing a non-target site part of AS (AS3), or an empty vector (EV). The ASmt vectors carry a perfect miR-769 target site instead of the putative miR-671 target. RNA was harvested after 48 h, and the CDR1 mRNA level was quantified by strand-specific qRT–PCR. (F, G) NAS-specific qRT–PCR (F) and northern blot (G) with RNA extracted from cells transfected with a CDR1 mRNA expression vector or an empty vector (EV). Upper, middle, and lower panels show CDR1 mRNA, CDR1 AS, and 18S levels, respectively (G) (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001). Download figure Download PowerPoint To strengthen the effect of depleting either the AS or mRNA species, we overexpressed CDR1 mRNA or NAT mimics. Indeed, ectopic expression of a linear transcript mimicking the NAS product encompassing the circularized antisense region (AS2; Figure 4D) increased CDR1 mRNA levels compared with a non-NAS truncated construct (AS1 and AS3) or an empty vector (EV) control (Figure 4E). This confirms that CDR1 mRNA steady-state levels are stabilized by antisense expression, and indicates that non-linear adjoining of the exonic sequences by NAS is an important functional feature of the CDR1 antisense transcript. The effect was similar when expressing AS2 with a target-site mutation (AS2mt; Figure 4E), rejecting an miR-671 sponge effect as the responsible cause. In contrast to the antisense-directed increase in CDR1 mRNA, transiently overexpressing the mRNA resulted in decreased NAT levels based on qRT–PCR and northern blotting (Figure 4F and G, respectively), also in accordance with the observed increase after mRNA depletion (Figure 4C). This suggests a sense–antisense-based feedback mechanism where the antisense RNA stimulates or stabilizes the sense mRNA with subsequent negative impact on antisense levels. Targeting specifically the predominant unspliced isoforms of the circular RNA or the NAS-derived exon–exon junction using sisiRNA against intron II (sisi-Unspliced) or against the NAS junction (sisi-NAS), respectively, resulted in potent knockdown of antisense and CDR1 mRNA comparable to sisiRNA-AS (Supplementary Figure S6A and B). This suggests that canonical splicing of intron II in CDR1 NAT is not important for its function and verifies the involvement of circular AS in mRNA regulation. Moreover, to eliminate the possibility that the miR-671-3p arm was responsible for the effect, we tested an miR-671-3p sisiRNA mimic. Here, no detectable changes in CDR1 levels were observed (Supplementary Figure S6A and B), which in agreement with anti-miR-671-5p treatment confirms a dispensatory role of the miR-671-3p arm. Ago2-mediated cleavage of the CDR1 antisense transcript The concept of circular RNAs poses the interesting question of how these species are regulated in vivo. Normal RNA turnover typically involves 5′ and 3′ exonucleolytic activity at unprotected ends (Schmid and Jensen, 2008), but this mechanism would probably be insufficient for circular RNA decay. In luciferase reporter assays, comparable levels of luminescence reduction were observed for the predicted endogenous miR-671 target site (AS target) and a mutated fully complementary miR-671 target (P target), whereas no difference in the effect was observed between a mismatched target (MM target) and the no-target vector (Figure 5A). This demonstrates that the putative antisense target site has similar potency to a perfect complementary sequence, which is indicative of an siRNA-like effect. Figure 5.Ago2-mediated cleavage of the CDR1 antisense transcript. (A) Firefly luciferase reporters (pISO) with a perfect miR-671 target (P target), the endogenous CDR1 antisense target (AS target), a mismatched target (MM target) or no target were co-transfected with a Renilla luciferase expression vector (pcDNA3-RL) and miR-671 (pJEBB-671) or miR-769 (pJEBB-769). Relative luminescence represents the Firefly/Renilla ratio for pJEBB-671 relative to pJEBB-769, normalized to the no target control. (B) Northern blot with RNA from HEK293 cells co-transfected with empty vector (EV), antisense wild-type (AS2) or antisense with an miR-769 target-site (AS2mt) and pJEBB-671 or pJEBB-769. Transient AS expression was determined with an AS-specific probe (upper panel). The NeoR probe reflects transfection efficiency of the AS expression vector (second panel), the eGFP probe shows ectopic gene expression from the transfected miRNA vector (third panel) and 18S serves as loading control (lower panel). (C) Set-up as in (A) but with transient co-transfection of Ago2-wild-type (Ago2-wt) or Ago2-slicer mutant (Ago2-D669A) expression vectors (Supplementary Figure S7A). (D) Antisense-specific qRT–PCR on RNA from HEK293 cells transiently transfected with miR-671 along with EV, Ago2 wild-type (Ago2-wt), or Ago2-slicer mutant (Ago2-D669A) expression vectors (Supplementary Figure S7B). (E) Northern blot on RNA from HEK293 cells transfected with either AS2 or AS2mt, after siRNA-mediated Xrn1 knockdown, showing AS2 full-length and 3′ cleavage fragment. (F) 5′ RACE on RNA from (E) showing 5′ ends of 3′ cleavage fragment and full-length AS2. (G) Clonal sequencing of cleavage fragments obtained from 5′ RACE (***P<0.001). Download figure Download PowerPoint Accordingly, as determined by northern blot analysis, ectopically expressed AS2 was nearly completely removed by miR-671, but not affected by miR-769 (Figure 5B). Vice versa, substituting the AS2 miR-671 target site with a sequence perfectly complementary to miR-769, led to transcript removal upon miR-769 expression. Thus, the presence of the putative miR-671 target site can account for the observed decrease in CDR1 antisense levels. Therefore, the presence of a perfect or near perfect miRNA target site is sufficient for transcript removal, further indicating that the CDR1 NAS antisense is cleaved and degraded in a miRNA-dependent manner (Figure 5B). To confirm target cleavage, we investigated whether miR-671-mediated repression of the CDR1 antisense depends on Ago2-slicer activity. Two Ago2-slicer mutants (Ago2-D669A and Ago2-D597A, otherwise functional; Liu et al, 2004), were co-expressed to trans-dominate endogenous Ago2 slicing. This completely blocked the knockdown of the perfect, as well as the antisense target luciferase reporters (Figure 5C; Supplementary Figure S7A), thus confirming slicer-mediated miR-671-dependent cleavage of the luciferase reporters. Concordantly, ectopic expression of the Ago2-slicer mutants rescued the repression of endogenous CDR1 antisense (Figure 5D; Supplementary Figure S7B), suggesting that slicer activity is not only needed in reporter knockdown but also in turnover of the endogenous AS. Hence, we conclude that miR-671 directs Ago2-slicer-dependent cleavage and removal of the CDR1 NAS antisense transcript, which leads to a subsequent destabilization of the CDR1 mRNA. Finally, 5′ RACE analysis was employed to pinpoint the actual cleavage position in the CDR1 antisense transcript. Initial attempts to detect endogenous cleavage products were unsuccessful, probably due to the unstable nature of cleaved, unprotected RNA. To overcome this problem, the 5′ exoribonuclease XRN1 was transiently knocked down in order to stabilize the cleavage fragments (Supplementary Figure S8). Wild-type and mutant linear NAS antisense mimics (AS2 and AS2mt) were subsequently transiently co-expressed

This study investigates the challenge of comprehensively cataloging the complete human proteome from a single-cell type using mass spectrometry (MS)-based shotgun proteomics. We modify a classical two-dimensional high-resolution reversed-phase peptide fractionation scheme and optimize a protocol that provides sufficient peak capacity to saturate the sequencing speed of modern MS instruments. This strategy enables the deepest proteome of a human single-cell type to date, with the HeLa proteome sequenced to a depth of ∼584,000 unique peptide sequences and ∼14,200 protein isoforms (∼12,200 protein-coding genes). This depth is comparable with next-generation RNA sequencing and enables the identification of post-translational modifications, including ∼7,000 N-acetylation sites and ∼10,000 phosphorylation sites, without the need for enrichment. We further demonstrate the general applicability and clinical potential of this proteomics strategy by comprehensively quantifying global proteome expression in several different human cancer cell lines and patient tissue samples.

Abstract MicroRNAs (miRNA) are small noncoding RNAs commonly deregulated in cancer. The miR‐200 family (miR‐200a, ‐200b, ‐200c, ‐141 and ‐429) and miR‐205 are frequently silenced in advanced cancer and have been implicated in epithelial to mesenchymal transition (EMT) and tumor invasion by targeting the transcriptional repressors of E‐cadherin, ZEB1 and ZEB2 . ZEB1 is also known to repress miR‐200c‐141 transcription in a negative feedback loop, but otherwise little is known about the transcriptional regulation of the miR‐200 family and miR‐205. Recently, miR‐200 silencing was also reported in cancer stem cells, implying that miR‐200 deregulation is a key event in multiple levels of tumor biology. However, what prevents miR‐200 expression remains largely unanswered. Here we report concerted transcriptional regulation of the miR‐200 and miR‐205 loci in bladder tumors and bladder cell lines. Using a combination of miRNA expression arrays, qPCR assays and mass spectrometry DNA methylation analyses, we show that the miR‐200 and miR‐205 loci are specifically silenced and gain promoter hypermethylation and repressive chromatin marks in muscle invasive bladder tumors and undifferentiated bladder cell lines. Moreover, we report that miR‐200c expression is significantly correlated with early stage T1 bladder tumor progression, and propose miR‐200 and miR‐205 silencing and DNA hypermethylation as possible prognostic markers in bladder cancer. In addition, we observe that the mesoderm transcription factor TWIST1 and miR‐200 expression are inversely correlated in bladder tumor samples and cell lines. TWIST1 associates directly with the miR‐200 and miR‐205 promoters, and may act as a repressor of miR‐200 and miR‐205 expression.

microRNAs (miRNA) are involved in cancer development and progression, acting as tumor suppressors or oncogenes. Here, we profiled the expression of 290 unique human miRNAs in 11 normal and 106 bladder tumor samples using spotted locked nucleic acid-based oligonucleotide microarrays. We identified several differentially expressed miRNAs between normal urothelium and cancer and between the different disease stages. miR-145 was found to be the most down-regulated in cancer compared with normal, and miR-21 was the most up-regulated in cancer. Furthermore, we identified miRNAs that significantly correlated to the presence of concomitant carcinoma in situ. We identified several miRNAs with prognostic potential for predicting disease progression (e.g., miR-129, miR-133b, and miR-518c*). We localized the expression of miR-145, miR-21, and miR-129 to urothelium by in situ hybridization. We then focused on miR-129 that exerted significant growth inhibition and induced cell death upon transfection with a miR-129 precursor in bladder carcinoma cell lines T24 and SW780 cells. Microarray analysis of T24 cells after transfection showed significant miR-129 target down-regulation (P = 0.0002) and pathway analysis indicated that targets were involved in cell death processes. By analyzing gene expression data from clinical tumor samples, we identified significant expression changes of target mRNA molecules related to the miRNA expression. Using luciferase assays, we documented a direct link between miR-129 and the two putative targets GALNT1 and SOX4. The findings reported here indicate that several miRNAs are differentially regulated in bladder cancer and may form a basis for clinical development of new biomarkers for bladder cancer.

The use of chemically synthesized short interfering RNAs (siRNAs) is currently the method of choice to manipulate gene expression in mammalian cell culture, yet improvements of siRNA design is expectably required for successful application in vivo. Several studies have aimed at improving siRNA performance through the introduction of chemical modifications but a direct comparison of these results is difficult. We have directly compared the effect of 21 types of chemical modifications on siRNA activity and toxicity in a total of 2160 siRNA duplexes. We demonstrate that siRNA activity is primarily enhanced by favouring the incorporation of the intended antisense strand during RNA-induced silencing complex (RISC) loading by modulation of siRNA thermodynamic asymmetry and engineering of siRNA 3′-overhangs. Collectively, our results provide unique insights into the tolerance for chemical modifications and provide a simple guide to successful chemical modification of siRNAs with improved activity, stability and low toxicity.

Abstract Exosomes are small secreted vesicles that can transfer their content to recipient cells. In cancer, exosome secretion has been implicated in tumor growth and metastatic spread. In this study, we explored the possibility that exosomal pathways might discard tumor-suppressor miRNA that restricts metastatic progression. Secreted miRNA characterized from isogenic bladder carcinoma cell lines with differing metastatic potential were uncoupled from binding to target transcripts or the AGO2–miRISC complex. In metastatic cells, we observed a relative increase in secretion of miRNA with tumor-suppressor functions, including miR23b, miR224, and miR921. Ectopic expression of miR23b inhibited invasion, anoikis, angiogenesis, and pulmonary metastasis. Silencing of the exocytotic RAB family members RAB27A or RAB27B halted miR23b and miR921 secretion and reduced cellular invasion. Clinically, elevated levels of RAB27B expression were linked to poor prognosis in two independent cohorts of patients with bladder cancer. Moreover, highly exocytosed miRNA from metastatic cells, such as miR23b, were reduced in lymph node metastases compared with patient-matched primary tumors and were correlated with increments in miRNA-targeted RNA. Taken together, our results suggested that exosome-mediated secretion of tumor-suppressor miRNA is selected during tumor progression as a mechanism to coordinate activation of a metastatic cascade. Cancer Res; 74(20); 5758–71. ©2014 AACR.

Circulating tumor DNA (ctDNA) has emerged as a promising tool for early cancer detection and minimal residual disease monitoring. However, the biology underlying ctDNA release and its variation across cancer types and histologies remains poorly understood. This study investigated the biology behind ctDNA shedding in colorectal cancer.