BACKGROUND: The immune systems and chronic inflammation are implicated in the pathogenesis of dilated cardiomyopathy (DCM) and heart failure. However, the significance of neutrophil extracellular traps (NETs) in heart failure remains to be elucidated. METHODS: We enrolled consecutive 62 patients with heart failure with idiopathic DCM who underwent endomyocardial biopsy. Biopsy specimens were subjected to fluorescent immunostaining to detect NETs, and clinical and outcome data were collected. Ex vivo and in vivo experiments were conducted. RESULTS: The numbers of NETs per myocardial tissue area and the proportion of NETs per neutrophil were significantly higher in patients with DCM compared with non-DCM control subjects without heart failure, and the numbers of NETs were negatively correlated with left ventricular ejection fraction. Patients with DCM with NETs (n=32) showed lower left ventricular ejection fraction and higher BNP (B-type natriuretic peptide) than those without NETs (n=30). In a multivariable Cox proportional hazard model, the presence of NETs was independently associated with an increased risk of adverse cardiac events in patients with DCM. To understand specific underlying mechanisms, extracellular flux analysis in ex vivo revealed that NETs-containing conditioned medium from wild-type neutrophils or purified NET components led to impaired mitochondrial oxygen consumption of cardiomyocytes, while these effects were abolished when PAD4 (peptidyl arginine deiminase 4) in neutrophils was genetically ablated. In a murine model of pressure overload, NETs in myocardial tissue were predominantly detected in the acute phase and persisted throughout the ongoing stress. Four weeks after transverse aortic constriction, left ventricular ejection fraction was reduced in wild-type mice, whereas PAD4-deficient mice displayed preserved left ventricular ejection fraction without inducing NET formation. CONCLUSIONS: NETs in myocardial tissue contribute to cardiac dysfunction and adverse outcomes in patients with heart failure with DCM, potentially through mitochondrial dysfunction of cardiomyocytes.

Background: Heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) is a heterogeneous syndrome and its pathophysiology is not fully understood. A monoamine, 5-hydroxytryptamine (5-HT), is involved in diverse biological functions and suggested to play a role in cardiovascular diseases. However, the clinical relevance of 5-HT in HFpEF remains unclear. Aims: This study aimed to elucidate the clinical significance and prognostic value of 5- HT in patients with HFpEF. Methods: We conducted a prospective study involving 240 consecutive hospitalized patients with HFpEF (mean age 72 years, 52% male). We measured circulating blood 5-HT levels using the enzyme-linked immunosorbent assay method. Clinical and outcome data were collected. Results: Correlation analysis revealed that 5-HT levels were negatively correlated with blood B-type natriuretic peptide concentration and tricuspid regurgitation pressure gradient. When patients were stratified into two groups based on the median 5-HT levels (90.5 ng/mL), Kaplan-Meier analysis showed that HFpEF patients with low blood 5-HT levels had lower event-free survival rates from the composite event of cardiac death and worsening heart failure over a median follow-up period of 725 days (Figure). In a multivariable Cox proportional hazard model adjusting for confounding variables, low levels of 5-HT were independently associated with increased risks of the composite of cardiac events (hazard ratio, 3.25; P < 0.01). Conclusion: Low 5-HT levels are associated with adverse outcomes in patients with HFpEF and 5-HT may serve as a useful biomarker for predicting prognosis in such patients.

Introduction: Intensive blood pressure (BP) lowering therapy is associated with lower rates of major adverse cardiac and cerebrovascular events in the general population. On the other hand, lower daytime systolic BP (SBP) is associated with higher mortality in patients with heart failure (HF). However, prognostic impact of SBP during sleep was unclear in patients with HF. Methods and Results: We measured continuous SBP during sleep non-invasively by pulse transit time in 379 patients with HF (median age 71, male 53.6%). Beat-to-beat SBP was calculated based on pulse transit time, which was defined as the travel time from the R-wave of electrocardiogram to the pulse wave at the finger detected by plethysmography. Mean values of SBP during sleep were used in the present study. The primary endpoint was hospitalization for worsening HF. The patients were divided into three groups based on the tertiles of SBP during sleep: High SBP group (median SBP 138 mmHg, n = 127), Middle SBP group (median SBP 117 mmHg, n = 127), and Low SBP group (median SBP 100 mmHg, n = 125). The Low SBP group showed the youngest age (High, Middle, and Low groups; 73, 73, 68 years, P < 0.001). Levels of B-type natriuretic peptide (207.7, 216.7, and 407.2 pg/mL, P = 0.039) and estimated glomerular filtration rate (52.6, 54.0, and 57.1 mL/min/1.73 m 2 , P = 0.041) were the highest in the Low SBP group. During the follow-up period of median 1,083 days after SBP measurement, 66 patients experienced hospitalization for worsening HF. Kaplan-Meier analysis revealed that primary endpoint occurred most frequently in the Low SBP group ( Figure ). Multivariable Cox proportional hazard analysis showed that the lowest SBP tertile was associated with the primary endpoint compared to the highest SBP tertile (hazard ratio 2.546, 95% confidence interval 1.257–5.158, P = 0.009). Conclusion: Low SBP during sleep was associated with hospitalization for HF in patients with HF.

Background: Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a life-threatening disease caused by pulmonary artery remodeling, inflammation, and altered immune responses. The proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells and the accumulation of perivascular macrophages are crucial factors for the development of pulmonary artery remodeling. However, the mechanism for the progression of pulmonary artery remodeling through the perivascular macrophages has not been fully investigated. In this study, we examined the significance of colony-stimulating factor 1 receptor (CSF1R), which regulates the differentiation and proliferation of macrophages in PAH. Methods and Results: The numbers of pulmonary arterial perivascular CSF1R-positive cells significantly increased in lungs from PAH patients, compared to controls. The CSF1R phosphorylation on whole lungs was significantly increased in monocrotaline (MCT)-induced PAH rats and SU5416/Hypoxia (SuHx)-induced PAH mice. Next, we evaluated the therapeutic potential of a CSF1R inhibitor or anti-CSF1R antibody in vivo . Blocking CSF1R with a CSF1R inhibitor or anti-CSF1R antibody significantly decreased right ventricular systolic pressure, right ventricular fibrosis, perivascular CD68-positive macrophages and Arg1-positive M2 macrophages in PAH rats and mice. CSF1R knockdown using antisense oligonucleotide in the lung significantly decreased right ventricular systolic pressure in SuHx-induced PAH mice. Next, we focused on C-C motif chemokine ligand 2 (CCL2) whose gene expression is elevated in macrophages of PAH model. The culture with a conditioned medium from lung-derived M2 macrophages accelerated the proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells, while adding a CCL2 neutralizing antibody into the conditioned medium inhibited their proliferation. Conclusion: CSF1R has a critical role in the proliferation of pulmonary arterial perivascular macrophages and the progression of PAH, and M2-derived CCL2 contributed to the proliferation of pulmonary arterial smooth muscle cells. CSF1R is a novel therapeutic target in PAH.

Introduction: It has been reported that day-to-day blood pressure (BP) variability (BPV) is associated with major adverse cardiac and cerebrovascular events (MACCE) in patients with heart failure (HF). However, the clinical significance of beat-to-beat BPV is unclear. Methods and Results: We recruited data on patients with HF who underwent nighttime pulse transit time (PTT)-based continuous beat-to-beat BP measurement (n = 379, median age 71, male sex 53.6%). Standard deviation (SD) of PTT-based BP was considered as BPV. The primary outcome was MACCE defined as coronary artery disease, stroke, or death due to HF, acute coronary syndrome or ventricular fibrillation. Median values (25th and 75th percentiles) of SD of PTT-based systolic, diastolic, and mean BP were 4.2 (3.5, 5.3), 3.3 (2.7, 4.1), and 3.4 (2.8, 4.1) mmHg, respectively. During the follow-up period of median 1,083 days after BPV evaluation, 43 patients experienced MACCE. When patients were divided into three tertiles based on the systolic, diastolic, and mean BPV, MACCE occurred more frequently in those with higher tertiles of BPV ( Figure ). In the Cox proportional hazard analysis, systolic, diastolic, and mean BPV as continuous variables were associated with MACCE (hazard ratio, 1.191, 1.228, and 1.243, respectively). Conclusion: Beat-to-beat BPV was associated with MACCE in patients with HF.

Background: We have previously demonstrated that neutrophil extracellular traps (NETs) in myocardial tissue are associated with cardiac dysfunction and adverse outcomes in patients with heart failure with reduced ejection fraction. Here, we aimed to elucidate the underlying mechanisms and to clarify whether inhibiting NETs could rescue the cardiac phenotype using ex vivo and in vivo models. Methods and Results: Given that peptidyl arginine deiminase 4 (PAD4) is essential for the formation of NETs, PAD4 knockout mice were used for this study. First, we assessed the mitochondrial function of cardiomyocytes by conducting real-time measurements of the oxygen consumption rate in ex vivo . Extracellular flux analysis revealed that NETs-containing conditioned medium from wild-type neutrophils or purified NET components led to impaired mitochondrial oxygen consumption of adult mouse cardiomyocytes, while these effects were abolished when PAD4 in neutrophils was genetically ablated (Figure 1). In a murine model of pressure overload-induced heart failure, transverse aortic constriction (TAC) operation was performed on wild-type and PAD4 knockout mice. Immunohistological analysis demonstrated that TAC induced the formation of NETs in the myocardium, with the greatest number of NETs occurring at 1 day, persisting into the failing stage at 4 weeks in wild-type mice, while PAD4-deficient hearts displayed no presence of NETs in the heart tissue (Figure 2). Four weeks after TAC, left ventricular ejection fraction was reduced in wild-type mice, whereas PAD4 knockout mice displayed preserved left ventricular ejection fraction (Figure 2). Finally, we investigated the bioenergetics of cardiomyocytes isolated from PAD4 knockout mice after TAC. Maximal mitochondrial oxygen consumption rate in cardiomyocytes isolated from TAC-operated PAD4 knockout mice was significantly higher than in those from TAC-operated wild-type mice (Figure 3). Conclusion: Our data suggest that NETs directly derived impairment of mitochondrial function in cardiomyocytes. Inhibiting NETs represents a potential therapeutic approach for heart failure, preventing mitochondrial dysfunction of cardiomyocytes.

Background: Alfa-tubulin detyrosination is one of the post-translational modifications of tubulin c-terminal tail, observed in failing cardiomyocytes. Tubulin is known to regulate mitochondrial function, however, the effects of detyrosinated α-tubulin on mitochondrial function remains unrevealed. Methods and Results: We tested the effects of α-tubulin detyrosination on mitochondrial function with tubulin tyrosine ligase knocked out (TTL KO) H9C2 and Vasohibin 1 overexpressed (VASH1 OE) H9C2 cells, which had high amounts of detyrosinated α-tubulin. Alfa-tubulin detyrosination reduced mitochondrial respiration and mitochondrial membrane potential. Moreover, we found mitophagy, evaluated with Mito-Keima fluorescence and LC3 lipidation, were suppressed in TTL KO and VASH1 OE cells. Mitochondria in detyrosinated α-tubulin increasing cells contained less ubiquitinated proteins, suggesting that α-tubulin detyrosination might inhibit Parkin-mediated mitophagy. Next, we overexpressed VASH1 in the mouse heart with AAV9 to validate the effects of detyrosinated α-tubulin on cardiac function. Cardiomyocyte-restricted overexpression of VASH1 led to heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) evidenced by prolonged isovolumic relaxation time and increased mitral E/E' ratio. Cardiac VASH1 OE mice also displayed a reduction in running distance during exercise exhaustion test. The VASH1 OE heart showed suppressed LC3 lipidation, suggesting decreased mitophagy. Conclusion: We demonstrated α-tubulin detyrosination reduces mitochondrial function through the inhibition of mitophagy, leading to HFpEF progression. Our study elucidates that α-tubulin detyrosination may act as a potential target for the novel therapy for HFpEF patients.