Advanced non-small-cell lung cancer (NSCLC) patients harboring epidermal growth factor receptor (EGFR) mutations (deletion in exon 19 or L858R) show an impressive progression-free survival of 14 months when treated with erlotinib. However, the presence of EGFR mutations can only imperfectly predict outcome. We hypothesized that progression-free survival could be influenced both by the pretreatment EGFR T790M mutation and by components of DNA repair pathways.We assessed the T790M mutation in pretreatment diagnostic specimens from 129 erlotinib-treated advanced NSCLC patients with EGFR mutations. The expression of eight genes and two proteins involved in DNA repair and four receptor tyrosine kinases was also examined.The EGFR T790M mutation was observed in 45 of 129 patients (35%). Progression-free survival was 12 months in patients with and 18 months in patients without the T790M mutation (P = 0.05). Progression-free survival was 27 months in patients with low BRCA1 mRNA levels, 18 months in those with intermediate levels, and 10 months in those with high levels (P = 0.02). In the multivariate analysis, the presence of the T790M mutation (HR, 4.35; P = 0.001), intermediate BRCA1 levels (HR, 8.19; P < 0.0001), and high BRCA1 levels (HR, 8.46; P < 0.0001) emerged as markers of shorter progression-free survival.Low BRCA1 levels neutralized the negative effect of the T790M mutation and were associated with longer progression-free survival to erlotinib. We advocate baseline assessment of the T790M mutation and BRCA1 expression to predict outcome and provide alternative individualized treatment to patients based on T790M mutations and BRCA1 expression.

Extracellular vesicles (EVs) secreted by tumors are abundant in plasma, but their potential for interrogating the molecular features of tumors through multi-omic profiling remains widely unexplored. Genomic and transcriptomic profiling of circulating EV-DNA and EV-RNA isolated from in vitro and in vivo models of metastatic prostate cancer (mPC) reveal a high contribution of tumor material to EV-loaded DNA/RNA, validating the findings in two cohorts of longitudinal plasma samples collected from patients during androgen receptor signaling inhibitor (ARSI) or taxane-based therapy. EV-DNA genomic features recapitulate matched-patient biopsies and circulating tumor DNA (ctDNA) and associate with clinical progression. We develop a novel approach to enable transcriptomic profiling of EV-RNA (RExCuE). We report how the transcriptome of circulating EVs is enriched for tumor-associated transcripts, captures certain patient and tumor features, and reflects on-therapy tumor adaptation changes. Altogether, we show that EV profiling enables longitudinal transcriptomic and genomic profiling of mPC in liquid biopsy.

Abstract Purpose Metastatic prostate cancer (mPC) is enriched for homologous recombination repair (HRR) gene alterations; these biomarkers have prognostic and predictive value. Next-generation sequencing (NGS) allows for patient stratification based on these biomarkers, but widespread clinical implementation is still limited. Moreover, not all mutations in HRR genes result in functional HRR loss in the tumor. We investigated the correlation between genomic and functional loss of HRR, using NGS and an optimized RAD51 immunofluorescence (RAD51-IF) assay in mPC clinical biopsies. Experimental design Observational study including patients with stage IV prostate cancer. Biopsies from either primary tumor or metastatic biopsies underwent NGS (targeted sequencing and/or whole-exome sequencing), and RAD51-IF. Clinical data was extracted from electronic patient records. Results 219 biopsies from 187 patients were acquired, including primary (151/219) and metastatic (68/219) tumor biopsies collected either in the metastatic hormone- sensitive (169/219) or castration-resistant (50/219) setting. NGS (181 biopsies from 157 patients) showed frequent genomic alterations in TP53 (40%), AR (15%), PTEN (14%), MYC (10%), BRCA2 (9%), ATM (8%) and BRCA1 (2%). Tissue for RAD51 IF was available for 206 samples; of those, 140/206 (68%) were evaluable for RAD51- IF. Based on a previously defined threshold of 10% RAD51-positive cells, 21% samples had RAD51-low results compatible with HRR deficiency (HRD). Sample matched RAD51-IF and genomics data were obtained for 128 biopsies (117 patients): RAD51-IF had a high sensitivity (68%) and specificity (85%) to identify cases with BRCA1/2 alterations. Additionally, the RAD51-IF assay was able to identify restoration of HRR function in selected cases with BRCA2 reversion mutations or BRCA1 expression. Conclusions RAD51-IF is feasible in routine clinical samples from mPC patients and associates strongly with clinically relevant HRR gene alterations.

Extracellular vesicles (EVs) secreted by tumors are abundant in plasma, but their potential for interrogating the molecular features of tumors through multi-omic profiling remains widely unexplored. Genomic and transcriptomic profiling of circulating EV-DNA and EV-RNA isolated from a range of in-vitro and in-vivo models of metastatic prostate cancer (mPC) revealed a high contribution of tumor material to EV-loaded DNA/RNA. Findings were validated in a cohort of longitudinal plasma samples collected from mPC patients during androgen receptor signaling inhibitor (ARSI) therapy. EV-DNA genomic features recapitulated matched-patient biopsies and associated with clinical progression. We developed a novel approach to enable the transcriptomic profiling of EV-RNA (RExCuE). We report how the transcriptomic profile in mPC EV-RNA is enriched for tumor-associated transcripts when compared to same patient blood RNA and healthy individuals EV-RNA, and reflect early on-therapy tumor adaptation changes. Altogether, we show that EV profiling enables longitudinal transcriptomic and genomic profiling of mPC in liquid biopsy.

Motivation: Open-source software for simulating diffusion MRI (dMRI) signals arising from micro-vascular perfusion is needed to inform the development of new techniques for non-invasive vascular characterization. Goal(s): To present FlowSim, a micro-vasculature perfusion dMRI signal simulator, demonstrating its utility for in vivo vascular property estimation. Approach: FlowSim estimates blood velocities in all segments of custom vascular networks. These are used to calculate spin trajectories in the presence of arbitrary diffusion-encoding gradients. Results: FlowSim synthesizes dMRI signals from realistic vascular networks reconstructed from histology. These can be used to inform the estimation of capillary blood velocity distributions in vivo, showcased herein in cancer. Impact: We present FlowSim, a simulator of diffusion MRI (dMRI) signals arising from micro-vasculature perfusion. FlowSim synthesizes dMRI signals from realistic vascular networks reconstructed from histology, and informs the estimation of new microvasculature metrics in vivo, needed, for example, in cancer.

Motivation: Analytical biophysical diffusion MRI (dMRI) models fail to capture the full complexity of diffusion processes. Goal(s): We propose a Monte Carlo (MC) simulation framework enabling the numerical implementation of biophysical models with unprecedented fidelity to histology. Approach: Our framework enables simulating diffusion within cancer environments reconstructed from histology. It provides paired examples of dMRI signals and histological properties, which can be used to build numerical microstructure parameter estimators. Results: Our approach enables more accurate estimation of key properties such as cell size compared to fitting of classical multi-compartment analytical models. Impact: We propose a Monte Carlo (MC) simulation framework enabling the implementation of biophysicalmodels with unprecedented fidelity to histology. The framework improves microstructure inference compared to standard analytical fitting, and may provide more robust biomarkers in diseases such ascancer.

The histone modification of H3 oxidized at lysine 4 (H3K4ox) is catalyzed by lysyl oxidase-like 2 (LOXL2) and is enriched in heterochromatin in triple-negative breast cancer (TNBC) cells. Although H3K4ox has been linked to the maintenance of compacted chromatin, the molecular mechanism underlying this maintenance is unknown. Here we show that H3K4ox is read by the CRL4B complex, leading to the ubiquitination of histone H2A through the E3 ligase RBX1. Finally, interactions between RUVBL1/2 and LOXL2 are involved in the incorporation of the histone variant H2A.Z, which plays an essential role in the mechanism controlling the dynamics of oxidized H3. Maintenance of H3K4ox in chromatin is essential for heterochromatin properties, and disruption of any of the members involved in this pathway blocks the oncogenic properties of TNBC cells.

Motivation: Multi-compartment liver diffusion MRI (dMRI) provides innovative markers of intra-cellular fraction (F) and cell size (CS). However, practical implementations for histologically-meaningful F and CS computation in the clinic are still sought. Goal(s): To deliver a compact approach for F and CS estimation, informing model design with histology. Approach: We compared 5 implementations of a standard two-compartment model for their ability to provide F and CS estimates that agree with reference biopsies in liver tumours. Results: The best approach consisted of fitting a single-compartment model of intra-cellular diffusion to high b-value images. This provides promising metrics that stratify the risk of progression in immunotherapy. Impact: We deliver a clinically-feasible liver diffusion MRI approach for intra-cellular fraction, cell size and density estimation. It consists of fitting a single-compartment model of restricted diffusion to high b-value images, and provides metrics that may inform on cancer immunotherapy response.

5024 Background: Metastatic prostate cancer (mPC) is enriched for HRR gene alterations; these biomarkers have prognostic and predictive value. Next-generation sequencing (NGS) allows for patient stratification, but widespread clinical implementation is still limited. Moreover, not all mutations in HRR genes result in functional HRR loss in the tumor. We investigated the correlation between genomic and functional loss of HRR, using NGS and an optimized RAD51 immunofluorescence (RAD51-IF) assay in mPC biopsies. Methods: Observational study including patients with mPC. Either primary tumor or metastatic biopsies underwent NGS (custom VHIO-300 targeted panel (Panel) and/or whole-exome sequencing (WES)), and RAD51-IF from FFPE tissue specimens. A previously defined threshold of 10% RAD51-IF positive cells was used to defined HRD based on RAD51-IF. Genomic scars (LOH, LST, NtAI, and HRD-sum) were obtained from Panel and WES data. Clinical data was extracted from electronic patient records. Results: 219 tumor tissues from 187 patients were acquired, including primary (151/219) and metastatic (68/219) cases collected either in the hormone-sensitive (HSPC) (169/219) or castration-resistant (CRPC) (50/219) setting. Genomic profiling was obtained for 181/219 samples (Panel n=139, WES n=80, both n=38). Gene alterations were common in TP53 (40%), PTEN (14%), AR (15%), MYC (10%), BRCA2 (9%), ATM (8%) and BRCA1 (2%). Tissue for RAD51-IF was available for 206 samples; of those, 140/206 (68%) were evaluable for RAD51-IF. The median RAD51-IF score was 28.5. 21% samples had RAD51-low results compatible with HRR deficiency (HRD). No RAD51-IF score differences were seen between primary/metastatic tumors (p=0.7) nor HSPC/CRPC (p=0.49). Sample matched RAD51-IF and genomics data were obtained for 128 biopsies (117 patients). BRCA1/2 alterations associated with lower RAD51-IF scores (median 3.5, IQR 9.8 – 8.5 for BRCA1/2 altered vs median 29.7, IQR 19.0 - 44.5 for BRCA1/2-WT), resulting in high sensitivity (71%) and specificity (85%) to identify cases with BRCA1/2 alterations (sensitivity 68% and specificity 87% when considering a larger set of HRR genes. RAD51-IF was able to classify as HRR proficient BRCA1/2 altered cases after secondary resistance to platinum or with retained BRCA1 expression by IF. Based on HRD-sum (HRD>=42) 27.5% and 20.1% cases were classified as HRD on WES and Panel, respectively. CRPC samples were more likely to be classified as HRD-sum “high” (OR 4.07 WES, OR 5.21 targeted panel) HRD-sum was significantly associated with BCRA1/2 (Panel, p= 0.004; WES, p=0.002), and with RAD-IF low for Panel ( p=0.021) and for WES once adjusted by castration-sensitivity status (p=0.03). Conclusions: RAD51-IF is feasible in clinical samples from mPC patients and associates strongly with clinically relevant HRR gene alterations.