IDHology Among the most exciting drug targets to emerge from cancer genome sequencing projects are two related metabolic enzymes, isocitrate dehydrogenases 1 and 2 (IDH1, IDH2). Mutations in the IDH1 and IDH2 genes are common in certain types of human cancer. Whether inhibition of mutant IDH activity might offer therapeutic benefits is unclear (see the Perspective by Kim and DeBerardinis ). F. Wang et al. (p. 622 , published online 4 April) isolated a small molecule that selectively inhibits mutant IDH2, describe the structural details of its binding to the mutant enzyme, and show that this compound suppresses the growth of patient-derived leukemia cells harboring the IDH2 mutation. Rohle et al. (p. 626 , published online 4 April) show that a small molecule inhibitor of IDH1 selectively slows the growth of patient-derived brain tumor cells with the IDH1 mutation.

A number of human cancers harbor somatic point mutations in the genes encoding isocitrate dehydrogenases 1 and 2 (IDH1 and IDH2). These mutations alter residues in the enzyme active sites and confer a gain-of-function in cancer cells, resulting in the accumulation and secretion of the oncometabolite (R)-2-hydroxyglutarate (2HG). We developed a small molecule, AGI-6780, that potently and selectively inhibits the tumor-associated mutant IDH2/R140Q. A crystal structure of AGI-6780 complexed with IDH2/R140Q revealed that the inhibitor binds in an allosteric manner at the dimer interface. The results of steady-state enzymology analysis were consistent with allostery and slow-tight binding by AGI-6780. Treatment with AGI-6780 induced differentiation of TF-1 erythroleukemia and primary human acute myelogenous leukemia cells in vitro. These data provide proof-of-concept that inhibitors targeting mutant IDH2/R140Q could have potential applications as a differentiation therapy for cancer.

Abstract N 6-Methyladenosine (m6A) is the most abundant RNA modification in mammal mRNAs and increasing evidence suggests the key roles of m6A in human tumorigenesis. However, whether m6A, especially its ‘reader’ YTHDF1, targets a gene involving in protein translation and thus affects overall protein production in cancer cells is largely unexplored. Here, using multi-omics analysis for ovarian cancer, we identified a novel mechanism involving EIF3C, a subunit of the protein translation initiation factor EIF3, as the direct target of the YTHDF1. YTHDF1 augments the translation of EIF3C in an m6A-dependent manner by binding to m6A-modified EIF3C mRNA and concomitantly promotes the overall translational output, thereby facilitating tumorigenesis and metastasis of ovarian cancer. YTHDF1 is frequently amplified in ovarian cancer and up-regulation of YTHDF1 is associated with the adverse prognosis of ovarian cancer patients. Furthermore, the protein but not the RNA abundance of EIF3C is increased in ovarian cancer and positively correlates with the protein expression of YTHDF1 in ovarian cancer patients, suggesting modification of EIF3C mRNA is more relevant to its role in cancer. Collectively, we identify the novel YTHDF1-EIF3C axis critical for ovarian cancer progression which can serve as a target to develop therapeutics for cancer treatment.

Forkhead transcription factors FOXO1 (FKHR), FOXO3a (FKHRL1), and FOXO4 (AFX) play a pivotal role in tumor suppression by inducing growth arrest and apoptosis. Loss of function of these factors due to phosphorylation and proteasomal degradation has been implicated in cell transformation and malignancy. However, the ubiquitin ligase necessary for the ubiquitination of the FOXO factors and the relevance of this regulation to tumorigenesis have not been characterized. Here we demonstrate that Skp2, an oncogenic subunit of the Skp1/Cul1/F-box protein ubiquitin complex, interacts with, ubiquitinates, and promotes the degradation of FOXO1. This effect of Skp2 requires Akt-specific phosphorylation of FOXO1 at Ser-256. Moreover, expression of Skp2 inhibits transactivation of FOXO1 and abolishes the inhibitory effect of FOXO1 on cell proliferation and survival. Furthermore, expression of the FOXO1 protein is lost in a mouse lymphoma model, where Skp2 is overexpressed. These data suggest that the Skp2-promoted proteolysis of FOXO1 plays a key role in tumorigenesis.

Peptide YY (PYY) and glucagon like peptide (GLP)-1 are cosecreted from intestinal L cells, and plasma levels of both hormones rise after a meal. Peripheral administration of PYY3–36 and GLP-17–36 inhibit food intake when administered alone. However, their combined effects on appetite are unknown. We studied the effects of peripheral coadministration of PYY3–36 with GLP-17–36 in rodents and man. Whereas high-dose PYY3–36 (100 nmol/kg) and high-dose GLP-17–36 (100 nmol/kg) inhibited feeding individually, their combination led to significantly greater feeding inhibition. Additive inhibition of feeding was also observed in the genetic obese models, ob/ob and db/db mice. At low doses of PYY3–36 (1 nmol/kg) and GLP-17–36 (10 nmol/kg), which alone had no effect on food intake, coadministration led to significant reduction in food intake. To investigate potential mechanisms, c-fos immunoreactivity was quantified in the hypothalamus and brain stem. In the hypothalamic arcuate nucleus, no changes were observed after low-dose PYY3–36 or GLP-17–36 individually, but there were significantly more fos-positive neurons after coadministration. In contrast, there was no evidence of additive fos-stimulation in the brain stem. Finally, we coadministered PYY3–36 and GLP-17–36 in man. Ten lean fasted volunteers received 120-min infusions of saline, GLP-17–36 (0.4 pmol/kg·min), PYY3–36 (0.4 pmol/kg·min), and PYY3–36 (0.4 pmol/kg·min) + GLP-17–36 (0.4 pmol/kg·min) on four separate days. Energy intake from a buffet meal after combined PYY3–36 + GLP-17–36 treatment was reduced by 27% and was significantly lower than that after either treatment alone. Thus, PYY3–36 and GLP-17–36, cosecreted after a meal, may inhibit food intake additively.

The SIR2 family of nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD)-dependent deacetylases modulates diverse biological functions in different species, including longevity, apoptosis, cell cycle exit, and cellular differentiation. SIRT1, the closest mammalian ortholog of the yeast SIR2 (silent information regulator 2) gene, represses several transcription factors, including p53, NFκB and forkhead proteins. The p300 protein serves as a rate-limiting transcriptional cointegrator of diverse transcription factors either to activate or to repress transcription through modular subdomains. Herein, SIRT1 physically interacted with and repressed p300 transactivation, requiring the NAD-dependent deacetylase activity of SIRT1. SIRT1 repression involved the CRD1 transcriptional repression domain of p300. Two residues within the CRD1 domain (Lys-1020 and Lys-1024) were required for SIRT1 repression and served as substrates for SIRT1 deacetylation. These residues also serve as acceptor lysines for modification by the ubiquitin-like SUMO protein. The SUMO-specific protease SSP3 relieved SIRT1 repression of p300. SSP3 antagonism of SIRT1 required the SUMO-deconjugating function of SSP3. Thus, p300 serves as a deacetylase substrate for SIRT1 through a conserved SUMO consensus motif. Because p300 is a limiting transcriptional cofactor, deacetylation and repression of p300 by SIRT1 may serve an important integration point during metabolism and cellular differentiation. The SIR2 family of nicotinamide adenosine dinucleotide (NAD)-dependent deacetylases modulates diverse biological functions in different species, including longevity, apoptosis, cell cycle exit, and cellular differentiation. SIRT1, the closest mammalian ortholog of the yeast SIR2 (silent information regulator 2) gene, represses several transcription factors, including p53, NFκB and forkhead proteins. The p300 protein serves as a rate-limiting transcriptional cointegrator of diverse transcription factors either to activate or to repress transcription through modular subdomains. Herein, SIRT1 physically interacted with and repressed p300 transactivation, requiring the NAD-dependent deacetylase activity of SIRT1. SIRT1 repression involved the CRD1 transcriptional repression domain of p300. Two residues within the CRD1 domain (Lys-1020 and Lys-1024) were required for SIRT1 repression and served as substrates for SIRT1 deacetylation. These residues also serve as acceptor lysines for modification by the ubiquitin-like SUMO protein. The SUMO-specific protease SSP3 relieved SIRT1 repression of p300. SSP3 antagonism of SIRT1 required the SUMO-deconjugating function of SSP3. Thus, p300 serves as a deacetylase substrate for SIRT1 through a conserved SUMO consensus motif. Because p300 is a limiting transcriptional cofactor, deacetylation and repression of p300 by SIRT1 may serve an important integration point during metabolism and cellular differentiation. p300 and its related ortholog cAMP-response element-binding protein-binding protein (CBP) are transcriptional integrators regulating numerous signaling pathways by facilitating transcriptional activity of a broad array of transcription factors (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar). p300/CBP have been implicated in numerous disease processes, including several forms of cancer, cardiac hypertrophy, and Huntington's disease (3Gayther S.A. Batley S.J. Linger L. Bannister A. Thorpe K. Chin S.F. Daigo Y. Russell P. Wilson A. Sowter H.M. Delhanty J.D. Ponder B.A. Kouzarides T. Caldas C. Nat. Genet. 2000; 24: 300-303Crossref PubMed Scopus (499) Google Scholar, 4Borrow J. Stanton Jr., V.P. Andresen J.M. Becher R. Behm F.G. Chaganti R.S. Civin C.I. Disteche C. Dube I. Frischauf A.M. Horsman D. Mitelman F. Volinia S. Watmore A.E. Housman D.E. Nat. Genet. 1996; 14: 33-41Crossref PubMed Scopus (654) Google Scholar, 5Bandyopadhyay D. Okan N.A. Bales E. Nascimento L. Cole P.A. Medrano E.E. Cancer Res. 2002; 62: 6231-6239PubMed Google Scholar, 6Muraoka M. Konishi M. Kikuchi-Yanoshita R. Tanaka K. Shitara N. Chong J.M. Iwama T. Miyaki M. oncogene. 1996; 12: 1565-1569PubMed Google Scholar, 7Deguchi K. Ayton P.M. Carapeti M. Kutok J.L. Snyder C.S. Williams I.R. Cross N.C. Glass C.K. Cleary M.L. Gilliland D.G. Cancer Cell. 2003; 3: 259-271Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (180) Google Scholar, 8Ross S. Best J.L. Zon L.I. Gill G. Mol. Cell. 2002; 10: 831-842Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (318) Google Scholar, 9Gusterson R.J. Jazrawi E. Adcock I.M. Latchman D.S. J. Biol. Chem. 2003; 278: 6838-6847Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (152) Google Scholar). The relative abundance of p300 is rate-limiting in coactivation and corepression of many transcription factors, thus p300 serves to integrate diverse signaling pathways involved in metabolism and cellular differentiation (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar, 10Yao T.-P. Oh S.P. Fuchs M. Zhou N.-D. Ch'ng L.-E. Newsome D. Bronson R.T. Li E. Livingston D.M. Eckner R. Cell. 1998; 93: 361-372Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (827) Google Scholar). Orchestration of these activities by p300 involves a scaffolding function to tether transcription factors to target promoters and enzymatic activity through a histone acetyltransferase domain (11Ogryzko V.V. Schiltz R.L. Russanova V. Howard B.H. Nakatani Y. Cell. 1996; 87: 953-959Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2409) Google Scholar, 12Bannister A.J. Kouzarides T. Nature. 1996; 384: 641-643Crossref PubMed Scopus (1535) Google Scholar). In addition to histones, several substrates including transcription factors are acetylated by p300 (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar). p300 function itself is also subject to regulation via a number of post-translational modifications including phosphorylation, methylation, sumoylation, and acetylation (13Girdwood D. Bumpass D. Vaughan O.A. Thain A. Anderson L.A. Snowden A.W. Garcia-Wilson E. Perkins N.D. Hay R.T. Mol. Cell. 2003; 11: 1043-1054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 14Yadav N. Lee J. Kim J. Shen J. Hu M.C. Aldaz C.M. Bedford M.T. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003; 100: 6464-6468Crossref PubMed Scopus (240) Google Scholar, 15Chevillard-Briet M. Trouche D. Vandel L. EMBO J. 2002; 21: 5457-5466Crossref PubMed Scopus (168) Google Scholar, 16Banerjee A. Recupero A.J. Piotrkowski A.M. Wang D.-M. Harter M.L. Oncogene. 1994; 9: 1733-1737PubMed Google Scholar, 17Yaciuk P. Moran E. Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5389-5397Crossref PubMed Scopus (94) Google Scholar, 18Thompson P.R. Wang D. Wang L. Fulco M. Pediconi N. Zhang D. An W. Ge Q. Roeder R.G. Wong J. Levrero M. Sartorelli V. Cotter R.J. Cole P.A. Nat. Struct. Mol. Biol. 2004; 11: 308-315Crossref PubMed Scopus (333) Google Scholar). The modular organization of p300 likely contributes to the assembly of multicomponent transcription coactivator complexes. p300 contains several distinct conserved motifs, including a bromo domain, a glutamine-rich region, three cysteinehistidine (CH) 1The abbreviations used are: CH, cysteine-histidine; AADPR, acetyladenosine diphosphate ribose; ADPR, adenosine diphosphate ribose; CMV, cytomegalovirus; CRD, cell cycle regulatory domain; DBD, DNA binding domain; FACS, fluorescence-activated cell sorting; GDI, guanine nucleotide dissociation inhibitor; GFP, green fluorescence protein; HDAC, histone deacetylase; HEK, human embryonic kidney; HPLC, high pressure liquid chromatography; LC, liquid chromatography; LUC, luciferase; MEF, mouse embryonic fibroblasts; MS, mass spectrometry; MS/MS, tandem mass spectrometry; RSV, Rous sarcoma virus; SIR, silent information regulator; SSP, SUMO-specific protease; TSA, trichostatin A; MSCV, murine stem cell virus; IRES, internal ribosome entry segment.-rich regions (CH1, CH2, and CH3), and a transcriptional repression domain (CRD1) (cell cycle regulatory domain 1) (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar, 19Snowden A.W. Anderson L.A. Webster G.A. Perkins N.D. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 2676-2686Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar). The bromo domain plays a role in protein-protein interactions. Association with chromatin through the bromo domain facilitates histone acetylation and activation of transcription on chromatin templates in vitro (20Dhalluin C. Carlson J. Zeng L. He C. Aggarwal A. Zhou M. Nature. 1999; 399: 491-496Crossref PubMed Scopus (1320) Google Scholar, 21Jacobson R.H. Ladurner A.G. King D.S. Tjian R. Science. 2000; 288: 1422-1425Crossref PubMed Scopus (680) Google Scholar, 22Kraus W.L. Manning E.T. Kadonaga J.T. Mol. Cell. Biol. 1999; 19: 8123-8135Crossref PubMed Scopus (201) Google Scholar). The CH domains serve as docking modules for transcription factors (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar). The glutamine-rich C terminus interacts with several coactivators, including the steroid receptor coactivators (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar). Both the N- and C-terminal regions of p300 activate transcription, and the histone acetyltransferase domain resides in the central portion of the protein (1Chan H.M. Krstic-Demonacos M. Smith L. Demonacas C. La Thangue N.B. Nat. Cell Biol. 2001; 3: 667-674Crossref PubMed Scopus (241) Google Scholar, 2Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577Crossref PubMed Google Scholar). In addition to coactivation, p300 encodes CRD1, located between amino acids 1004 and 1044, which is targeted by the cell cycle regulatory protein p21CIP/WAF1 (19Snowden A.W. Anderson L.A. Webster G.A. Perkins N.D. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 2676-2686Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar). The CRD1 domain contains within it a site for sumoylation (13Girdwood D. Bumpass D. Vaughan O.A. Thain A. Anderson L.A. Snowden A.W. Garcia-Wilson E. Perkins N.D. Hay R.T. Mol. Cell. 2003; 11: 1043-1054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar) and functions in a promoter-selective manner (19Snowden A.W. Anderson L.A. Webster G.A. Perkins N.D. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 2676-2686Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar, 23Gregory D.J. Carcia-Wilson E. Poole J.C. Snowden A.W. Roninson I.B. Perkins N.D. Cell Cycle. 2002; 1: 343-350Crossref PubMed Scopus (5) Google Scholar). Transcriptional repression is mediated through three classes of histone deacetylases (HDACs) distinguished by their structural and catalytic homology to yeast transcriptional repressors. Class I HDACs are homologous to the yeast Rpd3P and include mammalian HDAC1–3 and HDAC8, whereas class II HDACs are related to the yeast Hda1P proteins and include mammalian HDAC4–7 and HDAC9–10 (24Wang C. Fu M. Pestell R.G. Methods Mol. Biol. 2004; 241: 207-216PubMed Google Scholar, 25Thiagalingam S. Cheng K.H. Lee H.J. Mineva N. Thiagalingam A. Ponte J.F. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2003; 983: 84-100Crossref PubMed Scopus (593) Google Scholar, 26Fu M. Wang C. Wang J. Zafonte B. Lisanti M.P. Pestell R.G. Cytokine Growth Factor Rev. 2002; 13: 259-276Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar). Class III HDACs are represented by the silent information regulator 2 (SIR2) family of protein deacetylases also referred to as sirtuins. The HDACs in class I and class II are characterized by their sensitivity to the inhibitor trichostatin A (TSA). In contrast, the HDAC activity of the class III sirtuins is not inhibited by TSA, but is NAD-dependent and inhibited by nicotinamide (27Imai S. Armstrong C.M. Kaeberlein M. Guarente L. Nature. 2000; 403: 795-800Crossref PubMed Scopus (2817) Google Scholar, 28Landry J. Sutton A. Tafrov S.T. Heller R.C. Stebbins J. Pillus L. Stemglanz R. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 5807-5811Crossref PubMed Scopus (820) Google Scholar, 29Smith J.S. Brachmann C.B. Celic I. Kenna M.A. Muhammad S. Starai V.J. Avalos J.L. Escalante-Semerena J.C. Grubmeyer C. Wolberger C. Boeke J.D. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 6658-6663Crossref PubMed Scopus (624) Google Scholar, 30Sauve A.A. Schramm V.L. Curr. Med. Chem. 2004; 11: 807-826Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 31Sauve A.A. Schramm V.L. Biochemistry. 2003; 42: 9249-9256Crossref PubMed Scopus (199) Google Scholar, 32Bitterman K.J. Anderson R.M. Cohen H.Y. Latorre-Esteves M. Sinclair D.A. J. Biol. Chem. 2002; 277: 45099-45107Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (822) Google Scholar). The yeast SIR2 gene regulates transcriptional silencing at telomeres, ribosomal DNA, and the silent mating loci. SIR2 extends the replication life span in Saccharomyces cerevisiae (33Kaeberlein M. McVey M. Guarente L. Genes Dev. 1999; 13: 2570-2580Crossref PubMed Scopus (1781) Google Scholar), and in Caenorhabditis elegans increased dosage of the worm SIR2.1 gene extends the life span of mother cells after caloric restriction (34Tissenbaum H.A. Guarente L. Nature. 2001; 410: 227-230Crossref PubMed Scopus (1590) Google Scholar, 35Tissenbaum H.A. Guarente L. Dev. Cell. 2002; 2: 9-19Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (105) Google Scholar). The SIR2 gene family is highly conserved with seven mammalian homologs, SIRT1–7 (36Frye R.A. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000; 273: 793-798Crossref PubMed Scopus (1174) Google Scholar). SIRT1, the closest mammalian ortholog of the yeast SIR2 gene, functions as an NAD-dependent deacetylase of a number of nonhistone substrates including p53 (37Langley E. Pearson M. Faretta M. Bauer U.M. Frye R.A. Minucci S. Pelicci P.G. Kouzarides T. EMBO J. 2002; 21: 2383-2396Crossref PubMed Scopus (757) Google Scholar, 38Luo J. Nikolaev A.Y. Imai S. Chen D. Su F. Shiloh A. Guarente L. Gu W. Cell. 2001; 107: 137-148Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1902) Google Scholar, 39Vaziri H. Dessain S.K. Ng Eaton E. Imai S.I. Frye R.A. Pandita T.K. Guarente L. Weinberg R.A. Cell. 2001; 107: 149-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2316) Google Scholar). The enzymatic activity of SIR2 is regulated by the availability of the oxidized form of NAD+ allowing SIR2 to function in part as a redox or metabolic sensor (30Sauve A.A. Schramm V.L. Curr. Med. Chem. 2004; 11: 807-826Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar). SIRT1 represses p53-mediated transcription and deacetylates the p53 protein at lysine 382, impairing its ability to activate the apoptotic program (37Langley E. Pearson M. Faretta M. Bauer U.M. Frye R.A. Minucci S. Pelicci P.G. Kouzarides T. EMBO J. 2002; 21: 2383-2396Crossref PubMed Scopus (757) Google Scholar, 38Luo J. Nikolaev A.Y. Imai S. Chen D. Su F. Shiloh A. Guarente L. Gu W. Cell. 2001; 107: 137-148Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1902) Google Scholar, 39Vaziri H. Dessain S.K. Ng Eaton E. Imai S.I. Frye R.A. Pandita T.K. Guarente L. Weinberg R.A. Cell. 2001; 107: 149-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2316) Google Scholar). Recently, several other nonhistone substrates of SIRT1 have been identified, including RelA/p65, P/CAF, MyoD, and the FOXO (forkhead box class O) subfamily of transcription factors (FOXO4, FOXO3) (37Langley E. Pearson M. Faretta M. Bauer U.M. Frye R.A. Minucci S. Pelicci P.G. Kouzarides T. EMBO J. 2002; 21: 2383-2396Crossref PubMed Scopus (757) Google Scholar, 38Luo J. Nikolaev A.Y. Imai S. Chen D. Su F. Shiloh A. Guarente L. Gu W. Cell. 2001; 107: 137-148Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1902) Google Scholar, 39Vaziri H. Dessain S.K. Ng Eaton E. Imai S.I. Frye R.A. Pandita T.K. Guarente L. Weinberg R.A. Cell. 2001; 107: 149-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2316) Google Scholar, 40Motta M.C. Divecha N. Lemieux M. Kamel C. Chen D. Gu W. Bultsma Y. McBurney M. Guarente L. Cell. 2004; 116: 551-563Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1203) Google Scholar, 41Brunet A. Sweeney L.B. Sturgill J.F. Chua K.F. Greer P.L. Lin Y. Tran H. Ross S.E. Mostoslavsky R. Cohen H.Y. Hu L.S. Cheng H.L. Jedrychowski M.P. Gygi S.P. Sinclair D.A. Alt F.W. Greenberg M.E. Science. 2004; 303: 2011-2015Crossref PubMed Scopus (2667) Google Scholar, 42van der Horst A. Tertoolen L.G. de Vries-Smits L.M. Frye R.A. Medema R.H. Burgering B.M. J. Biol. Chem. 2004; 279: 28873-28879Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (471) Google Scholar, 43Yeung F. Hoberg J.E. Ramsey C.S. Keller M.D. Jones D.R. Frye R.A. Mayo M.W. EMBO J. 2004; 23: 2369-2380Crossref PubMed Scopus (2224) Google Scholar, 44Fulco M. Schiltz R.L. Iezzi S. King M.T. Zhao P. Kashiwaya Y. Hoffman E. Veech R.L. Sartorelli V. Mol. Cell. 2003; 12: 51-62Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (505) Google Scholar). p300 functions as a limiting coactivator of most of these SIRT1 substrates. Furthermore, SIRT1 antagonizes p300-mediated activation and acetylation of p53, RelA/p65, and FOXO3/4 (38Luo J. Nikolaev A.Y. Imai S. Chen D. Su F. Shiloh A. Guarente L. Gu W. Cell. 2001; 107: 137-148Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1902) Google Scholar, 39Vaziri H. Dessain S.K. Ng Eaton E. Imai S.I. Frye R.A. Pandita T.K. Guarente L. Weinberg R.A. Cell. 2001; 107: 149-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2316) Google Scholar, 40Motta M.C. Divecha N. Lemieux M. Kamel C. Chen D. Gu W. Bultsma Y. McBurney M. Guarente L. Cell. 2004; 116: 551-563Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1203) Google Scholar, 41Brunet A. Sweeney L.B. Sturgill J.F. Chua K.F. Greer P.L. Lin Y. Tran H. Ross S.E. Mostoslavsky R. Cohen H.Y. Hu L.S. Cheng H.L. Jedrychowski M.P. Gygi S.P. Sinclair D.A. Alt F.W. Greenberg M.E. Science. 2004; 303: 2011-2015Crossref PubMed Scopus (2667) Google Scholar, 42van der Horst A. Tertoolen L.G. de Vries-Smits L.M. Frye R.A. Medema R.H. Burgering B.M. J. Biol. Chem. 2004; 279: 28873-28879Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (471) Google Scholar, 43Yeung F. Hoberg J.E. Ramsey C.S. Keller M.D. Jones D.R. Frye R.A. Mayo M.W. EMBO J. 2004; 23: 2369-2380Crossref PubMed Scopus (2224) Google Scholar). We therefore investigated the mechanism by which SIRT1 may directly regulate p300 function. Herein, SIRT1 physically associated with and repressed p300 transcriptional activity. Mutational analysis demonstrated that SIRT1 repression of p300 required residues Lys-1020 and Lys-1024 within the CRD1 transcriptional repression domain. We show that the lysine 1020 and lysine 1024 residues are in vitro substrates for mSIR2α, a SIRT1 homolog expressed in mouse. These lysine residues required for SIRT1 repression form a consensus site required for p300 sumoylation. SIRT1 repression of p300 was attenuated by the SUMO deconjugase SSP3, suggesting that p300 residues lysine 1020 and lysine 1024 are the sites of both sumoylation and SIRT1 repression. The results reveal a novel interplay between the NAD-dependent deacetylation function of SIRT1 and sumoylation in the regulation of p300 function. Cell Culture and Treatments—The HEK 293 and HEK 293T cell lines were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with 10% fetal calf serum, 1% penicillin, and 1% streptomycin. The cells were maintained in a humidified atmosphere with 5% CO2 at 37 °C. Nicotinamide (Sigma) was dissolved freshly in water prior to use at a stock concentration of 400 mm and for cell culture was used at a final concentration of either 5 or 10 mm. Antibodies—The antibodies used for Western blotting and immunoprecipitation were as follows: mouse monoclonal anti-Gal4 (DBD) RK5C1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA; 2.5 μg of antibody/500 μgof protein for immunoprecipitation), rabbit polyclonal anti-Gal4 (DBD) (Santa Cruz Biotechnology; 1:1,500 for Western blotting), rabbit polyclonal anti-acetylated lysine antibody (Cell Signaling Technology; 1:1,000 for Western blotting), rabbit polyclonal anti-Myc (A-14) (Santa Cruz Biotechnology; 1:800 for Western blotting), mouse monoclonal anti-Myc (9E10) (Santa Cruz Biotechnology; 1:2,000 for Western blotting), mouse monoclonal anti-SIRT1, clone 2G1/F7 (Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY; 1:1500 for Western blotting). An antibody against guanine nucleotide dissociation inhibitor (GDI) (a generous gift from Dr. Perry Bickel, Washington University, St. Louis, MO) (45Lee R.J. Albanese C. Fu M. D'Amico M. Lin B. Watanabe G. Haines III, G.K. Siegel P.M. Hung M.C. Yarden Y. Horowitz J.M. Muller W.J. Pestell R.G. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 672-683Crossref PubMed Scopus (311) Google Scholar) was used as an internal control for protein abundance (1:4,000 for Western blotting). Reporter Genes and Expression Vectors—The reporter constructs used were: the PG5 luciferase reporter vector that contains five Gal4 DNA binding sites (PG5LUC, Promega, Madison, WI); pRL-CMVLUC (CMVLUC, Promega) and RSVβ-galactosidase (RSVβ-gal), which both serve as control constitutive reporters. The human wild-type and mutant (H363Y) SIRT1 expression vectors in pcDNA3 (38Luo J. Nikolaev A.Y. Imai S. Chen D. Su F. Shiloh A. Guarente L. Gu W. Cell. 2001; 107: 137-148Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1902) Google Scholar), the Myc-tagged wild-type and mutant (H363Y) SIRT1 expression constructs in pcDNA3.1 (a kind gift from Dr. T. Kouzarides) (37Langley E. Pearson M. Faretta M. Bauer U.M. Frye R.A. Minucci S. Pelicci P.G. Kouzarides T. EMBO J. 2002; 21: 2383-2396Crossref PubMed Scopus (757) Google Scholar), and pCMV6-xl4 expression vectors for SUMO-specific protease 3 (SSP3) and an inactive mutant SSP3 (C548A) (13Girdwood D. Bumpass D. Vaughan O.A. Thain A. Anderson L.A. Snowden A.W. Garcia-Wilson E. Perkins N.D. Hay R.T. Mol. Cell. 2003; 11: 1043-1054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar) have been described previously. All of the Gal4-p300 constructs are derivatives of the pVR-1012Gal4-p300 expression vector that expresses full-length p300 fused to the Gal4-DBD (13Girdwood D. Bumpass D. Vaughan O.A. Thain A. Anderson L.A. Snowden A.W. Garcia-Wilson E. Perkins N.D. Hay R.T. Mol. Cell. 2003; 11: 1043-1054Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (383) Google Scholar, 19Snowden A.W. Anderson L.A. Webster G.A. Perkins N.D. Mol. Cell. Biol. 2000; 20: 2676-2686Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar). Luciferase Assays—HEK 293 and HEK 293T cells were seeded at a density of 1.5 × 105 cells/well in Dulbecco's modified Eagle's medium in a 24-well plate on the day prior to transfection. The following day the cells were transiently transfected with the appropriate combination of the reporter, expression vectors, and control vector with Superfect reagent (Qiagen, Valencia, CA) according to the manufacturer's instructions. 24 or 48 h post-transfection luciferase assays were performed at room temperature using an Autolumat LB 953 (EG&G Berthold) as described previously (46Watanabe G. Howe A. Lee R.J. Albanese C. Shu I.W. Karnezis A.N. Zon L. Kyriakis J. Rundell K. Pestell R.G. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 12861-12866Crossref PubMed Scopus (197) Google Scholar). For nicotinamide treatments, 4 h post-transfection the medium was changed with medium containing 5 mm nicotinamide, and cells were incubated for an additional 24 h before harvesting for luciferase assay. Luciferase activity was normalized for transfection efficiency using a β-galactosidase reporter (RSVβ-gal) as an internal control. Experimental data are mean of at least two independent experiments with luciferase activity normalized for β-galactosidase activity, conducted in triplicate. In parallel, transfections were conducted with the expression vector for the Gal4 DNA binding domain alone (Gal4-DBD), and luciferase activity is shown relative to the Gal4-DBD alone set at 1. Where indicated, the -fold effect was also determined by comparison with the equivalent empty expression vector cassette. Statistical analyses were performed using Student's t test, and significant differences were established as p < 0.05. Western Blots—Western blotting was performed as described previously (47Neumeister P. Pixley F.J. Xiong Y. Xie H. Wu K. Ashton A. Cammer M. Chan A. Symons M. Stanley E.R. Pestell R.G. Mol. Biol. Cell. 2003; 14: 2005-2015Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar). Whole cell lysates were resolved by SDS-PAGE and transferred to polyvinylidene difluoride membranes. After transfer, the membrane was blocked in 3% skim milk overnight. For immunodetection of proteins the membrane was incubated with the appropriate primary antibody at room temperature for 1 h. The blotted membrane was then washed three times with 0.1% Tween 20 phosphate-buffered saline (PBST) and incubated for 1 h with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology) (1:3,000). The membranes were washed three times with PBST, and immunoreactive proteins were visualized by the enhanced chemiluminescence system (Amersham Biosciences). Immunoprecipitation Assays—Immunoprecipitation and Western blotting were performed as described previously (48Wang C. Pattabiraman N. Zhou J.N. Fu M. Sakamaki T. Albanese C. Li Z. Wu K. Hulit J. Neumeister P. Novikoff P.M. Brownlee M. Scherer P.E. Jones J.G. Whitney K.D. Donehower L.A. Harris E.L. Rohan T. Johns D.C. Pestell R.G. Mol. Cell. Biol. 2003; 23: 6159-6173Crossref PubMed Scopus (178) Google Scholar). HEK 293T cells were plated at a density of 2 × 106 cells in 10-cm plates in Dulbecco's modified Eagle's medium the day before transfection. Cells were transfected with expression vectors and control vector using Superfect reagent (Qiagen) and cultured for 24 h. The cell monolayer was washed twice with phosphate-buffered saline and the collected cells lysed for 30 min at 4 °C in lysis buffer (50 mm Tris, pH 8.0, 50 mm KCl, 10 mm EDTA, 1% Nonidet P-40) supplemented with HDAC inhibitors (10 mm nicotinamide and 1 μm TSA), protease inhibitors (Roche Applied Science) (47Neumeister P. Pixley F.J. Xiong Y. Xie H. Wu K. Ashton A. Cammer M. Chan A. Symons M. Stanley E.R. Pestell R.G. Mol. Biol. Cell. 2003; 14: 2005-2015Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar), and phosphatase inhibitors (20 mm NaF and 1 mm orthovanadate) (24Wang C. Fu M. Pestell R.G. Methods Mol. Biol. 2004; 241: 207-216PubMed Google Scholar). Lysates were cleared by centrifugation at 4 °C for 15 min. The protein concentration was measured by the Bio-Rad assay and the protein lysates diluted to 1 μg/μl in lysis buffer. Immunoprecipitation assays were then performed on 500–1,200 μg of total protein. Lysates were precleared by the addition of 30 μl of a 50% slurry of protein G-agarose beads/500 μg of protein, by rocking at 4 °C for 1 h. The supernatant was collected by centrifugation and immunoprecipitated with the anti-Gal4-DBD RK5C1 mouse monoclonal antibody (Santa Cruz; 2.5 μg of antibody/500 μg of protein) by rocking at 4 °C for 1 h. To the immunoprecipitate was added, per 500 μg of protein, 30 μl of a 50% slurry of protein G-agarose beads and incubated overnight at 4 °C with rocking. The beads were washed three times with buffer containing 50 mm Tris, pH 7.5, 5 mm EDTA, 150 mm NaCl, and 0.1% Tween 20. The immunoprecipitates were eluted by boiling for 5 min in SDS sample buffer (100 mm Tris-HCl, 10 mm dithiothreitol, 4% SDS) and subjected to SDS-PAGE analysis and Western blotting as described above. Deacetylation Assays of the p300 mCRD1 Peptide—Deacetylation assays were performed as described previously (39Vaziri H. Dessain S.K. Ng Eaton E. Imai S.I. Frye R.A. Pandita T.K. Guarente L. Weinberg R.A. Cell. 2001; 107: 149-159Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2316) Google Scholar) in 50 mm potassium phosphate, pH 6.6. Mouse SIR2α enzyme (mSIR2α) (Upstate Biotechnology) (2 μg) was added to a 100-μl reaction mixture containing 500 μm NAD and 50 μm p300 peptide with the sequence ERSTEL(AcK)TEI-(AcK)EEEDQPSTS (Bio-Synthesis, Texas). Reactions were incubated at 28 °C for 5 h. At 0, 1, 2, 3, and 5 h time points reactions were assayed for production of either ADPR (adenosine diphosphate ribose), AADPR (acetyladenosine diphosphate ribose) and nicotinamide by high pressure liquid chromatography (HPLC) or for peptide deacetylation by HPLC. For the production of ADPR, AADPR, and nicotinamide, the reaction mixture was separated on a Waters C-18 semipreparative column (4.2 × 300 mm) eluted (2.0 ml/min) with 50 mm ammonium acetate, pH 5.0. The order of elution is shown in Fig. 6A at 260 nm. For peptide HPLC, the chromatograms were obtained on a Vydac C-18 analytical column for peptide and nucleic acids, with a gradient elution (1.5 ml/min) of 15% acetonitrile, 0.1% trifluoroacetic acid, to 40% acetonitrile at 30 min. Detection of peptide products was obtained at 215 nm. The HPLC system used was a Waters 600 pump with a 717 autosampler (temperature-controlled) and a 2487 UV-visible detector. Peptide peaks were identified further by MS analysis. LC/MS/MS Analysis—The reaction solution was loaded onto a Vydac 1.0 × 50-mm C-8 column (The Separations Group, Hesperia, CA). A Hewlett-Packard 1100 H

Highlights•SIRT5 desuccinylates and activates PKM2•Lys311 is a key succinylated site in the regulation of PKM2 activity•Sirt5 blocks IL-1β production in LPS-activated macrophages by regulating PKM2•SIRT5 plays an important role in inhibiting inflammationSummaryLPS-activated macrophages undergo a metabolic shift from dependence on mitochondria-produced ATP to reliance on aerobic glycolysis, where PKM2 is a critical determinant. Here, we show that PKM2 is a physiological substrate of SIRT5 and that SIRT5-regulated hypersuccinylation inhibits the pyruvate kinase activity of PKM2 by promoting its tetramer-to-dimer transition. Moreover, a succinylation-mimetic PKM2 K311E mutation promotes nuclear accumulation and increases protein kinase activity. Furthermore, we show that SIRT5-dependent succinylation promotes PKM2 entry into nucleus, where a complex of PKM2-HIF1α is formed at the promoter of IL-1β gene in LPS-stimulated macrophages. Activation of PKM2 using TEPP-46 attenuates Sirt5-deficiency-mediated IL-1β upregulation in LPS-stimulated macrophages. Finally, we find that Sirt5-deficient mice are more susceptible to DSS-induced colitis, which is associated with Sirt5 deficiency prompted PKM2 hypersuccinylation and boosted IL-1β production. In conclusion, our findings reveal a mechanism by which SIRT5 suppresses the pro-inflammatory response in macrophages at least in part by regulating PKM2 succinylation, activity, and function.Graphical abstract

In appropriate prescribing is a global problem. It is especially salient in China, where drug sales constitute a major portion of health care providers' incomes, price distortions are rampant, and oversight is lax. However, few data exist on the prevalence of inappropriate prescribing in China. This study, the first of its kind in China, examined 230,800 prescriptions written between 2007 and 2009 by 784 community health institutions in 28 cities across China. The data show substantial overprescribing, including twice as many prescriptions for antibiotics as recommended by the World Health Organization and rates of injection that are three times higher than in similar countries. These findings point to the need to integrate rational prescribing into China's ongoing health care reform.