// Hideyuki Takahashi 1 , Koichi Sakakura 1 , Takeshi Kudo 1 , Minoru Toyoda 1 , Kyoichi Kaira 2 , Tetsunari Oyama 3 , Kazuaki Chikamatsu 1 1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, Gunma University Graduate School of Medicine, Gunma, Japan 2 Department of Oncology Clinical Development, Gunma University Graduate School of Medicine, Gunma, Japan 3 Department of Pathology, Gunma University Graduate School of Medicine, Gunma, Japan Correspondence to: Kazuaki Chikamatsu, email: tikamatu@gunma-u.ac.jp Keywords: cancer-associated fibroblast (CAF), tumor-associated macrophage (TAM), tumor microenvironment (TME), immunomodulation, immunosuppression Received: August 01, 2016     Accepted: December 07, 2016     Published: December 30, 2016 ABSTRACT Stromal cells in the tumor microenvironment (TME) closely interact with tumor cells and affect tumor cell behavior in diverse manners. We herein investigated the mechanisms by which cancer-associated fibroblasts (CAFs) affect the functional polarization of tumor-associated macrophages (TAMs) in oral squamous cell carcinoma (OSCC) in vitro and in human cancer samples. The expression of CD68, CD14, CD163, CD200R, CD206, HLA-G, CD80, and CD86 was higher in CD14-positive cells co-cultured with the culture supernatants of CAFs established from OSCC specimens (CAF-educated cells) than in control cells. The gene expression level of ARG1 , IL10 , and TGFB1 was increased in CAF-educated cells. CAF-educated cells suppressed T cell proliferation more strongly than control cells, and the neutralization of TGF-β IL-10, or arginase I significantly restored T cell proliferation. We then investigated the relationship between the infiltration of CAFs and TAMs using tissue samples obtained from patients with OSCC. The infiltration of CAFs was associated with the numbers of CD68-positive and CD163-positive macrophages. It also correlated with lymphatic invasion, vascular invasion, lymph node involvement, and the TNM stage. The infiltration of CAFs was identified as an independent prognostic factor in OSCC. Our results indicate that CAFs play important roles in shaping the tumor immunosuppressive microenvironment in OSCC by inducing the protumoral phenotype of TAMs. Therapeutic strategies to reverse CAF-mediated immunosuppression need to be considered.

Abstract Background Cancer utilizes immunosuppressive mechanisms to create a tumor microenvironment favorable for its progression. The purpose of this study is to histologically characterize the immunological properties of the tumor microenvironment of oral squamous cell carcinoma (OSCC) and identify key molecules involved in the immunological microenvironment and patient prognosis. Methods First, overlapping differentially expressed genes (DEGs) were screened from OSCC transcriptome data in public databases. Correlation analysis of DEGs with known immune‐related genes identified genes involved in the immune microenvironment of OSCC. Next, stromal patterns of tumor were classified and immunohistochemical staining was performed for immune cell markers (CD3, CD4, Foxp3, CD8, CD20, CD68, and CD163), programmed death‐ligand 1 (PD‐L1), and guanylate binding protein 5 (GBP5) in resected specimens obtained from 110 patients with OSCC who underwent resection. Correlations between each factor and their prognostic impact were analyzed. Results Among the novel OSCC‐specific immune‐related genes screened (including ADAMDEC1 , CXCL9 , CXCL13 , DPT , GBP5 , IDO1 , and PLA2G7 ), GBP5 was selected as the target gene. Histopathologic analysis showed that multiple T‐cell subsets and CD20‐positive cells were less common in the advanced stages, whereas CD163‐positive cells were more common in advanced stages. The immature type in the stromal pattern category was associated with less immune cell infiltration, lower expression of PD‐L1 in immune cells, lower expression of GBP5 in the stroma, and shorter overall survival and recurrence‐free survival. Expression of GBP5 in the tumor and stroma correlated with immune cell infiltration of tumors and PD‐L1 expression in tumor and immune cells. Patients with low tumor GBP5 expression and high stromal expression had significantly longer overall survival and recurrence‐free survival. Conclusions The stromal pattern category may reflect both invasive and immunomodulatory potentials of cancer‐associated fibroblasts in OSCC. GBP5 has been suggested as a potential biomarker to predict the prognosis and therapeutic efficacy of immune checkpoint inhibitors.

Background/Aim: Human papillomavirus (HPV)-positive head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is clinically and immunologically distinct from HPV-negative HNSCC. Herein, we investigated the presence of tumor antigens HPV E6/E7 and wild-type p53-specific T-cell responses, and the impact of immune checkpoint blockade in patients with HPV-positive HNSCC. Materials and Methods: Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from patients with HPV-positive HNSCC were stimulated with HPV E6/E7 or wild-type p53-derived peptide mixture and evaluated using the interferon-γ enzyme-linked immunosorbent spot assay. Flow cytometry was performed to analyze the proportion of T-cell subsets and T cells expressing immune checkpoint molecules. Results: HPV E6/E7-specific T cells were detected in 22 (95.7%) of 23 patients, whereas wild-type p53-specific T cells were detected in 3 (15.0%) of 20 patients. Seven (43.8%) of 16 patients exhibited wild-type p53-specific T-cell responses, as determined using whole proteins instead of peptides. Immune checkpoint blockade enhanced wild-type p53-specific T-cell responses in 9 (45.0%) of 20 patients. Flow cytometric analysis of PBMCs revealed that responders exhibiting enhanced wild-type p53-specific T-cell responses following immune checkpoint blockade had a significantly higher proportion of Ki-67+CD4+ T cells, Ki-67+CD8+ T cells, regulatory T cells, PD-1+CD4+ T cells, and TIM-3+CD4+ T cells than non-responders. Conclusion: Our findings indicate that tumor antigen-specific T cells are present in the peripheral blood of patients with HPV-positive HNSCC. Blockade of checkpoint pathways can enhance T-cell responses in certain patients, probably via activated T cells, Tregs, and/or exhausted CD4+ T cells.

Introduction: Immune checkpoint inhibitors provide new treatments for patients with recurrent or metastatic (R/M) head and neck cancers. Herein, we focused on systemic inflammatory markers in peripheral blood, including blood cell fractions, albumin, and C-reactive protein, and determined their association with nivolumab treatment response. We also examined the potential application of inflammatory markers as prognostic tools. Methods: We assessed pre-treatment systemic inflammatory markers in 61 patients with R/M head and neck cancer treated with nivolumab, determining their association with treatment response using Kaplan–Meier, multivariate, and regression analyses. Using flow cytometry, we investigated circulating T cell subsets in 36 patients with R/M head and neck cancer. Finally, we examined the correlation between each statistically analyzed parameter and peripheral circulating T cell activation. Results: Systemic inflammatory marker values were used to estimate overall survival time by performing multivariate analysis. Systemic inflammatory markers were assigned importance for each coefficient. Monocyte and lymphocyte counts strongly impacted overall survival. Indices dependent on white blood cell and monocyte counts, lymphocyte percentage, platelet count, albumin levels, and prognostic nutrition index were useful prognostic tools in the regression analysis. The simplest prognostic index was defined as white blood cells (103/μL) +2×lymphocyte percentage (%) +12×number of monocytes (103/μL)+27×serum albumin. A high index that was significantly associated with a better prognosis negatively correlated with CD38/CD8 and ki67/CD8 percentages. Conclusions: According to the findings of the present study, systemic inflammatory markers may help predict the prognosis, activation, and exhaustion of circulating T cells. In patients with R/M head and neck cancer treated with nivolumab, systemic inflammatory markers could provide new insights into rational strategies in cancer immunotherapy for R/M head and neck cancer.