A rapid, sensitive and automated assay procedure was developed for the in vitro evaluation of anti-HIV agents. An HTLV-I transformed T4-cell line, MT-4, which was previously shown by Koyanagi et al. (1985) to be highly susceptible to, and permissive for, HIV infection, served as the target cell line. Inhibition of the HIV-induced cytopathic effect was used as the end point. The viability of both HIV-and mock-infected cells was assessed spectrophotometrically via the in situ reduction of 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT). The procedure was optimized as to make optimal use of multichannel pipettes, microprocessor-controlled dispensing and optical density reading. The absorbance ratio of the mock-infected control to the HIV-infected samples was about 20. This allowed an accurate determination of the 50% effective doses, as demonstrated for 3'-azido-2',3'-dideoxythymidine (AZT), 2',3'-dideoxycytidine (ddCyd), dextran sulfate and heparin. The technique significantly reduced labor time as compared to the trypan blue exclusion method, and permits the evaluation of large numbers of compounds for their anti-HIV activity.

We have used the quantitative binding of murine monoclonal antibodies to the surface of cultured human umbilical vein endothelial (HUVE) cells to study the responses of HUVE cells to three different immune mediators: interleukin 1 (IL 1), tumor necrosis factor (TNF), and immune interferon (IFN-gamma). Antibody H4/18, reactive with an endothelial cell-specific activation antigen, does not bind to unstimulated HUVE cells but shows rapidly and transiently inducible binding (peak 4 to 6 hr) to cells stimulated by IL 1 or TNF that declines to basal levels by 24 hr, even in the continued presence of mediator. Binding of H4/18 is unaffected by IFN-gamma. Antibody RR1/1, reactive with intercellular adhesion molecule 1, binds to unstimulated HUVE cells, but binding is rapidly increased (plateau 24 hr) after stimulation by IL 1 or TNF and slowly increased (over several days) by IFN-gamma. In contrast to H4/18 binding, the increase in RR1/1 binding is sustained in the continued presence of mediator. Antibody W6/32, reactive with HLA-A,B antigens, binds to unstimulated HUVE cells and shows gradually progressive increases (over several days) in binding upon treatment with IFN-gamma or TNF. These observations demonstrate that HUVE cells show distinct but overlapping patterns of antigenic modulation in response to three different lymphokines, and suggest that the "activation" of endothelial cells observed in situ may represent a complex integration of several lymphokine-mediated signals.

The cytokine interleukin-10 (IL-10) has shown promise in clinical trials for treatment of inflammatory bowel disease (IBD). Using two mouse models, we show that the therapeutic dose of IL-10 can be reduced by localized delivery of a bacterium genetically engineered to secrete the cytokine. Intragastric administration of IL-10–secreting Lactococcus lactis caused a 50% reduction in colitis in mice treated with dextran sulfate sodium and prevented the onset of colitis in IL-10 −/− mice. This approach may lead to better methods for cost-effective and long-term management of IBD in humans.

Structural mitochondrial damage accompanies the cytotoxic effects of several drugs including tumor necrosis factor (TNF).Using various inhibitors of mitochondrial electron transport we have investigated the mechanism of TNF-mediated cytotoxicity in L929 and WEHI 164 clone 13 mouse fibrosarcoma cells.Inhibitors with different sites of action modulated TNF cytotoxicity, however, with contrasting effects on final cell viability.Inhibition of mitochondrial electron transport at complex I11 (cytochrome c reductase) by antimycin A resulted in a marked potentiation of TNFmediated injury.In contrast, when the electron flow to ubiquinone was blocked, either at complex I (NADHubiquinone oxidoreductase) with amytal or at complex I1 (succinate-ubiquinone reductase) with thenoyltrifluoroacetone, cells were markedly protected against TNF cytotoxicity.Neither uncouplers nor inhibitors of oxidative phosphorylation nor complex IV (cytochrome c oxidase) inhibitors significantly interfered with TNF-mediated effects, ruling out the involvement of energy-coupled phenomena.In addition, the toxic effects of TNF were counteracted by the addition of antioxidants and iron chelators.Furthermore, we analyzed the direct effect of TNF on mitochondrial morphology and functions.Treatment of L929 cells with TNF led to an early degeneration of the mitochondrial ultrastructure without any pronounced damage of other cellular organelles.Analysis of the mitochondrial electron flow revealed that TNF treatment led to a rapid inhibition of the mitochondria to oxidize succinate and NADH-linked substrates.The inhibition of electron transport was dose-dependent and became readily detectable 60 min after the start of TNF treatment, thus preceding the onset of cell death by at least 3-6 h.In contrast, only minor effects were observed on complex IV activity.The different effects observed with the mitochondrial respiratory chain inhibitors provide suggestive

Murine L929 fibrosarcoma cells treated with tumor necrosis factor (TNF) rapidly die in a necrotic way, due to excessive formation of reactive oxygen intermediates. We investigated the role of caspases in the necrotic cell death pathway. When the cytokine response modifier A (CrmA), a serpin-like caspase inhibitor of viral origin, was stably overexpressed in L929 cells, the latter became 1,000-fold more sensitive to TNF-mediated cell death. In addition, TNF sensitization was also observed when the cells were pretreated with Ac-YVAD-cmk or zDEVD-fmk, which inhibits caspase-1– and caspase-3–like proteases, respectively. zVAD-fmk and zD-fmk, two broad-spectrum inhibitors of caspases, also rendered the cells more sensitive, since the half-maximal dose for TNF-mediated necrosis decreased by a factor of 1,000. The presence of zVAD-fmk also resulted in a more rapid increase of TNF-mediated production of oxygen radicals. zVAD-fmk–dependent sensitization of TNF cytotoxicity could be completely inhibited by the oxygen radical scavenger butylated hydroxyanisole. These results indicate an involvement of caspases in protection against TNF-induced formation of oxygen radicals and necrosis.

Because of its ability to efficiently inhibit in vitro cytokine production by activated macrophages, we hypothesized that interleukin (IL) 10 might be of particular interest in preventing endotoxin-induced toxicity. We therefore examined the effects of IL-10 administration before lipopolysaccharide (LPS) challenge in mice. A marked reduction in the amounts of LPS-induced tumor necrosis factor (TNF) release in the circulation was observed after IL-10 pretreatment at doses at low as 10 U. IL-10 also efficiently prevented the hypothermia generated by the injection of 100 micrograms LPS. Finally, pretreatment with a single injection of 1,000 U IL-10 completely prevented the mortality consecutive to the challenge with 500 micrograms LPS, a dose that was lethal in 50% of the control mice. We conclude that IL-10 inhibits in vivo TNF secretion and protects against the lethality of endotoxin in a murine model of septic shock.