The evolution of marine microbes over billions of years predicts that the composition of microbial communities should be much greater than the published estimates of a few thousand distinct kinds of microbes per liter of seawater. By adopting a massively parallel tag sequencing strategy, we show that bacterial communities of deep water masses of the North Atlantic and diffuse flow hydrothermal vents are one to two orders of magnitude more complex than previously reported for any microbial environment. A relatively small number of different populations dominate all samples, but thousands of low-abundance populations account for most of the observed phylogenetic diversity. This "rare biosphere" is very ancient and may represent a nearly inexhaustible source of genomic innovation. Members of the rare biosphere are highly divergent from each other and, at different times in earth's history, may have had a profound impact on shaping planetary processes.

Deep sequencing of PCR amplicon libraries facilitates the detection of low-abundance populations in environmental DNA surveys of complex microbial communities. At the same time, deep sequencing can lead to overestimates of microbial diversity through the generation of low-frequency, error-prone reads. Even with sequencing error rates below 0.005 per nucleotide position, the common method of generating operational taxonomic units (OTUs) by multiple sequence alignment and complete-linkage clustering significantly increases the number of predicted OTUs and inflates richness estimates. We show that a 2% single-linkage preclustering methodology followed by an average-linkage clustering based on pairwise alignments more accurately predicts expected OTUs in both single and pooled template preparations of known taxonomic composition. This new clustering method can reduce the OTU richness in environmental samples by as much as 30-60% but does not reduce the fraction of OTUs in long-tailed rank abundance curves that defines the rare biosphere.

Massively parallel pyrosequencing systems have increased the efficiency of DNA sequencing, although the published per-base accuracy of a Roche GS20 is only 96%. In genome projects, highly redundant consensus assemblies can compensate for sequencing errors. In contrast, studies of microbial diversity that catalogue differences between PCR amplicons of ribosomal RNA genes (rDNA) or other conserved gene families cannot take advantage of consensus assemblies to detect and minimize incorrect base calls. We performed an empirical study of the per-base error rate for the Roche GS20 system using sequences of the V6 hypervariable region from cloned microbial ribosomal DNA (tag sequencing). We calculated a 99.5% accuracy rate in unassembled sequences, and identified several factors that can be used to remove a small percentage of low-quality reads, improving the accuracy to 99.75% or better. By using objective criteria to eliminate low quality data, the quality of individual GS20 sequence reads in molecular ecological applications can surpass the accuracy of traditional capillary methods.

Massively parallel pyrosequencing of hypervariable regions from small subunit ribosomal RNA (SSU rRNA) genes can sample a microbial community two or three orders of magnitude more deeply per dollar and per hour than capillary sequencing of full-length SSU rRNA. As with full-length rRNA surveys, each sequence read is a tag surrogate for a single microbe. However, rather than assigning taxonomy by creating gene trees de novo that include all experimental sequences and certain reference taxa, we compare the hypervariable region tags to an extensive database of rRNA sequences and assign taxonomy based on the best match in a Global Alignment for Sequence Taxonomy (GAST) process. The resulting taxonomic census provides information on both composition and diversity of the microbial community. To determine the effectiveness of using only hypervariable region tags for assessing microbial community membership, we compared the taxonomy assigned to the V3 and V6 hypervariable regions with the taxonomy assigned to full-length SSU rRNA sequences isolated from both the human gut and a deep-sea hydrothermal vent. The hypervariable region tags and full-length rRNA sequences provided equivalent taxonomy and measures of relative abundance of microbial communities, even for tags up to 15% divergent from their nearest reference match. The greater sampling depth per dollar afforded by massively parallel pyrosequencing reveals many more members of the "rare biosphere" than does capillary sequencing of the full-length gene. In addition, tag sequencing eliminates cloning bias and the sequences are short enough to be completely sequenced in a single read, maximizing the number of organisms sampled in a run while minimizing chimera formation. This technique allows the cost-effective exploration of changes in microbial community structure, including the rare biosphere, over space and time and can be applied immediately to initiatives, such as the Human Microbiome Project.

The analytical power of environmental DNA sequences for modeling microbial ecosystems depends on accurate assessments of population structure, including diversity (richness) and relative abundance (evenness). We investigated both aspects of population structure for microbial communities at two neighboring hydrothermal vents by examining the sequences of more than 900,000 microbial small-subunit ribosomal RNA amplicons. The two vent communities have different population structures that reflect local geochemical regimes. Descriptions of archaeal diversity were nearly exhaustive, but despite collecting an unparalleled number of sequences, statistical analyses indicated additional bacterial diversity at every taxonomic level. We predict that hundreds of thousands of sequences will be necessary to capture the vast diversity of microbial communities, and that different patterns of evenness for both high- and low-abundance taxa may be important in defining microbial ecosystem dynamics.

The Class Bdelloidea of the Phylum Rotifera is the largest metazoan taxon in which males, hermaphrodites, and meiosis are unknown. We conducted a molecular genetic test of this indication that bdelloid rotifers may have evolved without sexual reproduction or genetic exchange. The test is based on the expectation that after millions of years without these processes, genomes will no longer contain pairs of closely similar haplotypes and instead will contain highly divergent descendants of formerly allelic nucleotide sequences. We find that genomes of individual bdelloid rotifers, representing four different species, appear to lack pairs of closely similar sequences and contain representatives of two ancient lineages that began to diverge before the bdelloid radiation many millions of years ago when sexual reproduction and genetic exchange may have ceased.

Marine microbial communities have been essential contributors to global biomass, nutrient cycling, and biodiversity since the early history of Earth, but so far their community distribution patterns remain unknown in most marine ecosystems.The synthesis of 9.6 million bacterial V6-rRNA amplicons for 509 samples that span the global ocean's surface to the deep-sea floor shows that pelagic and benthic communities greatly differ, at all taxonomic levels, and share <10% bacterial types defined at 3% sequence similarity level. Surface and deep water, coastal and open ocean, and anoxic and oxic ecosystems host distinct communities that reflect productivity, land influences and other environmental constraints such as oxygen availability. The high variability of bacterial community composition specific to vent and coastal ecosystems reflects the heterogeneity and dynamic nature of these habitats. Both pelagic and benthic bacterial community distributions correlate with surface water productivity, reflecting the coupling between both realms by particle export. Also, differences in physical mixing may play a fundamental role in the distribution patterns of marine bacteria, as benthic communities showed a higher dissimilarity with increasing distance than pelagic communities.This first synthesis of global bacterial distribution across different ecosystems of the World's oceans shows remarkable horizontal and vertical large-scale patterns in bacterial communities. This opens interesting perspectives for the definition of biogeographical biomes for bacteria of ocean waters and the seabed.

The genome of the asexual rotifer Adineta vaga lacks homologous chromosomes; instead, its allelic regions are rearranged and sometimes found on the same chromosome in a palindromic fashion, a structure reminiscent of the primate Y chromosome and of other mitotic lineages such as cancer cells. Bdelloid rotifers are thought to have persisted and diversified asexually for millions of years, which is odd because loss of sexual reproduction is widely considered to be an evolutionary dead end for metazoans. The suspicion remained that they might engage in sex on rare occasions. But here Olivier Jaillon and colleagues sequence the genome of a bdelloid rotifer, Adineta vaga, and show that its structure is incompatible with conventional meiosis, the type of cell division associated with sexual reproduction. The genome has undergone abundant gene conversion, which may limit the accumulation of deleterious mutations in the absence of meiosis. Up to 8% of the genes are of probable non-metazoan origin, probably acquired through horizontal gene transfer. These findings demonstrate positive evidence for asexual evolution, supporting the hypothesis of ancient asexuality among bdelloid rotifers. Loss of sexual reproduction is considered an evolutionary dead end for metazoans, but bdelloid rotifers challenge this view as they appear to have persisted asexually for millions of years1. Neither male sex organs nor meiosis have ever been observed in these microscopic animals: oocytes are formed through mitotic divisions, with no reduction of chromosome number and no indication of chromosome pairing2. However, current evidence does not exclude that they may engage in sex on rare, cryptic occasions. Here we report the genome of a bdelloid rotifer, Adineta vaga (Davis, 1873)3, and show that its structure is incompatible with conventional meiosis. At gene scale, the genome of A. vaga is tetraploid and comprises both anciently duplicated segments and less divergent allelic regions. However, in contrast to sexual species, the allelic regions are rearranged and sometimes even found on the same chromosome. Such structure does not allow meiotic pairing; instead, we find abundant evidence of gene conversion, which may limit the accumulation of deleterious mutations in the absence of meiosis. Gene families involved in resistance to oxidation, carbohydrate metabolism and defence against transposons are significantly expanded, which may explain why transposable elements cover only 3% of the assembled sequence. Furthermore, 8% of the genes are likely to be of non-metazoan origin and were probably acquired horizontally. This apparent convergence between bdelloids and prokaryotes sheds new light on the evolutionary significance of sex.

The advent of next-generation DNA sequencing platforms has revolutionized molecular microbial ecology by making the detailed analysis of complex communities over time and space a tractable research pursuit for small research groups. However, the ability to generate 105–108 reads with relative ease brings with it many downstream complications. Beyond the computational resources and skills needed to process and analyze data, it is difficult to compare datasets in an intuitive and interactive manner that leads to hypothesis generation and testing. We developed the free web service VAMPS (Visualization and Analysis of Microbial Population Structures, http://vamps.mbl.edu ) to address these challenges and to facilitate research by individuals or collaborating groups working on projects with large-scale sequencing data. Users can upload marker gene sequences and associated metadata; reads are quality filtered and assigned to both taxonomic structures and to taxonomy-independent clusters. A simple point-and-click interface allows users to select for analysis any combination of their own or their collaborators' private data and data from public projects, filter these by their choice of taxonomic and/or abundance criteria, and then explore these data using a wide range of analytic methods and visualizations. Each result is extensively hyperlinked to other analysis and visualization options, promoting data exploration and leading to a greater understanding of data relationships. VAMPS allows researchers using marker gene sequence data to analyze the diversity of microbial communities and the relationships between communities, to explore these analyses in an intuitive visual context, and to download data, results, and images for publication. VAMPS obviates the need for individual research groups to make the considerable investment in computational infrastructure and bioinformatic support otherwise necessary to process, analyze, and interpret massive amounts of next-generation sequence data. Any web-capable device can be used to upload, process, explore, and extract data and results from VAMPS. VAMPS encourages researchers to share sequence and metadata, and fosters collaboration between researchers of disparate biomes who recognize common patterns in shared data.