Small extracellular vesicles (SEV) have attracted much attention both as mediators of intercellular communication and as drug delivery systems. In addition, recent studies have shown that SEV containing virus components and virus particles are released from virus-infected cells. Oncolytic viruses, which efficiently kill tumor cells by tumor cell-specific replication, have been actively studied as novel anticancer agents in clinical and preclinical studies. However, it remains to be fully elucidated whether SEV released from oncolytic virus-infected cells are involved in the antitumor effects of oncolytic viruses. In this study, we examined the tumor cell killing efficiencies and innate immune responses following treatment with SEV released from oncolytic reovirus-infected tumor cells in vitro and in vivo. Reovirus-infected B16 cells secreted SEV associated with or containing reovirus particles (Reo-SEV) with a diameter of approximately 130 nm and a zeta potential of -17 mV, although death of reovirus-infected B16 cells was not observed. The secreted Reo-SEV also contained interferon (IFN)-β, tumor antigens, and damage-associated molecular patterns (DAMPs), including heat shock proteins (HSPs). Reo-SEV were secreted from the tumor tissues of reovirus-injected mice. Inhibition of the SEV secretion pathway using GW4869, which is a neutral sphingomyelinase inhibitor, resulted in significant reduction in the infectious titers of reovirus in the culture supernatants, suggesting that the cells released progeny virus via the SEV secretion pathway. Reo-SEV more efficiently killed mouse tumor cells and induced innate immune responses in mouse bone marrow-derived dendritic cells than reovirus. Reovirus and Reo-SEV mediated efficient and comparable levels of growth suppression of B16 subcutaneous tumors and induction of tumor infiltration of CD8+ T cells following intravenous administration. These results indicate that Reo-SEV are a promising oncolytic agent and that SEV are an effective delivery vehicle for oncolytic virus.

We propose a nucleic acids dilution-induced assembly (NADIA) method for the preparation of lipid nanoparticles. In the conventional method, water-soluble polymers such as nucleic acids and proteins are mixed in the aqueous phase. In contrast, the NADIA method, in which self-assembly is triggered upon dilution, requires dispersion in an alcohol phase without precipitation. We then investigated several alcohols and discovered that propylene glycol combined with sodium chloride enabled the dispersion of plasmid DNA and protamine sulfate in the alcohol phase. The streamlined characteristics of the NADIA method enable the preparation of extracellular vesicles-mimicking lipid nanoparticles (ELNPs). Among the mixing methods using a micropipette, a syringe pump, and a microfluidic device, the lattermost was the best for decreasing batch-to-batch differences in size, polydispersity index, and transfection efficiency in HepG2 cells. Although ELNPs possessed negative ζ-potentials and did not have surface antigens, their transfection efficiency was comparable to that of cationic lipoplexes. We observed that lipid raft-mediated endocytosis and macropinocytosis contributed to the transfection of ELNPs. Our strategy may overcome the hurdles linked to supply and quality owing to the low abundance and heterogeneity in cell-based extracellular vesicles production, making it a reliable and scalable method for the pharmaceutical manufacture of such complex formulations.

A powder formulation for mucosal administration of mRNA-encapsulated lipid nanoparticles (mRNA-LNPs) is expected to be useful for respiratory diseases. Although freeze-drying is widely used to obtain solid formulations of mRNA-LNPs, highly hydrosoluble cryoprotectants, such as sucrose are necessary. However, sucrose is not a suitable excipient for inhalation powders because of its hygroscopic and deliquescence properties. Spray freeze-drying (SFD) is a method to produce inhalable powder formulation. In this study, we prepared inhalable powder formulations of mRNA-LNPs without deliquescence excipients using pH-modified SFD, which strengthens the interaction between mRNA and ionizable lipids of LNPs by acidic pH modifier, leading to retention of the encapsulated structure of mRNA-LNPs even after SFD. Powdered mRNA-LNPs were suitable for inhalation, and mRNA was encapsulated in LNPs after SFD. The mRNA encapsulation efficiency and mRNA transfection efficiency of pH-modified SFD-mediated powdered mRNA-LNPs were higher than those of conventional SFD, although they were significantly lower than those of liquid intact mRNA-LNPs. However, after long-term storage, the powdered formulation of the mRNA-LNPs exhibited higher mRNA transfection efficiency than liquid mRNA-LNP. Powdered mRNA-LNPs also exerted their function in air-liquid interface cultivation and in vivo intratracheal administration. Collectively, the powder formulation of mRNA-LNPs especially prepared by SFD is expected to be applied for dry powder inhalers.

Abstract Nucleic acid therapeutics hold promise for cancer treatment but have yet to be effectively applied to malignant glioma due to challenges in stability and delivery. We explored the intracerebral delivery of lipid nanoparticles (LNPs) encapsulating siRNA as a drug delivery carrier. Our goal was to develop an siRNA therapy selectively targeting malignant glioma cells by combining LNPs with Fc-domain-binding peptide lipids (FcBPs), a modification system that allows antibody orientation control. Intracerebral Delivery of mRNA-Encapsulated Lipid Nanoparticles: We aimed to deliver mRNA-encapsulated LNPs to the brain using focused ultrasound (FUS) and microbubbles (MB). Following the administration of microbubbles and mRNA-encapsulated LNPs in normal mice, FUS irradiation was performed on the brain. The introduction of firefly luciferase mRNA resulted in gene expression that was 20 times higher in the FUS-irradiated brain compared to the non-irradiated side. Gene expression was observed in vascular endothelial cells throughout the brain and in parenchymal cells outside the brain blood vessels at the FUS-irradiated site. Development of siRNA Medicines: We prepared FcBP-modified siRNA-LNPs targeting integrin αvβ3, highly expressed in malignant gliomas, using siRNA-Luc2. The modifications with FcBP or anti-integrin αvβ3 antibody did not alter the physicochemical properties or polydispersity index (PDI). In vitro, anti-integrin αvβ3-FcBP-modified siRNA-LNPs inhibited the binding of integrin to U87-MG-Luc2 cells, demonstrating high binding affinity and knockdown effects via αvβ3.Discussion:Our findings suggest that the delivery of mRNA-encapsulated LNPs into the brain is feasible using FUS and MB. Additionally, we successfully developed siRNA-LNPs modified with anti-integrin αvβ3 antibody FcBP. Future work will evaluate the cell binding and antitumor effects of siRNA-VEGF encapsulated in these LNPs, aiming to develop new treatments for malignant glioma by enhancing blood-brain barrier penetration and targeting malignant glioma.