We investigated the frequency and function of mutations and increased copy number of the PIK3CA gene in lung cancers. PIK3CA mutations are one of the most common gene changes present in human cancers. We analyzed the mutational status of exons 9 and 20 and gene copy number of PIK3CA using 86 non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines, 43 small cell lung cancer (SCLC) cell lines, 3 extrapulmonary small cell cancer (ExPuSC) cell lines, and 691 resected NSCLC tumors and studied the relationship between PIK3CA alterations and mutational status of epidermal growth factor receptor (EGFR) signaling pathway genes (EGFR, KRAS, HER2, and BRAF). We also determined PIK3CA expression and activity and correlated the findings with effects on cell growth. We identified mutations in 4.7% of NSCLC cell lines and 1.6% of tumors of all major histologic types. Mutations in cell lines of small cell origin were limited to two ExPuSC cell lines. PIK3CA copy number gains were more frequent in squamous cell carcinoma (33.1%) than in adenocarcinoma (6.2%) or SCLC lines (4.7%). Mutational status of PIK3CA was not mutually exclusive to EGFR or KRAS. PIK3CA alterations were associated with increased phosphatidylinositol 3-kinase activity and phosphorylated Akt expression. RNA interference-mediated knockdown of PIK3CA inhibited colony formation of cell lines with PIK3CA mutations or gains but was not effective in PIK3CA wild-type cells. PIK3CA mutations or gains are present in a subset of lung cancers and are of functional importance.

Corneal endothelial cell (CEC) disorders, such as Fuchs's endothelial corneal dystrophy, induce abnormal corneal hydration and result in corneal haziness and vision loss known as bullous keratopathy. We investigated whether injection of cultured human CECs supplemented with a rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor into the anterior chamber could increase CEC density.We performed an uncontrolled, single-group study involving 11 persons who had received a diagnosis of bullous keratopathy and had no detectable CECs. Human CECs were cultured from a donor cornea; a total of 1×106 passaged cells were supplemented with a ROCK inhibitor (final volume, 300 μl) and injected into the anterior chamber of the eye that was selected for treatment. After the procedure, patients were placed in a prone position for 3 hours. The primary outcome was restoration of corneal transparency, with a CEC density of more than 500 cells per square millimeter at the central cornea at 24 weeks after cell injection. Secondary outcomes were a corneal thickness of less than 630 μm and an improvement in best corrected visual acuity equivalent to two lines or more on a Landolt C eye chart at 24 weeks after cell injection.At 24 weeks after cell injection, we recorded a CEC density of more than 500 cells per square millimeter (range, 947 to 2833) in 11 of the 11 treated eyes (100%; 95% confidence interval [CI], 72 to 100), of which 10 had a CEC density exceeding 1000 cells per square millimeter. A corneal thickness of less than 630 μm (range, 489 to 640) was attained in 10 of the 11 treated eyes (91%; 95% CI, 59 to 100), and an improvement in best corrected visual acuity of two lines or more was recorded in 9 of the 11 treated eyes (82%; 95% CI, 48 to 98).Injection of human CECs supplemented with a ROCK inhibitor was followed by an increase in CEC density after 24 weeks in 11 persons with bullous keratopathy. (Funded by the Japan Agency for Medical Research and Development and others; UMIN number, UMIN000012534 .).

purpose. The transplantation of cultivated corneal endothelial cells (CECs) has gained attention recently for the treatment of patients with corneal endothelial dysfunction. However, an efficient culturing technique for human (H)CECs has yet to be properly established. The present study was conducted to investigate the applicability of the Rho kinase (ROCK) inhibitor Y-27632 in promoting cultivation of cynomolgus monkey (M)CECs. methods. MCECs of cynomolgus monkeys were cultured in a medium containing 10 μM Y-27632. The number of viable cells adherent to culture plates were monitored by a luminescent cell-viability assay and colony growth was detected by toluidine blue staining. Proliferating cells were detected by Ki67 expression using flow cytometry and a BrdU-labeling assay for immunocytochemistry. Annexin V-positive apoptotic cells were analyzed by flow cytometry. results. The number of viable cultivated MCECs was enhanced by Y-27632 addition after 24 hours in culture. The colony area of the culture in the presence of Y-27632 was higher than in the absence of Y-27632 on day 10. In Y-27632-treated cultures, the number of Ki67-positive cells was significantly increased at 24 and 48 hours, and the number of proliferating BrdU-positive cells was increased at 48 hours. The number of Annexin V-positive apoptotic cells was decreased at 24 hours. conclusions. The inhibition of Rho/ROCK signaling by specific ROCK inhibitor Y-27632 promoted the adhesion of MCECs, inhibited apoptosis, and increased the number of proliferating cells. These results suggest that the ROCK inhibitor may serve as a new tool for cultivating HCECs for transplantation.

Background: Body fat percentage (BF%) determined by bioelectrical impedance analysis is widely used at home and in medical check-ups. However, the clinical significance of measuring BF% has not been studied in detail. Methods and Results: A cross-sectional study was carried out on a cohort of 10,774 middle-aged Japanese men who had undergone an annual check-up in 2008. Cut-off points were evaluated for body mass index (BMI), waist circumference (WC), and BF% for detecting participants with cardiovascular disease (CVD) risk factors (diabetes mellitus, hypertension, dyslipidemia), and effectiveness compared for each marker's cut-off point. Additionally, the effects of smoking on cut-off points were evaluated. The cut-off points of BMI, WC, and BF% for detecting participants with 1 or more CVD risk factors were 22.7kg/m2, 81.4cm, and 20.3%, respectively. The cut-off points of BF% for 1 or more CVD risk factors classified 3.43% more subjects into correct categories than those of BMI (P<0.001). The cut-off points of BMI, WC, and BF% for detecting individuals with 3 CVD risk factors in current smokers were 24.9kg/m2, 87.8cm, and 23.7%, while those in non-smokers were 23.3kg/m2, 83.9cm, and 22.3%, respectively. Conclusions: BF% could be more effective in detecting individuals with early stage CVD risk accumulation than BMI. The cut-off points for current smokers were lower than those for non-smokers in all markers. (Circ J 2012; 76: 2435–2442)

To evaluate the effect of Rho kinase (ROCK)-inhibitor eye drops on a corneal endothelial dysfunction primate model and human clinical case series of corneal endothelial dysfunction.As a corneal-endothelial partially injured model, the corneal endothelium of seven cynomolgus monkeys was damaged by transcorneal freezing; 10 mm of rock inhibitor Y-27632 was then applied topically 6 times daily. The phenotype of the reconstructed corneal endothelium was evaluated by immunohistochemical analysis and noncontact specular microscopy. For clinical study, the effect of Y-27632 eye drops after transcorneal freezing was evaluated in eight corneal endothelial dysfunction patients: four central corneal edema patients and four diffuse corneal edema patients.Slit-lamp microscopy revealed that both Y-27632-treated and -nontreated corneas became hazy after transcorneal freezing, and then recovered their transparency within 4 weeks. ROCK inhibitor Y-27632 promoted recovery of corneal endothelial cell density and wound healing in terms of both morphology and function. The percentage of ZO-1 and Na(+)/K(+)-ATPase positive cells in the regenerated area in the Y-27632 group was significantly higher than in the controls. Noncontact specular microscopy revealed that corneal endothelial cell density was significantly higher in the Y-27632 group compared with the controls at 4 weeks; cell density reached approximately 3000 cells/mm(2), as opposed to 1500 cells/mm(2) in the control group. In addition to the animal study findings, the clinical study findings showed that Y-27632 eye drops effectively improved corneal edema of corneal endothelial dysfunction patients with central edema.These findings show that rock inhibitor Y-27632 eye drops promote corneal endothelial wound healing in a primate animal model and suggest the possibility of Y-27632 as a novel therapeutic modality for certain forms of corneal endothelial dysfunction. (http://www.umin.ac.jp/ctr/ number, UMIN000003625.).

Endothelial dysfunction is important in the pathology of pulmonary hypertension, and circulating endothelial progenitor cells (EPCs) have been studied to evaluate endothelial dysfunction. In patients with chronic thromboembolic pulmonary hypertension (CTEPH), riociguat reportedly increases the number of circulating EPCs. However, the relationship between EPC numbers at baseline and changes in clinical parameters after riociguat administration has not been fully elucidated. Here, we evaluated 27 treatment-naïve patients with CTEPH and analyzed the relationships between EPC number at diagnosis and clinical variables (age, hemodynamics, atrial blood gas parameters, brain natriuretic peptide, and exercise tolerance) before and after riociguat initiation. EPCs were defined as CD45

The compound 15-deacetylcalonectrin (15-deCAL) is a common pathway intermediate in the biosynthesis of Fusarium trichothecenes. This tricyclic intermediate is metabolized to calonectrin (CAL) by trichothecene 15-O-acetyltransferase encoded by Tri3. Unlike other trichothecene pathway Tri gene mutants, the Δtri3 mutant produces lower amounts of the knocked-out enzyme’s substrate 15-deCAL, and instead, accumulates higher quantities of earlier bicyclic intermediate and shunt metabolites. Furthermore, evolutionary studies suggest that Tri3 may play a role in shaping the chemotypes of trichothecene-producing Fusarium strains. To better understand the functional role of Tri3p in biosynthesis and evolution, we aimed to develop a method to produce 15-deCAL by using transgenic Fusarium graminearum strains derived from a trichothecene overproducer. Unfortunately, introducing mutant Tri3, encoding a catalytically impaired but structurally intact acetylase, did not improve the low 15-deCAL production level of the ΔFgtri3 deletion strain, and the bicyclic products continued to accumulate as the major metabolites of the active-site mutant. These findings are discussed in light of the enzyme responsible for 15-deCAL production in trichothecene biosynthesis machinery. To efficiently produce 15-deCAL, we tested an alternative strategy of using a CAL-overproducing transformant. By feeding a crude CAL extract to a Fusarium commune strain that was isolated in this study and capable of specifically deacetylating C-15 acetyl, 15-deCAL was efficiently recovered. The substrate produced in this manner can be used for kinetic investigations of this enzyme and its possible role in chemotype diversification.

Purpose: Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) displays a higher incidence in females than in males, yet the underlying mechanism remains unclear. This study aimed to elucidate sex-dependent differential gene expressions in corneal endothelial cells (CECs) from healthy non-FECD individuals and from patients with FECD. Methods: RNA-Seq data from CECs of non-FECD subjects (3 males, 4 females) and FECD subjects (5 males, 5 females) were analyzed to identify differentially expressed genes (DEGs) between the sexes. We used heatmaps and principal component analysis for expression pattern visualization and Gene Ontology analysis for functional categorization of DEGs. Results: Among the non-FECD subjects, we identified 341 DEGs—143 upregulated and 198 downregulated—in females relative to males. For FECD subjects, 309 DEGs were discovered, with 215 upregulated and 94 downregulated in females compared with males. Heatmaps exhibited hierarchical clustering by sex, whereas principal component analysis delineated distinct male and female clusters in both non-FECD and FECD cohorts. Gene Ontology enrichment analysis linked the upregulated genes in non-FECD females to steroid hormone response, and downregulated ones to cyclin-dependent protein kinase activity. In females with FECD, upregulated genes were associated with immune responses and downregulated genes with peptide hormone binding. Conclusions: To our knowledge, these findings are the first to reveal distinct gene expression patterns in CECs between sexes. The observed variations suggest a potential genetic basis for the observed sex disparity in FECD prevalence. Further investigation is warranted to explore these associations and their implications for the pathogenesis of FECD.

This study evaluated the dysregulation of TCF4 isoforms and differential exon usage (DEU) in corneal endothelial cells (CECs) of Fuchs endothelial corneal dystrophy (FECD) with or without trinucleotide repeat (TNR) expansion in the intron region of the TCF4 gene.